Name: a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

Vi takker Veronica Schreiter for hennes utmerket kundestøtte og nyttig modifikasjoner av etablerte kryonisk bevaring teknikk og celle kultur modellen. I tillegg gjerne vi takke Maren Anders og Swanhild Rodewald for deres utmerket kundestøtte i den påfølgende analysen.

Merk: Bovine eggstokkene ble innhentet fra slaktehus kommersielle. Samlingen av abattoir biprodukter krever ikke en etisk godkjenning etter den tyske loven.
1. arbeider forhold og preparater
<ol><li>For å garantere sterilitet, alle medier og vev forberedelse samt alle kultur fungerer i et spesialisert celle kultur laboratorium ved hjelp av en laminær strømning benk.</li>
	<li>Forberede 1 x fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7.4) med 100 IU penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin og 0,5 µg/µL amfotericin for transport av eggstokkene. Merk: Maksimal varigheten mellom mottak eggstokkene og isolere GC er 2t i dette oppsettet.</li>
</ol>2. isolering av bovin Granulosa celler
<ol><li>
Vask eggstokkene flere ganger i 1 x PBS (med 100 IU penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin og 0,5 µg/µL amfotericin) for å fjerne alle blod fra overflaten før isolasjon prosedyren. Bruker et beger, plassere eggstokkene inne, fylle den med 1 x PBS og forkaste PBS igjen.
	<ol>
<li>Gjenta dette vask 3-4 x, til eggstokkene fjernes fra eventuelle gjenværende blod.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tørk av en eggstokk bruker en lab tørke fuktet med 70% alkohol, for å minimere mulig forurensing.</li>
	<li>Med en 3 mL sprøyte og en 18 G nål, Sug opp GC av punktering små - og mellomstore follikler (< 6 mm, målt med en linjal), og follikulær væsken i en 50 mL sentrifuge tube. Merk: For å fukte sprøyten, ta en liten mengde av 1 x PBS (med 100 IU penicillin 0,1 mg/mL streptomycin og 0,5 µg/µL amfotericin). Dette bidrar til å samle små mengder follikulær væske og hindrer at celler stikker i sprøyten.</li>
	<li>Etter punktering flere follikler, skyll sprøyten og nål 1 x PBS for mellomliggende rengjøring.</li>
</ol>3. kryonisk bevaring av celler
<ol><li>
Bruk trypan blå flekker og telle celler under en hemocytometer.
	<ol>
<li>For å telle antall celler som levedyktig, forberede en rør med 1,5 µL av en 0.25% trypan blå løsning. Merk: De levende cellene forblir unstained kvinne fordi trypan blå bare tilgang til celle barrieren av døde celler, som deretter vises blå.</li>
		<li>Legg 15 µL av granulosa celle suspensjon trypan blå løsningen og bland dem forsiktig.</li>
		<li>Sett blandingen i begge kamre av en hemocytometer. Antall levende (f.eksunstained kvinne) celler i én stor firkant per kammer. Merk: Selv om noen blod celler kan sees, kan de være preget av sin lille størrelse.</li>
		<li>Beregne antall levende celler med gjennomsnitt av både kammer i henhold til de generelle retningslinjene; andelen av levende celler kan variere mellom eggstokkene men bør overstige 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ta en prøve av fersk isolert granulosa celle bassenget som referanse for videre analyse.
	<ol>
<li>Avhengig av cellen antall isolerte GC, satt til side et passende antall celler som referanse prøver for RNA og DNA protein forberedelse. Merk: RNA isolasjon og påfølgende evalueringen av genuttrykk, 1 x 105 celler er tilstrekkelig, mens andre påfølgende analyser kan kreve forskjellige, generelt høyere cellen tallene.</li>
		<li>Plasser ett eller flere dele Referanse celler i en fersk rør og sentrifuge det i 1 min i romtemperatur og maksimal hastighet (12 000 x g) å få celle pellets. Kast nedbryting.</li>
		<li>Umiddelbart sjokk frostvæske prøvene i flytende nitrogen. Lagre utvalget på-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utføre den kryonisk bevaring som følger.
	<ol>
<li>Forberede frysing mediet bruker 80% fosterets kalv serum (FCS) og 20% dimethyl sulfoxide (DMSO).</li>
		<li>For å forsiktig pellets GC, sentrifuge GC for 3 min i romtemperatur og 500 x g.</li>
		<li>Fjerne nedbryting nøye og forsiktig resuspend cellene i 100% FCS (f.eks, 1 mL) til ingen flere celle klumper er synlige.</li>
		<li>Legge 1 volum (f.eks, 1 mL) av forberedt frysing medium til celle suspensjon og overføre blandingen til kryogene ampuller. Merk: Den siste konsentrasjonen av cryo-beskytte media vil være 90% FCS og 10% DMSO.</li>
		<li>Plass kryogene ampullen i en spesialisert (kommersielt tilgjengelig) frysing beholder som hindrer frysing. Kjøling frekvensen av prøvene skal ikke overstige-1 ° C/min. overføring fryse beholderen til en-80 ° C fryser minst 4 h.</li>
		<li>For lengre lagring, plassere kryogene ampullene i ultra lav temperatur beholdere (f.eks, flytende fase nitrogen containere). Merk: Protokollen kan stoppes her som den kryonisk bevaring tillater lengre lagring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. forberedelse av Media og kultur plater for cellekultur
<ol><li>
Pelsen celle kultur plater med 0,02% kollagen R. Merk: Kollagen R er kjent for å være avgjørende for forbedret vedlegg i GC i kultur.<ol>
<li>Forberede en 0.02% kollagen R løsning med renset vann egnet for cellekultur.</li>
		<li>Legge til 150 µL per brønn i en 24-vel plate (= 2 cm2/vel) og sikre at hele overflaten av kultur godt er dekket med kollagen R løsning.</li>
		<li>La løsningen tørr med lokk åpent for noen timer eller over natten i laminær strømning panseret.</li>
		<li>Når kultur platene er helt tørt, irradiate dem med UV lys i 10-15 minutter å redusere forurensning.</li>
		<li>Eventuelt lagre platene på 4 ° C for opptil 2 måneder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede medier og kosttilskudd for kultur arbeid under laminær strømning hette. For en vellykket utvinning av GC har de behandles umiddelbart etter tining.</li>
	<li>
Klargjør følgende medier.
	<ol>
<li>Supplere α-Minimal viktig Medium (α-MEM) med 2 mM L-glutamin, 0.084% natriumbikarbonat, 0,1% bovin serum albumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL natrium selenitt, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insulin og 1 mM ikke-essensielle aminosyrer.</li>
		<li>I tillegg legge til 100 IU penicillin og 0,1 mg/mL streptomycin media. Merk: Antibiotika, når oppvarmet, er stabil for ca 48 timer. Derfor aliquot ønsket antall medier for kultur oppsett og planlagte medier exchange. Forvarm bare media dele 37 ° c i et vannbad. Forberedt media kan lagres på 4 ° C lenger enn 3 måneder.</li>
		<li>For å indusere steroid aktivitet i kulturperler bovin GC, supplement α-MEM i tillegg med 20 ng/mL follicle - stimulerende hormone (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 og 2 µM androstenedione. Merk: Alltid supplere disse komponentene like før utbruddet av en kultur eller media utveksling. Unngå gjentatte fryse og tine sykluser FSH og IGF-1 lager løsninger som dette kan kompromittere steroid aktiviteten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. celle kultur arbeid
<ol><li>Tine cellene raskt i et vannbad på 37 ° C i 3-4 min og overføre celle suspensjon i 37 ° C forvarmes α-MEM (uten hormon supplement). Et siste bind med 10 mL anbefales for sentrifugering.</li>
	<li>Sentrifuge GC for 3 min ved romtemperatur og 500 x g. Kast nedbryting. Legg forvarmes og supplert α-MEM og resuspend cellene nøye.</li>
	<li>Frø GC på en tetthet av 1 x 105 eller 1 x 106 celler per brønn i et siste volum på 500 µL. inkluderer tekniske gjentak av minst tre kultur per betingelse.</li>
	<li>Inkuber cellekultur i en inkubator på 37 ° C med 5% CO2 for 8 d.</li>
	<li>Utføre en media utveksling annenhver dag. Erstatt bare to tredjedeler av kultur media å redusere stress og lette tilpasningen av cellene til frisk media. Merk: GC danne en typisk fibroblast-lignende fenotypen etter noen dager i kultur og har en tendens til å klynge sammen. I celle-kompakt kultur, er større klynger funnet oftere i forhold til normal tetthet GC kultur (figur 1, venstre vs høyre panel).</li>
</ol>6. påfølgende analyse av kultivert Granulosa celler
<ol><li>Å utføre steroid hormon analyse, samle media og fryse den på 20 ° C. Bruke egnede metoder for å analysere østradiol og progesteron konsentrasjonen i brukte media [f.eks radioimmunoassay (RIA)]14.</li>
	<li>Lyse cellene direkte i kultur parabol med en passende lysing agent for påfølgende analyse av ulike molekyler (RNA, DNA, proteiner, etc.), som anbefalt av leverandøren. Merk: For de fleste isolering prosedyrer, det er mulig å stoppe protokollen her, som lysed cellene kan lagres på 20 ° C i opptil 1 uke. For lengre lagring, bør cellene holdes på-80 ° C.</li>
	<li>For å bestemme transkripsjon overflod, syntetisere cDNA og måle bestemt transkripsjoner av kvantitative sanntid polymerase kjedereaksjon (qPCR) teknikker15. En statistisk vurdering bør inneholde minst tre gjennomkjøringer av ulike cellekulturer, stammer fra ulike celle forberedelsene (biologiske gjentak).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Presentert celle kultur modellen har et verktøy for å analysere granulosa celle differensiering i vitro. Flere studier viste at en serum-free dyrking er en forutsetning for å opprettholde steroid aktivitet i kulturperler bovin GC eller GC av andre arter8,9. I tillegg forbedret belegg kultur parabol med deler av ekstracellulær matrix (f.eks, kollagen R)13, feste cellene betraktelig. En annen viktig funksjon er langvarig kultur perioden. Nylig har det vært vist at en langsiktig kultur er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig steroidogenic aktivitet og et balansert uttrykk granulosa celle identitet markører17. Det synes at GC krever tid å gjenopprette fra fysisk stresset under isolasjon prosedyren.
Media kosttilskudd FSH, IGF-1 og androstenedione er kjent å indusere aromatase aktivitet i kultivert GC. Spesielt, kosttilskudd med androstenedione er absolutt nødvendig, som GC trenger en forløper for østradiol syntese. Dette har vært publisert tidligere11,18 , og derfor ble ikke videre undersøkt i studien. Men kan en tilpasning av FSH, IGF-1 og androstenedione konsentrasjoner være nødvendig for andre eksperimentelle oppsetninger.
Kryonisk bevaring teknikken beskrevet her kan bidra til å forbedre organiseringen av vev kultur eksperimenter ved å gjøre dem mer uavhengig av varierende tilbudet med eggstokkene. Ifølge tidligere tester, påvirker ikke kryonisk bevaring GC fenotype eller steroid produksjon i kultur. Også avsløre overflod av markør utskrifter i kulturperler celler ikke betydelige forskjeller sammenligne prøver forberedt fra friske isolert celler med de tidligere utsatt til kryonisk bevaring16.
En viktig parameter for nåværende GC kultur modellen er cellen plating tetthet. Som vist ved Representant resultater, indusert øke plating tetthet bemerkelsesverdige endringer av fysiologiske og molekylære egenskaper. Flere gener er regulert på en bestemt måte, ligner endringene som er indusert av LH stimulering i vivo4,19. Det faktum at en økende celle tetthet kan kjøre differensiering-lignende prosesser i kulturperler bovin GC har vurderes omhyggelig i denne GC i vitro modellen å unngå motstridende resultater mellom gjentak. Derfor motstridende resultater med andre studier kan tilskrives forskjellige celle tettheter og bør undersøkes nærmere.
Kultur modellen beskrevet her avslørt for å være ikke-responsiv til LH, som utskrifter av reseptoren LHCGR er nær grensen på gjenkjenning. Derfor en simulering LH surge både i vivo situasjonen ikke å indusere differensiering13. Likevel, denne modellen gir et nyttig verktøy for å studere østradiol aktive GC i primære kultur, spesielt ikke funksjonelle bovin GC linjer finnes i dag.
Annen behandlingsprotokoller kan testes i stede GC kultur modellen som bidrar til å løse regulatoriske mekanismer steroid produksjons-eller GC differensiering. Videre, enkelt faktorer som er involvert i utviklingsprosesser kan analyseres separat. Derfor gir denne kultur modellen grunnlag for mange forskjellige programmer.

Vellykket eggløsning og luteinization avhenger av fint innstilt og velorganisert molekylær endringer i forskjellige somatisk follikulær celletyper. Siden detaljer om disse utviklingsprosesser ikke er ennå fullt ut forstått, ytterligere er avklaring nødvendig. I vivo tilnærminger er omfattende og kostbare, og spesielt ikke adressen spesifikk molekylære mekanismer som oppstår under folliculogenesis. Derfor er reductionistic i vitro modeller nødvendig i tillegg til å gi innsikt i mobilnettet og molekylære detaljer. Forskjellige studier beskriver kultur hele follikler i sammenheng med i vitro fertilisering teknikker1,2,3. Fordi forskere er interessert i mekanismer av differensiering, fokuserer mange studier på follikulær GC. Disse cellene, direkte forbundet med oocyte, er de store kildene av østrogenproduksjonen og dermed spille en viktig rolle i folliculogenesis og luteinization4.
Udødeliggjort cellen linjer av GC er utviklet fra ulike arter. De fleste av dem, men viser ikke en tilstrekkelig steroid hormon produksjon5. Så langt bare én celle linje med storfe GC har vært etablert6, men denne linjen mistet sin steroidogenic aktivitet etter flere avsnitt7. Derfor, siden steroidogenesis og, spesielt, østradiol produksjon er en viktig funksjon i GC-funksjonalitet, er det tilrådelig å studere disse aspektene i primære celle kultur modeller. I tidligere studier ble det vist at en betydelig østradiol produksjon kan bare følges under serum-fri kultur forhold8,9. Videre er, kosttilskudd av en forløper til østradiol syntese en annen forutsetning som GC ikke klarer å uttrykke nødvendig enzymet som kan konvertere progesteron androstenedione10. I tillegg viste synergistisk effekten av FSH og IGF-1 tilskudd i vitro en optimalisert aktivitet av aromatase, viktige enzymet østradiol syntese11. I stede protokollen, er andre viktige faktorer som har en betydelig innvirkning på GC kultur modellen også beskrevet. Spesielt har cellen plating tetthet enorm effekter på resultatet av eksperimentet12. Videre kan kryonisk bevaring teknikk bovin GC som ikke betydelig forstyrrer GC fysiologi i kultur etableres. Denne teknikken hjelper å forbedre organiseringen av celle kultur arbeidet og optimalisere foretrukne plating tetthet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Eggstokkreft granulosa celler (GC) er den viktigste kilden til østradiol syntese. Indusert av preovulatory luteiniserende hormon (LH) bølge, cellene i theca og spesielt av granulosa celle laget dypt endre karakteristikkene morfologiske, fysiologiske og molekylære og danne progesteron-produserende corpus luteum som er ansvarlig for graviditet. Celle kultur modeller er viktige verktøy å studere underliggende regulatoriske mekanismene som er involvert i folliculo-luteal transformasjonen. Presentert protokollen fokuserer på isolasjon prosedyre og kryonisk bevaring av bovin GC fra små - og mellomstore follikler (< 6 mm). Med denne teknikken, kan du få nesten ren innbyggere GC. Kryonisk bevaring prosedyren forenkler sterkt styring av cellekultur arbeide uavhengig av en direkte primære vev (eggstokkene) forsyning. Denne protokollen beskriver en serum-free celle kultur modell som etterligner østradiol-aktiv status for storfe GC. Viktige forhold som er avgjørende for en vellykket steroid-aktiv cellekultur omtales i protokollen. Det er vist at økende plating tettheten av cellene induserer en bestemt respons som angitt av en endret gene expression profil og hormon produksjon. Videre, denne modellen gir grunnlag for videre studier på GC differensiering og andre programmer.

GC belagt på 1 x 105 celler/godt vise en typisk fibroblast utseende som utgjør filtypen celle sammenlignes for fibroblaster og tendens til å bygge klynger (figur 1a og 1 c). Økende plating tettheten av 10-fold til 1 x 106 celler/vel endre ikke morfologi, men mer celle klynger kan observeres (figur 1b og 1 d, piler). Som allerede vist i en tidligere publikasjon forbedret kollagen belegget av kultur rettene hovedsakelig feste cellene13.
Første kryonisk bevaring endre ikke betydelig fysiologiske karakteristikkene av celler i kultur i forhold til de direkte kultivert fra ferske isolert prøver. Dette er vist i figur 2 som transkripsjon overflod (målt ved qPCR) av flere merketråden gener ikke avvike når sammenligne kulturperler celler avledet fra frosne eller ferske isolert bassenger.
Figur 3 viser representant resultatene av steroid hormon analyse (målt ved RIA) i bovin GC kultivert på normal vs høy tetthet. Østradiol konsentrasjon er betydelig redusert i høy tetthet kultur sammenlignet med normal tetthet kultur, mens progesteron produksjonen tendens til å være høyere.
En komparativ analyse av flere gener (målt ved qPCR) i høy g. normal tetthet kulturer avslørte en betydelig effekt (Figur 4). CYP19A1, koding nøkkel enzymet av østradiol biosyntesen aromatase, samt gonadotropin reseptoren FSHR, var betydelig ned-regulert. Derimot viste gener RGS2 og VNN2 en betydelig opp-regulering. Disse resultatene klart tyder på at spesifikke prosessene i cellulære differensiering er indusert av økes plating tetthet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figur 1: kultivert bovin granulosa celler ved normal (venstre panel) og høyt tetthet (høyre panel). (og c) celler kultivert på en tetthet på 1 x 105 celler/godt vises en typisk fibroblast-lignende fenotypen. (b og d) GC kultivert på en høy plating tetthet (1 x 106 celler/vel) en tendens til å danne store celle klynger (piler) oftere i forhold til celler under en normal tetthet (venstre panel). Skalere barer = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figur 2: sammenligning av celler kultivert direkte etter isolasjon og etter kryonisk bevaring. Cellene ble kultivert på en tetthet av 1 x 105 celler per brønn. Genuttrykk av flere markør transkripsjoner ble evaluert og viste ingen forskjell mellom kulturperler celler med eller uten en innledende kryonisk bevaring. Bokstegning viser medianen til n = 3. Tosidige Student t-test, p-verdier er inkludert. Dette tallet er gjengitt fra Baufeld og Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figur 3: Steroid hormon konsentrasjon i granulosa celler kultivert på ulike plating tettheter. Østradiol (E2) konsentrasjonen sunket betraktelig når GC ble kultivert på et høyt tetthet, mens progesteron (P4) konsentrasjonen bare tendens til å være høyere. Hormon konsentrasjonen ble korrigert for DNA innholdet å normalisere for ulike celle tall. Midlere og SEM n = 3 vises. p > 0,05, tosidige Student t-test. Dette tallet er gjengitt fra Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figur 4: Overflod av funksjonelle nøkkel utskrifter i granulosa celler kultivert på en normal vs en høy plating tetthet. Storfe GC kultivert under serum-free forhold for 8 d avslørte en bestemt regulering av flere valgte markør gener. Bokstegning viser medianen til n = 3 personlige gjentak. p < 0,05, tosidige Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En langsiktig kultur modell av bovin granulosa celler under serum-free forhold er beskrevet. Denne modellen tillater forskere til å studere virkningene av ulike faktorer som forskjellige plating tettheter på egenskapene til østrogen-produserende bovin granulosa celler.

En vev kultur modell av Estrogen-produserende primære bovin Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primære kultur av rotte Adrenocortical celler og analyser av Steroidogenic funksjoner

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

En ex vivo tissue kultur modell av brusk remodeling i storfe kne Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Tissue innsamling av ball for-omics analyser og primær Cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering og kultur av primær aorta endothelial celler fra miniatyr griser

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptose induksjon og deteksjon i en primær kultur av Sea agurk intestinal celler

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...