Name: a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

Vi tackar Veronica Schreiter för hennes utmärkta tekniska bistånd och hjälpsamma ändringar av den etablerade frysförvaring teknik och cell kultur modellen. Dessutom vill vi tacka Maren Anders och Swanhild Rodewald för deras utmärkta tekniskt bistånd i den efterföljande analysen.

Obs: Nötkreatur äggstockarna erhölls från ett kommersiellt slakteri. Insamling av slakthuset biprodukter kräver inte ett etiskt godkännande enligt tysk lag.
1. arbetsvillkor och preparat
<ol><li>För att garantera sterilitet, utföra alla medier och vävnad förberedelse samt alla kultur fungerar i en specialiserad cell kultur lab använder en laminär bänk.</li>
	<li>Bered 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) kompletteras med 100 IE penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin och 0,5 µg/µL amfotericin för transport av äggstockarna. Obs: Maximal varaktighet mellan mottagande äggstockarna och isolera GC är 2 h i detta upplägg.</li>
</ol>2. isolering av nötkreatur Granulosa celler
<ol><li>
Tvätta äggstockarna flera gånger i 1 x PBS (med 100 IE penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin och 0,5 µg/µL amfotericin) för att ta bort blod från ytan innan du startar proceduren isolering. Använda en bägare, placera äggstockarna inuti, fyll den med 1 x PBS och kassera PBS igen.
	<ol>
<li>Upprepa detta tvätt 3 – 4 x, tills äggstockarna rengörs från eventuella återstående blod.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Torka en äggstock med en lab torka indränkt med 70% alkohol, för att minimera möjliga föroreningar.</li>
	<li>Med en 3 mL spruta och en 18 G nål, aspirera GC genom att punktera små - till medelstora folliklar (< 6 mm, mätt med en linjal), och poolen follikulära vätskan i en 50 mL centrifugrör. Obs: För att fukta sprutan, ta en liten mängd 1 x PBS (med 100 IE penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin och 0,5 µg/µL amfotericin). Detta hjälper till att samla in små mängder av follikulära vätska och förhindrar celler fastnar inuti sprutan.</li>
	<li>Efter punktering flera folliklar, skölj sprutan och nålen med 1 x PBS för mellanliggande rengöring.</li>
</ol>3. Frysförvaring av celler
<ol><li>
Använd trypan blå färgning och räkna cellerna under en hemocytometer.
	<ol>
<li>För att räkna antalet livskraftiga celler, laga en röret med 1,5 µL av en 0,25% trypan blå lösning. Obs: De levande cellerna förblir ofärgade eftersom trypan blå kan endast komma åt cellen barriären av döda celler, som sedan visas blå.</li>
		<li>Tillsätt 15 µL av granulosa cellsuspensionen till trypan blå lösning och blanda försiktigt.</li>
		<li>Lägg blandningen i båda kammare av en hemocytometer. Räkna antalet levande celler (t.ex., ofärgade) i en stor fyrkant per kammare. Obs: Även om vissa blodkroppar kan ses, de kan särskiljas genom sina mycket liten storlek.</li>
		<li>Beräkna antalet levande celler med medelvärdet av båda kammare rutorna enligt de allmänna riktlinjerna, andelen av levande celler kan variera mellan äggstockarna men bör överstiga 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ta ett prov från färska isolerade granulosa cell poolen som en referens för ytterligare analys.
	<ol>
<li>Beroende på celltalet av isolerade GC, avsatt ett lämpligt antal celler som referensprov för RNA, DNA eller protein förberedelse. Anmärkning: För RNA isolering och efterföljande utvärdering av genuttrycket, 1 x 105 celler är tillräcklig, medan andra efterföljande analyser kan kräva olika, generellt högre cell nummer.</li>
		<li>Placera en eller flera portioner av de refererar till cellerna i en färsk rör och centrifugera det i 1 min i rumstemperatur och maxhastighet (12 000 x g) att få en cellpelleten. Kassera supernatanten.</li>
		<li>Omedelbart chock-frysa proverna i flytande kväve. Förvara provet vid-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Så här gör du frysförvaring.
	<ol>
<li>Förbereda frysning mediet använder 80% fetalt kalvserum (FCS) och 20% dimetyl sulfoxid (DMSO).</li>
		<li>För att försiktigt pellet GC, Centrifugera GC för 3 min i rumstemperatur och 500 x g.</li>
		<li>Ta bort supernatanten noggrant och försiktigt Omsuspendera cellerna i 100% FCS (t.ex., 1 mL) tills inga fler celler klumpar syns.</li>
		<li>Tillsätt 1 volym (t.ex., 1 mL) beredd frysning mediet att cellsuspensionen och överför blandningen till en kryogen injektionsflaska. Obs: Den slutliga koncentrationen av cryo-skydda media kommer att 90% FCS och 10% DMSO.</li>
		<li>Placera injektionsflaskan med kryogen i en specialiserad (kommersiellt tillgängligt) frysning behållare som förhindrar snabb nedfrysning. Kylning bör av proverna inte överstiga-1 ° C/min. överföring behållaren frysning till-80 ° C frys i minst 4 h.</li>
		<li>För längre lagring, placera kryogen injektionsflaskorna i ultra låg temperatur behållare (t.ex., flytande fas kväve behållare). Obs: Protokollet kan stoppas här, eftersom frysförvaring tillåter längre lagring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beredning av Media och kultur plattor för cellkulturen
<ol><li>
Coat cell kultur plattor med 0,02% kollagen R. Obs: Kollagen R är kända för att vara väsentliga för en förbättrad infästning av GC i kultur.<ol>
<li>Bered en 0.02% kollagen R med renat vatten lämpar sig för cellodling.</li>
		<li>Tillsätt 150 µL per brunn i en 24-well platta (= 2 cm2/väl) och se till att hela ytan av kulturen väl är täckt med kollagen R lösningen.</li>
		<li>Låt lösningen torka med locket öppet i några timmar eller över natten i LAF.</li>
		<li>När kulturen plattorna är helt torra, bestråla dem med UV-ljus för 10 – 15 min att minimera kontaminering.</li>
		<li>Om nödvändigt, lagra plattorna vid 4 ° C i upp till 2 månader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbereda media och kosttillskott för kulturarbete under en LAF. För en lyckad återhämtning av GC måste de bearbetas omedelbart efter upptining.</li>
	<li>
Förbered följande.
	<ol>
<li>Komplettera α-Minimal viktigt Medium (α-MEM) med 2 mM L-glutamin, 0,084% natriumbikarbonat, 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL natrium selenit, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insulin och 1 mM icke-essentiella aminosyror.</li>
		<li>Lägg dessutom till 100 IE penicillin och 0,1 mg/mL streptomycin till media. Obs: Antibiotika, en gång värmt, är stabila för ca 48 h. Därför alikvotens önskad mängd media för kultur struktur och planerade media exchange. Pre varma endast de media alikvoter till 37 ° C i ett vattenbad. Förberedda medier kan lagras vid 4 ° C längre än 3 månader.</li>
		<li>För att inducera steroid aktivitet i odlade nötkreatur GC, komplettera α-MEM dessutom med 20 ng/mL follikelstimulerande hormon (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 och 2 µM androstendion. Obs: Alltid komplettera dessa komponenter strax före uppkomsten av en kultur eller media exchange. Undvik upprepad frysning-och-tining cykler för FSH och IGF-1 stamlösningar, eftersom detta skulle äventyra den steroid verksamheten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cell kulturarbete
<ol><li>Tina cellerna snabbt i ett vattenbad vid 37 ° C i 3 – 4 min och överföra cellsuspensionen i 37 ° C före värmde α-MEM (utan hormonet tillägg). För centrifugering rekommenderas en slutlig volym av 10 mL.</li>
	<li>Centrifugera GC för 3 min i rumstemperatur och vid 500 x g. Kassera supernatanten. Lägg till α-MEM pre värmde och kompletterad och resuspendera cellerna noggrant.</li>
	<li>Utsäde GC på en densitet av 1 x 105 eller 1 x 106 celler per brunn i en slutlig volym av 500 µL. inkludera tekniska replikat av minst tre kultur brunnar per tillstånd.</li>
	<li>Inkubera cellkulturen i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 för 8 d.</li>
	<li>Utföra en media exchange varannan dag. Ersätta endast två tredjedelar av kultur media att reducera stress och underlätta anpassning av celler till färska media. Obs: GC bilda en typisk fibroblast-liknande fenotyp efter några dagar i kultur och tenderar att kluster tillsammans. I den höga cell-täthet kulturen finns större kluster oftare jämfört med den normala täthetsfunktionen GC kulturen (figur 1, vänster vs höger panel).</li>
</ol>6. efterföljande analys av odlade Granulosa celler
<ol><li>Att utföra steroid hormon analys, samla media och frysa den vid-20 ° C. Använda lämpliga metoder för att analysera koncentrationen av östradiol och progesteron i den förbrukade media [t.ex. radioimmunoassay (RIA)]14.</li>
	<li>För efterföljande analys av olika målmolekyler (RNA, DNA, proteiner, etc.), lyse celler direkt i kultur skålen med en lämplig lysing agent som rekommenderas av leverantören. Obs: För de flesta isolering förfaranden, det går att stoppa protokollet här, eftersom lyserat cellerna kan förvaras vid-20 ° C i upp till 1 vecka. För längre lagring, bör cellerna hållas vid-80 ° C.</li>
	<li>Att bestämma avskrift överflödet, syntetisera cDNA och mäta specifika avskrifter av kvantitativ realtids polymerasen kedjar reaktion (qPCR) teknik15. En statistisk utvärdering bör omfatta minst tre reproduktioner av olika cellkulturer, härstammar från annan cell preparat (biologiska replikat).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Presenterade cell kultur modellen ger ett verktyg för att analysera granulosa cell differentiering in vitro. Flera studier visade att en serumfritt odling är en förutsättning för att upprätthålla steroid aktiviteten i odlade nötkreatur GC eller GC andra arter8,9. Dessutom förbättrade beläggning kultur skålen med komponenter av extracellulär matrix (t.ex., kollagen R)13, infästningen av cellerna betydligt. En annan viktig funktion är den långvariga kultur perioden. Nyligen har visats det att en långsiktig kultur är nödvändigt att erhålla tillräcklig steroidogena aktivitet och ett balanserat uttryck av granulosa cell identitet markörer17. Det verkar att GC kräver tid att återhämta sig från den fysiska stressen under förfarandet för isolering.
De media kosttillskott FSH, IGF-1 och androstendion är kända för att inducera aromatashämmare i odlade GC. Speciellt, komplettering med androstendion är absolut nödvändig, som GC måste en föregångare för estradiol syntes. Detta har varit publicerade tidigare11,18 och, därför, inte ytterligare undersöktes under den aktuella studien. En anpassning av FSH, IGF-1 och androstendion koncentrationer kan dock vara nödvändigt för andra experimentella uppställningar.
Den frysförvaring teknik som beskrivs här kan bidra till att förbättra organisationen av vävnadsodling experiment genom att göra dem mer oberoende från varierande leverans med äggstockar. Enligt föregående testning, påverkar inte frysförvaring GC fenotyp eller steroid produktion i kultur. Överflödet av markör avskrifter i odlade celler visade också, inte betydande skillnader jämföra prover tillagade färska isolerade celler med de tidigare utsatts för frysförvaring16.
En avgörande parameter för närvarande GC kultur modellen är cellen plätering densitet. Som framgår av Representativa resultat, inducerad öka plätering tätheten anmärkningsvärda förändringar av fysiologiska och molekylära egenskaper. Flera gener regleras i ett särskilt sätt, som påminner om de förändringar som induceras av LH stimulering i vivo4,19. Det faktum att en ökande cell densiteten kan köra differentiering-liknande processer i odlade nötkreatur GC måste anses minutiöst i denna GC in vitro- modell att undvika motstridiga resultat mellan replikat. Därför motsägelsefulla resultat med andra studier kan tillskrivas annan cell tätheter och bör undersökas närmare.
Den kultur-modell som beskrivs här visade sig vara icke-lyhörd för LH, som avskrifter av receptorn LHCGR är nära detektionsgränsen. Därför en simulering av den LH-ökningen både i vivo situationen inte inducerar differentiering13. Ändå denna modell ger ett användbart verktyg för att studera estradiol-aktiva GC i primära kultur, särskilt som inga funktionella nötkreatur GC linjer finns i dagsläget.
Olika behandlingsprotokoll kan testas i nuvarande GC kultur modellen som hjälper till att riva upp regleringsmekanismer steroid produktions-eller GC differentiering. Ytterligare, enda faktorer som är inblandade i utvecklingsprocesser kan analyseras separat. Därför ger denna kultur modell underlag för många olika applikationer.

Lyckad ägglossning och luteinization beror på fint avstämt och väl iscensatt molekylära förändringar i olika somatiska follikulära celltyper. Eftersom Detaljer för dessa utvecklingsprocesser inte är ännu helt klarlagda, ytterligare krävs förtydligande. In vivo -metoder är genomarbetade och kostsamma och, i synnerhet inte adressen specifika molekylära mekanismer som uppstår under folliculogenesis. Därför behövs reduktionistiskt in vitro- modeller dessutom att ge insikt i cellulära och molekylära detaljer. Olika studier beskriver kulturen i hela folliklar i samband med in vitro- fertilisering tekniker1,2,3. Eftersom forskare är intresserad av mekanismer för differentiering, fokuserar många studier på follikulär GC. Dessa celler, direkt förknippade med äggcellen, är de stora källorna till östrogenproduktion och således en viktig roll i hela folliculogenesis och luteinization4.
Odödlig cell linjer av GC har utvecklats från olika arter. De flesta av dem, dock visar inte en tillräcklig steroid hormon produktion5. Hittills har endast en cell fodrar av nötkreatur GC har varit etablerad6, men denna linje förlorade dess steroidogena aktivitet efter flera passager7. Därför, sedan Steroidsyntes och, i synnerhet, estradiol produktion är en viktig funktion av GC funktionalitet, är det lämpligt att studera dessa aspekter i primär cell kultur modeller. I tidigare studier visades det att en betydande estradiol produktion bara kan observeras under serumfritt kultur villkorar8,9. Ytterligare är, tillskott av en föregångare av estradiol syntes en annan förutsättning, som GC misslyckas att uttrycka det nödvändiga enzym som kan konvertera progesteron till androstendion10. Dessutom avslöjade den synergistiska effekten av FSH och IGF-1 tillskott i vitro en optimerad aktivitet av aromatas, det nyckel-enzymet av estradiol syntes11. I detta protokoll beskrivs också andra viktiga faktorer som har en betydande inverkan på GC kultur modell. I synnerhet har cellen plätering densitet enorma effekter på resultatet av experimentet12. Dessutom kunde en frysförvaring teknik av nötkreatur GC som avsevärt inte stör GC fysiologi i kultur fastställas. Denna teknik bidrar till att förbättra organisationen av cell kulturarbete och optimera Rekommenderad plätering tätheten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Ovariell granulosa celler (GC) är den huvudsakliga källan av estradiol syntes. Induceras av den preovulatory luteiniserande hormon (LH) kraftigt, celler i theca och, i synnerhet det granulosa celllagrar djupt ändra deras morfologiska, fysiologiska och molekylära egenskaper och bilda progesteron-producerande corpus luteum som ansvarar för att bibehålla graviditeten. Cell kultur modeller är viktiga verktyg för att studera de underliggande reglerande mekanismerna som är involverade i folliculo-luteala omvandlingen. Presenterade protokollet fokuserar på isolering förfarande och Frysförvaring av nötkreatur GC från små - till medelstora folliklar (< 6 mm). Med denna teknik, kan en nästan ren befolkning på GC erhållas. Förfarandet för frysförvaring underlättar avsevärt tid förvaltning av cellkulturen arbeta oberoende av en direkt primär vävnad (äggstockar) leverans. Det här protokollet beskriver en modell av serum-fri cell-kultur som härmar estradiol-aktiv status för nötkreatur GC. Viktiga förutsättningar som är nödvändiga för en framgångsrik steroid-aktiv cellkultur diskuteras i hela protokollet. Det är visat att öka plätering tätheten av celler inducerar ett specifikt svar som indikeras av en förändrad gen uttryck profil och hormon produktion. Denna modell ger dessutom en grund för fortsatta studier på GC differentiering och andra program.

GC pläterade på 1 x 105 celler per brunn visas en typisk fibroblast utseende eftersom de utgör en cell filändelsen jämförbar med fibroblaster och tenderar att bygga kluster (figur 1a och 1 c). Ökande plätering tätheten av 10-faldigt till 1 x 106 celler per brunn ändrade inte morfologi men fler kluster i cellen kan observeras (figur 1b och 1 d, pilar). Som redan visas i en tidigare publikation bättre kollagen beläggning av kultur rätterna till stor del fastsättning av celler13.
Inledande frysförvaring förändrades inte betydligt de fysiologiska egenskaperna hos celler i kultur jämfört med dem direkt odlade från färska isolerade prover. Detta visas i figur 2 som avskrift överflödet (mätt genom qPCR) av flera markör gener skiljer inte sig när man jämför odlade celler härstammar från antingen frysta eller färska isolerade pooler.
Figur 3 visar representativa analysresultaten steroid hormon (mätt genom RIA) i nötkreatur GC odlade på normala vs. hög densitet. Estradiol koncentrationen är betydligt minskade i hög densitet kultur jämfört med normal-täthet kulturen, medan progesteron produktionen tenderade att vara högre.
En jämförande analys av flera gener (mätt genom qPCR) i hög - vs normal täthet kulturer visade en signifikant effekt (figur 4). CYP19A1, kodning det nyckel-enzymet av estradiol biosyntes aromatas, liksom gonadotropin receptorn FSHR, kraftigt reglerades ned. Däremot visade generna RGS2 och VNN2 en betydande upp-förordning. Dessa resultat tyder klart på att specifika processerna för celldifferentiering induceras genom att öka cellen plätering densitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figur 1: odlade nötkreatur granulosa celler på normal (vänster paneler) och hög cell densiteten (rätt panelerna). (och c) celler odlade på en densitet på 1 x 105 celler per brunn visas en typisk fibroblast-liknande fenotyp. (b och d) GC odlade på en hög plätering densitet (1 x 106 celler per brunn) tenderade att bilda stora cell kluster (pilar) oftare jämfört med celler under en normal täthet (till vänster). Skala barer = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figur 2: jämförelse av celler odlade direkt efter isolering och efter frysförvaring. Cellerna odlades på en densitet på 1 x 105 celler per brunn. Genuttrycket av flera markör avskrifter utvärderades och visade ingen skillnad mellan odlade celler med eller utan en inledande frysförvaring. Boxplot visar medianvärdet för n = 3. Tvåsidiga Students t-test, p-värden ingår. Denna siffra är Reproducerad från Baufeld och Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figur 3: Steroid hormon koncentration i granulosa celler odlade vid olika plätering tätheter. Estradiol (E2) koncentrationen minskade avsevärt när GC odlades på en hög cell densiteten, medan progesteron (P4) koncentrationen endast tenderade att vara högre. Hormon koncentrationen korrigerades för DNA innehållet att normalisera för olika cell nummer. Medelvärde och SEM n = 3 visas. p > 0,05, tvåsidiga Students t-test. Denna siffra är Reproducerad från Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figur 4: Överflöd av funktionella nyckel avskrifter i granulosa celler odlade på en normal vs. en hög plätering densitet. Bovin GC odlade serumfritt villkor för 8 d avslöjade en särskild förordning av flera valda markörgener. Boxplot visar medianvärdet för n = 3 individuella replikat. p < 0,05, tvåsidiga Students t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En långsiktigt kultur-modell av nötkreatur granulosa celler serumfritt villkor beskrivs. Denna modell tillåter forskare att studera effekterna av olika faktorer och villkor som olika plätering tätheter på kännetecknen av östrogen-producerande nötkreatur granulosa celler.

En vävnadskultur modell av östrogen-producerande primära nötkreatur Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primära kultur av råtta Adrenokortikal celler och analyser av steroidogena funktioner

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

En ex vivo vävnad kultur modell av brosk remodeling i nötkreatur knä Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolering och kultur av primära aortic endotelceller från miniatyr svin

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptos induktion och detektion i en primär kultur av hav gurka tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...