Name: synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate a (plcsa)-targeting lipid-polymer nanoparticles
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (2016YFC1000402), la Fundación Nacional de Ciencias naturales (81571445 y 81771617) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Guangdong (2016A030313178) a X.F. y el fondo de investigación básica de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) a X.F.

1. preparación de soluciones Stock
<ol><li>Preparar una solución acuosa de etanol 4% diluyendo 4 mL de etanol absoluto con 100 mL de agua ultrapura. La solución a 4 ° C. Nota: Agua ultrapura se define como agua sin contaminantes tales como bacterias, partículas, iones o nucleasas. Agua ultrapura fue obtenida de un sistema de purificación de agua con una resistencia de blanco de hasta 18.2 mΩ·cm, que significa baja contaminación aniónica.</li>
	<li>Preparar un 1 mg/mL solución stock de la lecitina de soja ...

<ol>
	<li>Davis, M. E., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+therapeutics:+an+emerging+treatment+modality+for+cancer.">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).</li><li>Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+applications+in+cancer.">Nanotechnology applications in cancer.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).</li><li>Jabir, N. 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Promising Scenarios for the Near Future.</a> Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).</li><li>Dasari, S., Tchounwou, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+in+cancer+therapy:+molecular+mechanisms+of+action.">Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action.</a> European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).</li><li>Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+in+cancer+therapy+and+diagnosis.">Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).</li><li>Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFRvIII+Antibody-Conjugated+Iron+Oxide+Nanoparticles+for+Magnetic+Resonance+Imaging-Guided+Convection-Enhanced+Delivery+and+Targeted+Therapy+of+Glioblastoma.">EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma.</a> Cancer Research. 70 (15), 6303-6312 (2010).</li><li>Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalable+magnetic+nanoparticles+for+targeted+hyperthermia+in+lung+cancer+therapy.">Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy.</a> Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).</li><li>Jennings, M., Nicknish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+site+of+intermolecular+cross-linking+in+human+red+blood+cell+band+3+protein.">Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).</li><li>Staros, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-hydroxysulfosuccinimide+active+esters:+bis(N-hydroxysulfosuccinimide)+esters+of+two+dicarboxylic+acids+are+hydrophilic,+membrane-impermeant,+protein+cross-linkers.">N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers.</a> Biochemistry. 21 (17), 3950-3955 (1982).</li><li>Valencia, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+assembly+of+homogenous+lipid&#8722;+polymeric+and+lipid&#8722;+quantum+dot+nanoparticles+enabled+by+microfluidic+rapid+mixing.">Single-step assembly of homogenous lipid&#8722; polymeric and lipid&#8722; quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing.</a> ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).</li><li>Altintas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-albumin+nanoparticles+(NANAPs)+for+the+delivery+of+a+multikinase+inhibitor+17864+to+EGFR+overexpressing+tumor+cells.">Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells.</a> Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).</li><li>Maya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cetuximab+conjugated+O-carboxymethyl+chitosan+nanoparticles+for+targeting+EGFR+overexpressing+cancer+cells.">Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells.</a> Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).</li><li>Deepagan, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+targeted+imaging+and+delivery+of+camptothecin+using+cetuximab-conjugated+multifunctional+PLGA-ZnS+nanoparticles.">In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles.</a> Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).</li><li>Totaro, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+investigation+of+EDC/sNHS-mediated+bioconjugation+reactions+for+carboxylated+peptide+substrates.">Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma.">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li><li>Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+TAT+peptide+in+drug+delivery+systems:+proteolytic+stability+requirements.">Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements.</a> Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).</li><li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+ocular+delivery+to+laser-induced+choroidal+neovascularization+by+dual+internalizing+RGD+and+TAT+peptide-modified+nanoparticles.">Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).</li></ol>

Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. El método de sonicación solo paso para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico es rápido, reproducible y diferente del típico nanoprecipitation métodos que implican calentamiento, Vortex o evaporación. Por lo tanto, el método desarrollado reduce significativamente el tiempo de síntesis. Además, la EDC/NHS bioconjugate utilizado en este protocolo es una ...

Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Por lo tanto, selectiva tumor targeting es la clave para explorar métodos terapéuticos exitosos. Nanopartículas ofrecen una oportunidad prometedora para tratamiento del cáncer, y conjuntos moleculares con diferentes grupos funcionales serán mejorar la eficacia de los medicamentos y reducir los efectos secundarios asociados1,2. Por otra parte, nanopartículas sistemas utilizan principalmente pasiva y activa dirigida a para alcanzar el objetivo tumores3.
Orientación pasivo explota las características innatas de nanopartículas y permeabilidad mejorada y los efectos de la retención (EPR) para llegar a las células del tumor. Liposomas catiónicos se han utilizado con éxito para entregar varios medicamentos anticancerosos a tumores en aplicaciones clínicas4,5,6. A pesar del potencial efecto terapéutico de cáncer eficaz, una concentración baja de drogas en la región del tumor y una incapacidad para distinguir las células tumorales de los tejidos normales son dos limitaciones importantes de nanopartículas dirigidas a pasivo7.
Activadas estrategias dirigida a toman ventaja de antígeno-anticuerpo, ligando-receptor y otras interacciones de reconocimiento molecular específicamente entregar drogas a tumores8. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa ampliamente en la mayoría de las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por otra parte, la proteína de la malaria VAR2CSA puede atar específicamente a plCSA9,10. Por lo tanto, VAR2CSA puede ser una herramienta para apuntar las células de cáncer humano. Sin embargo, cuando VAR2CSA es conjugados a nanopartículas, la proteína de larga duración puede limitar la penetración de nanopartículas en las células del tumor. Recientemente, descubrió un péptido de Unión plCSA (plCSA-BP), derivado de la proteína de la malaria VAR2CSA. nanopartículas de polímero lipídico plCSA BP conjugado enlazado rápidamente a células de coriocarcinoma y aumentó significativamente la doxorrubicina (DOX) actividad anticancerosa en vivo11; Estas partículas también específicamente adheridos a trofoblastos placentarios y podrían servir como una herramienta para la entrega específica de drogas a la placenta12.
Nanopartículas de polímeros lípidos consisten en una cáscara de monocapa de lípidos y un núcleo polímero hidrofóbico y representan un portador nuevo de la entrega de la droga. Estas nanopartículas combinan las ventajas de liposomas y nanocarriers poliméricos, tales como tamaño de nanopartícula controlable, alta biocompatibilidad, liberación sostenida del fármaco, eficacia de drogas alta carga (LE) y excelente estabilidad13. En este trabajo, utilizamos un método de sonicación solo paso para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico. Este método es rápido, conveniente y adecuado para escala-para arriba y ha sido ampliamente utilizado para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico por nuestro grupo11,14 y otros15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC) es una carbodiimida popular utilizada como agente de reticulación para conjugar la biomoléculas que contiene aminas y carboxylates19. Además de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) es el reactivo verbal más común en la superficie y nanopartículas Conjugación reacciones20,21. NHS puede reducir el número de reacciones secundarias y mejorar la estabilidad y rendimiento de éster intermediarios22,23.
Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigidos. En primer lugar, se describe la síntesis de sonicación solo paso de nanopartículas de polímero de lípidos cargados de DOX (DNPs). Luego, se introduce una técnica de bioconjugate EDC/NHS para la generación de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. Esta técnica de bioconjugate puede utilizarse también para conjugar otros anticuerpos y péptidos a nanopartículas. Finalmente, describimos el análisis de propiedades y en vitro fisicoquímico utilizado para caracterizar las nanopartículas de polímeros de lípidos plCSA dirigidos. Creemos que estas nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigida podrían constituir un sistema eficaz para la entrega específica de fármacos para cánceres más humanos y la entrega específica de cargas a la placenta para tratar los trastornos placentarios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>plCSA peptide</td>
			<td>Shanghai GL Biochem</td>
			<td>573518</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sinopharm Chemical</td>
			<td>10009218</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean lecithin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>441601</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSPE-PEG-COOH</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880125</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>JKChemical</td>
			<td>113424</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Shanghai Lingfeng</td>
			<td>1008621</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719897</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VCX130</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge filter (MWCO 10 kDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>for nanoparticles purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-18KS</td>
			<td>for nanoparticles purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56480</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bags</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132592T</td>
			<td>for nanoparticles purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.01</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL centrifuge tubes, polypropylene</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>S-025</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m sterile syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>for nanoparticles purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe, polypropylene</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td>for nanoparticles synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern Zetasizer</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>for particle size analyer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grid</td>
			<td>EMCN</td>
			<td>BZ10024a</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS spectrometer</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DZ0035</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission 
			electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-100CXII</td>
			<td>for particle size analyer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA reagent A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23228</td>
			<td>for BCA assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA reagent B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23224</td>
			<td>for BCA assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>for BCA assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Multiskan&#8482; GO</td>
			<td>for BCA assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEG3 cell</td>
			<td>Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu195</td>
			<td>Human placenta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30272.01</td>
			<td>phenol red-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10100</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15070063</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>CKK53</td>
			<td>for celluar uptake</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Shanghai Lingfeng</td>
			<td>1372021</td>
			<td>for celluar uptake</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606584</td>
			<td>for celluar uptake</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Life</td>
			<td>P36961</td>
			<td>for celluar uptake</td>
		</tr>
	</tbody>
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synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate a (plcsa)-targeting lipid-polymer nanoparticles

Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Nanopartículas activamente dirigida a ofrecen un enfoque prometedor para la terapia del cáncer. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa en una amplia gama de las células cancerosas y trofoblastos placentarios y palúdica proteína que var2csa puede atar específicamente a plCSA. Un péptido de Unión placentaria divulgado el sulfato de condroitina A (plCSA-BP), derivado de proteína de la malaria VAR2CSA, puede enlazar también específicamente plCSA en las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por lo tanto, las nanopartículas conjugadas de BP plCSA podrían utilizarse como una herramienta para el suministro de medicamentos dirigidos a los cánceres humanos y trofoblastos placentarios. En este protocolo, se describe un método para sintetizar lípidos-polímero conjugado de BP plCSA nanopartículas cargadas con doxorrubicina (plCSA-DNPs); el método consiste en una técnica de sonicación solo paso y bioconjugate. Además, se describen varios métodos para la caracterización de plCSA-DNPs, incluyendo la determinación de sus propiedades fisicoquímicas y la absorción celular de las células de coriocarcinoma placentario (JEG3).

En este protocolo, PLGA, DSPE-PEG-COOH y soja lecitina son un polímero representativo, lípido-PEG-COOH conjugado y lípidos, respectivamente. La síntesis de nanopartículas a través de un solo paso método de sonicación polímero lipídico plCSA dirigida y una técnica EDC/NHS se ilustra en la figura 1. En primer lugar, bajo condiciones de sonicación, lecitina de soja, PLGA y DSPE-PEG-COOH uno mismo-montar al core-shell de forma estructurada DN...

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Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A plCSA-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis del péptido de Unión placentaria condroitin sulfato A (plCSA-BP)-conjugados polímero lipídico nanopartículas via solo paso sonicación y bioconjugate técnicas. Estas partículas constituyen una novedosa herramienta para la entrega específica de la terapéutica para tumores más humanos y trofoblastos placentarios para tratar cánceres y trastornos placentarios.

Síntesis y caracterización de placenta condroitina sulfato (plCSA) - Targeting lípido - nanopartículas de polímero

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la administración dirigida de terapias a cánceres humanos y el cistoblast de placenta. La principal ventaja de esta técnica es que es un método simple y reproducible para sintetizar péptidos conjugados en otras partículas. Para empezar, agregue tres milímetros de cuatro por ciento de etanol a un tubo estéril de centrífuga de 10 mililitros.A continuación, añadir 90 microgramos de solución de stock de lecitina de soja, 210 microgramos de solución de stock de ácido DSPE-PEG-carboxílico, y 750 microgramos de solución de stock DOX. Utilice una jeringa de un mililitro para pipetear dos miligramos de solución de material PLGA. Coloque el tubo centrífugo en un baño de hielo en un procesador ultrasónico y sonicar durante dos minutos.A continuación, añada la solución de material PLGA en el tubo de centrífuga. Para purificar los DSP, utilice un filtro de centrífuga para lavar la solución en el búfer MES molar 0.1. Luego, centrifugar la solución a 1000 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.Para comenzar la activación del éster, agregue 0.4 miligramos de EDC a un mililitro de DNP. A continuación, agregue 0,24 miligramos de NHS a la reacción. Luego, permita que la reacción ocurra hasta una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.Después de esto, mezcle los componentes de reacción a fondo y coloque la reacción en una coctelera. Para iniciar la reacción de la amina, utilice PBS para aumentar el pH del tampón de 7.2 a 7.5. A continuación, añadir 0,5 miligramos de péptido de orientación pICSA a la solución de reacción.Mezcle bien la solución y colóquela en una coctelera. Luego, permita que la reacción continúe a cuatro grados centígrados durante la noche en la oscuridad. Al día siguiente, llene las bolsas de diálisis con la solución conjugada.Purifique los DSP pICSA con el tampón PBS a temperatura ambiente durante 24 horas en la oscuridad. Después de cultivar las células de acuerdo con el protocolo de texto, quite los medios y agregue un mililitro de medios frescos y fríos con el cinco por ciento de los DSP o DNP del pICSA. Luego, incubar la mezcla celular y nanopartícula durante una hora a cuatro grados Centígrados.Después de esto, retire el medio y lave las células tres veces con PBS. Luego, agregue un mililitro de medios frescos e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de esto, retire el medio y lave las células tres veces con PBS.Luego, agregue dos mililitros de frío, cuatro por ciento de PFA e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire la PFA y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, agregue un mililitro de PBS con DAPI para la tinción de núcleos.Dejar incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, añada el medio de montaje y la imagen de la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. Usando este protocolo, los DNP fueron preparados y conjugados con éxito con pICSA BP. Después de la conjugación, el diámetro de los DSP primarios aumentó a aproximadamente 109 nanómetros.Las imágenes TEM de los DSP y los DNPs pICSA mostraron que las partículas estaban bien dispersas y generalmente demostradas morfología esférica. El potencial zeta de las nanopartículas fue negativo 20,1 y 29,9 milivoltios, lo que indica que las nanopartículas eran altamente estables. El ensayo de absorción celular JEG3 indicó los DSP pICSA enlazados a las células JEG3 en un plazo de 30 minutos.Por lo tanto, el pICSA BP se conjugaba eficientemente a la superficie. Al intentar este procedimiento, es importante recordar sonicar la mezcla durante uno o dos minutos antes de agregar PLGA. Siguiendo este procedimiento, nuestros métodos como el ensayo HPLC se pueden realizar con el fin de determinar la eficiencia de conjugación con mayor precisión.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología reproductiva exploraran la posibilidad de tratamiento dirigido a la placenta en complicaciones del embarazo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NFÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚ÂºB Activity and Breast Cancer Stem Cells

Síntesis y caracterización de un profármaco Aspirina-fumarato que inhibe la actividad de NFkB y de la mama células madre del cáncer

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Contra el cáncer eficacia de la terapia fotodinámica con nanopartículas orientada por cáncer de pulmón

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterización de células del Tumor mediante un alambre de médico para la captura de circulación de las células del Tumor: un enfoque 3D basada en la inmunofluorescencia y DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...