Name: dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

وأيده البحث CN، IA، ومعاملة الدولة الأكثر رعاية وسهير مركز إينتيرديسسيبليناري للبحوث السريرية (إيزكف) والبرنامج الهمة من جامعة ارلنجن-نورمبرغ، فريتز-بندر-ستيفتونغ كرون الألمانية، آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ و التهاب القولون مؤسسة (دككف)، "سدر مجموعة البحوث السريرية" للالماني البحوث مجلس (DFG)، البرنامج الموضوع DFG الحجمية و "المبادرة الميدانية المستجدة" و DFG التعاونية أبحاث مراكز 643، 796 و 1181.

تم إجراء هذه الدراسات هو موضح في المقاطع التالية وفقا لموافقة لجنة الأخلاقيات فريدريش-ألكسندر جامعة ارلنجن نورنبيرغ.
1-إعداد الشعيرات الدموية
<ol><li>الاتصال الشعيرات الدموية مستطيلة الأنبوب المطاط تمتد الأنابيب على جانب واحد مع مقص صغير وإدراج الشعرية (حوالي 0.5 سم) بعناية ف?...

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;4&#946;1+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn's+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo.">The &#945;4&#946;1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s.">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).</li><li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+ulcerative+colitis.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+Germany+Consortium+Vedolizumab+induction+therapy+for+inflammatory+bowel+disease+in+clinical+practice--a+nationwide+consecutive+German+cohort+study.">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li><li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience.">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li><li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MAdCAM+antibody+(PF-00547659)+for+ulcerative+colitis+(TURANDOT):+a+phase+2+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).</li><li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis.">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-based+therapeutics:+biological+basis,+clinical+use+and+new+drugs.">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li><li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes.">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+&#945;4&#946;7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of &#945;4&#946;7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li><li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab.">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit:+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1.">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).</li><li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab,+an+Anti-&#945;4&#946;7+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-&#945;4&#946;7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li><li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis:+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study.">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li><li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis,+Calcium+Flux,+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells.">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin.">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+MRP8/14+is+a+regulator+of+&#946;2+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion.">Extracellular MRP8/14 is a regulator of &#946;2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s.">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature.">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye &amp; Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li><li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation.">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li><li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders.">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li><li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects.">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li><li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay.">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+&#945;E&#946;7+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8(+)+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo.">Blockade of &#945;E&#946;7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li></ol>

البروتوكول أعلاه توضح تقنية مفيدة لدراسة دينامية التصاق الخلايا المناعية البشرية إلى يغاندس بطانية. من خلال تباين يغاندس المغلفة، أنواع الخلايا perfused أو مجموعات فرعية، والحضانة مع محفزات إضافية أو الأجسام المضادة لتحييد مختلفة، فقد تقريبا التطبيقات المحتملة غير محدود. ولذلك، قد يكون من ...

الحركة خلية محكم تنظيم عملية لا غنى عنها للتنمية ووظيفة الكائنات الحية متعددة الخلايا، ولكن أيضا تورط في الآلية المرضية للعديد من الأمراض1. في الآونة الأخيرة، اكتسبت عملية استضافة أكثر من الخلايا المناعية من مجرى الدم إلى الأنسجة المحيطة اهتماما متزايداً، نظراً لأنها تسهم في تجديد وتوسيع نطاق من الخلايا المسببة للأمراض في أنسجة ملتهبة في وساطة مناعي الأمراض2 ،3. على وجه الخصوص، أظهرت صاروخ موجه إلى أهمية متعدية الجنسيات في أمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). فيدوليزوماب جسم إنتغرين العلاجية المضادة-α4β7 التدخل في توجيه القناة الهضمية وقد أظهرت فعاليتها في تجارب سريرية كبيرة4،5 وقد استخدمت بنجاح في العالم الحقيقي الممارسة السريرية6،7 , 8-مركبات أخرى من المحتمل أن تتبع9،10. وبالمثل، يستخدم جسم إنتغرين العلاجية المضادة-α4، ناتاليزوماب، لعلاج التصلب المتعدد (MS)11.
ومع ذلك، فهمنا الوظيفية العملية صاروخ موجه بصورة عامة وآلية العمل لهذه الأجسام المضادة العلاجية خاصة لا تزال محدودة. ومن الثابت أن صاروخ موجه تتألف من العديد من الخطوات بما في ذلك الربط الخلية والمتداول مع التصاق الخلايا اللاحقة أدت إلى توقيف شركة تليها عبر الهجرة غشائي12،13. تحييد الأجسام المضادة المشار إليها أعلاه إينتيجرينس على سطح الخلية منع التفاعل مع أدريسينس في البطانة جدار الوعاء الدموي. هذا ويعتقد أن تعيق التصاق الخلية الثابت14،15. حتى الآن، لقد بدأنا فقط لفهم أهمية التفاضلية إينتيجرينس محددة لصاروخ موجه من خلية لخلية متميزة مجموعات فرعية. وعلاوة على ذلك، خلية آثار الأجسام المضادة-إنتغرين على مختلف المجموعات الفرعية والجمعيات الاستجابة للجرعة معروفة إلى حد كبير مما أدى إلى الكثير من الأسئلة المفتوحة في مجال العلاجات صاروخ موجه والمضادة الالتصاق الغريزي في بنك التنمية بين الأمريكتين.
ولذلك، تمس الحاجة إليها أدوات ملائمة للتصدي لهذه المسائل. حتى الآن تم تقييم تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين على التفاعل أدريسين إنتغرين أساسا بتقييم تثبيط فعالية/ملزمة ملزمة مع التدفق الخلوي أو عن طريق التصاق ثابتة فحوصات16،17 ،18،19،20، وبالتالي مع تبسيط الظاهر وانحراف عن الحالة الفسيولوجية. كما أنشأنا مؤخرا مقايسة التصاق دينامية لدراسة التصاق إنتغرين-تعتمد على الخلايا البشرية إلى أدريسينس والآثار للأجسام المضادة-إنتغرين تحت إجهاد القص2. وفي وقت سابق ثبت مبدأ هذه التقنية مع الماوس الخلايا21،22. هنا، كان تكييفها وتطويرها لمعالجة المسائل المذكورة أعلاه متعدية الجنسيات، وفتح مجالات جديدة لأفضل فهم آليات العلاج مع إنتغرين مكافحة الأجسام المضادة في الجسم الحي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-Well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin (BSA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20x2.00 mm ID, 50 mm length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>3520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL-2, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Rotixa 50 RS)</td>
			<td>Hettrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (TCS SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL-10, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA KE/9 ml Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc chimera isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1)</td>
			<td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG Isotype Control</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG isotype control</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6056-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natalizumab</td>
			<td>Biogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Counting chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-601000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182-10</td>
			<td>w/o Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-human CD18</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetts</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>553706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vedolizumab (Entyvio)</td>
			<td>Takeda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease

صاروخ موجه القناة الهضمية للخلايا المناعية مهم للآلية المرضية لأمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). التصاق الخلية إنتغرين-تعتمد على أن أدريسينس خطوة حاسمة في هذه العملية، ووضعت استراتيجيات علاجية تتداخل مع الالتصاق بنجاح. جسم إنتغرين مكافحة--α4β7، فيدوليزوماب، ويستخدم للمعالجة السريرية لداء كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC) ومركبات أخرى من المحتمل أن تتبع.
تفاصيل الإجراء التصاق وآليات عمل الأجسام المضادة-إنتغرين لا تزال غير واضحة في ما يخص العديد من التقنيات المتاحة محدودة بسبب للبحوث الفنية في هذا المجال.
نقدم هنا، مقايسة التصاق ديناميكي للتحليل الوظيفي لالتصاق الخلايا البشرية تحت ظروف التدفق وأثر العلاجات المضادة-إنتغرين في إطار بنك التنمية بين الأمريكتين. أنه يستند إلى التروية للخلايا البشرية الأولية من خلال الشعيرات الدموية الزجاج سامسونج أدريسين المغلفة بالتحليل المجهري في الوقت الحقيقي. يقدم مجموعة متنوعة من الفرص المتاحة لإدخال تحسينات وتعديلات المقايسة ويحمل إمكانات للاكتشافات الميكانيكية وتطبيقات متعدية الجنسيات.

الطريقة التي عرضت في هذه المخطوطة تقييم تهدف إلى محاكاة عملية التصاق الخلايا البشرية على الحائط بطانية في فيفو قدر الإمكان إلى وظيفيا التصاق الخلايا ودور الأجسام المضادة للتدخل. ولذلك، سامسونج الشعيرات الدموية المغلفة مع أدريسينس و perfused مع الخلايا البشرية المسمى ?...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

التصاق دينامية للخلايا المناعية لجدار الوعاء شرطا لصاروخ موجه القناة الهضمية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة وظيفية في المختبر لتحليل تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين أو المستقطبات أو غيرها من العوامل على التصاق الخلية الحيوية للخلايا البشرية باستخدام الشعيرات الدموية المغلفة أدريسين.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا المناعية الأساسية وأبحاث أمراض الأمعاء الالتهابية فيما يتعلق بسلسلة الالتصاق من الخلايا المناعية اللازمة لتشخيط الأعضاء الطرفية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة مريحة ومباشرة للإجابة على الأسئلة الوظيفية في سياق التصاق الخلية في ظل ظروف التدفق. على الرغم من أن هذه الطريقة قد وضعت لاستكشاف آلية الخلايا بوتيتيك المضادة للأجسام المضادة في أمراض الأمعاء الالتهابية، فإنه يمكن تعديلها لتحليل قضايا مماثلة في إعدادات الأمراض الالتهابية الأخرى.تبدأ تمتد قطعة من المطاط أنابيب على جانب واحد مع مقص صغير للسماح لإدراج شعري مستطيلة ما يقرب من 0.5 سم في الأنبوب. ثم ختم الاتصال مع فيلم البارافين. معطف الشعرية مع 20 ميكرولترات من العناوين من الفائدة وختم الجانب غير متصل الأنابيب مع فيلم البارافين البلاستيك لمدة حضانة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، وإزالة فيلم البارافين البلاستيك والسماح للسوائل نقع من الشعيرات الدموية على منشفة ورقية لإفراغ الأنابيب. ثم كتلة الشعيرات الدموية مع 20 ميكرولترات من محلول منع لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية. من المهم جداً تطبيق الحجب على الشعيرات الدموية مباشرة بعد إزالة الطلاء لتجنب تجفيف الشعيرات الدموية لأن هذا قد يضعف وظيفة البروتينات المشفرة.في حين يتم حظر الشعيرات الدموية ، إضافة 18 ملليلتر من الدم البشري كله مضاد للتخثر من أنبوب 50 ملليلتر وتمييع الدم إلى حجم إجمالي قدره 35 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني. طبقة 10 ملليلترات من كثافة التدرج المتوسطة تحت محلول الدم وعزل الدم أحادية النوى الطرفية خلايا الدم بالانفروج الانحداري الكثافة. في نهاية الفصل، نقل خلايا أحادية النوى الدم الطرفية من واجهة متوسطة التدرج الكثافة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر.و جلب الحجم الكلي في الأنبوب إلى 50 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني جديد. بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للعد وصمة عار الخلايا مع خلية مناسبة تتبع صبغة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في نهاية التحبيب تلطيخ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من تركيز كامل لـ RPMI المتوسطة.ثم بذور ملليلتر واحد من الخلايا في العديد من الآبار من لوحة 48 جيدا كما أن هناك ظروف. وإضافة الحجم المناسب من الأجسام المضادة للانبات إلى الآبار المناسبة لمدة ساعة واحدة حضانة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك استخدام ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا عدة مرات قبل نقل الخلايا إلى أنابيب ميليلتر الفردية.شطف كل جيدا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وتجمع يغسل في أنابيب مليلتر المناسب. بعد عد, بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي و resuspened الخلايا في حجم المناسبة من التصاق العازلة للحصول على 1.5 مرات عشرة إلى الخلايا السادسة لكل تعليق ملليلتر. ثم إضافة الحجم المناسب من كلوريد المنغنيز إلى كل أنبوب إلى تركيز نهائي واحد ملليمولار.عندما تكون الخلايا جاهزة، قم بتشغيل المجهر وحدد الفلاتر المناسبة وأشعة الليزر، ووضع الهدف والحيازة. إزالة فيلم البارافين البلاستيك من غيض من الشعرية واستخدام مقص لتمتد قطعة خمسة سنتيمترات من أنابيب المطاط للسماح شعري أن تكون متصلا أنبوب أصغر. ختم الاتصال بين الشعيرات الدموية وأنبوب مع فيلم البارافين البلاستيك.وقم بتركيب الشعيرات الدموية على صينية تثبيت. ضع الدرج على حامل الدرج من المجهر حتى يكون الشعر الشعري في التركيز. وأدخل أنابيب المطاط في الشق المقابلة من مضخة الاطّلاع.ضع الطرف غير المتصل من الأنبوب في أنبوب العينة الأول الذي يحتوي على تعليق الخلية. وأدخل الأنبوب القصير على الجانب الآخر من الشعيرات الدموية في أنبوب 15 ملليلتر لجمع التدفق من خلال. اسمحوا الأنابيب ملء في 500 ميكرولتررس في الدقيقة معدل التدفق حتى تعليق الخلية تصل تقريبا شعري.ثم اسمحوا شعري ملء بمعدل تدفق 100 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة. عندما يتم تعبئة شعري مع الخلايا، وضبط معدل تدفق إلى 10 ميكرولترات في الدقيقة والتقاط الصور الفاصل الزمني للخلايا تتحرك ببطء من خلال شعرية على طول داخل جدار addressin المغلفة كل ثانيتين ما مجموعه ثلاث دقائق. مرة واحدة في تعليق الخلية يصل إلى داخل الشعرية، فمن الأهمية بمكان لتجنب أي انقطاع للتدفق لأن هذا سيؤدي إلى معالجة integrin ثابت التفاعل يحتمل التحيز القياس.قبل التخلص من تيار الشعرية كلها من خلال العدسة من المجهر للتأكد من أن القسم الملاحظ على الشاشة هو تمثيلي. حرّر الأنابيب من المضخة ودع السائل المتبقي يعود إلى أنبوب المليلتر. ثم قطع الشعيرات الدموية والأنابيب من علبة التثبيت وصورة الشعرية التالية كما أظهرت للتو.لتقييم تسجيلات الفاصل الزمني، افتح التسلسل الأول في برنامج التحليل المناسب ثم قم بتصدير الصور الثلاثة الأولى والأخيرة كملفات TIFF. افتح الصور الثلاثة الأولى في ImageJ وحدد الصورة، واكتب، و32 بت لتحويل الصور إلى 32 بت. ثم حدد الصورة واللون والقنوات دمج لدمج الصور في صورة واحدة وتحويل الصورة المركبة إلى RGB لحفظ كملف TIFF.بعد تحويل الصور الثلاث الأخيرة بنفس الطريقة، عد الخلايا البيضاء المرئية في بداية ونهاية الصور المركبة. وطرح عدد من الخلايا البيضاء في الصورة بداية من عدد من الخلايا البيضاء في صورة النهاية. يؤدي تسريب الشعيرات الدموية المغلفة بـ ICAM-1، VCAM-1، MAdCAM-1، ولكن ليس Isotype Fc chimera مع PBMCs البشرية إلى التصاق ملحوظ عند وجود أحد العناوين الثلاثة.في المقابل، يؤدي تثبيط التفاعلات في عناوين integrin باستخدام الأجسام المضادة تحييد عادة إلى انخفاض ملحوظ من التصاق ديناميكية التي تكون غائبة عند إضافة الأجسام المضادة التحكم isotype. وعلاوة على ذلك، علاج الخلايا التائية بشرية CD4 مع chemokines محددة يؤدي إلى زيادة التصاق للمعالجة مقارنة مع الخلايا البشرية غير المعالجة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم جداً أن نتذكر أن عوامل مختلفة تسهم في التصاق الخلية الحيوية في الجسم الحي التي لا يمكن أن تكون ملخصة تماما في هذا الفحص.ومع ذلك، فمن الممكن لضبط التشكي لمعالجة أسئلة معقدة جدا. من أجل معالجة أسئلة إضافية على سلوك التصاق التفاضلية من أنواع الخلايا الاختبار، فمن الممكن أيضا لأداء اختبار التصاق تنافسية مع أنواع الخلايا المختلفة التي تحمل علامات تتبع الخلايا المختلفة. بعد تطورها ، مكنتنا هذه التقنية من استكشاف آثار الأجسام المضادة المختلفة المضادة للtegrin المستخدمة أو قيد التطوير حاليًا لعلاج أمراض الأمعاء الالتهابية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

التلاعب الجيني في<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...