Name: dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Forskning i KN, IA, MFN og SZ blev støttet af interdisciplinære Center for klinisk forskning (IZKF) og ELAN program af University Erlangen-Nürnberg, anden Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, tysk Crohns og Colitis Foundation (DCCV), den kliniske forskning gruppe CEDER af tysk forskning Rådet (DFG), programmet DFG emne på mikrobiota, det nye felt initiativ og den DFG Collaborative Research Centre 643, 796 og 1181.

De undersøgelser, der er beskrevet i de følgende afsnit er blevet udført efter godkendelse af den etiske komité af Friedrich-Alexander universitetet Erlangen-Nürnberg.
1. forberedelse af kapillærer
<ol><li>Tilslut rektangulære kapillærer til gummi slange ved at strække slangen på den ene side med en lille saks og forsigtigt indsætte kapillær (ca 0,5 cm) i røret. Forsegle forbindelsen mellem kapillær og tube med plast paraffin film.</li>
	<li>Coat kapillær med 20 µL addressin ...

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;4&#946;1+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn's+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo.">The &#945;4&#946;1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s.">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).</li><li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+ulcerative+colitis.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+Germany+Consortium+Vedolizumab+induction+therapy+for+inflammatory+bowel+disease+in+clinical+practice--a+nationwide+consecutive+German+cohort+study.">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li><li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience.">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li><li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MAdCAM+antibody+(PF-00547659)+for+ulcerative+colitis+(TURANDOT):+a+phase+2+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).</li><li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis.">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-based+therapeutics:+biological+basis,+clinical+use+and+new+drugs.">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li><li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes.">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+&#945;4&#946;7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of &#945;4&#946;7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li><li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab.">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit:+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1.">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).</li><li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab,+an+Anti-&#945;4&#946;7+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-&#945;4&#946;7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li><li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis:+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study.">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li><li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis,+Calcium+Flux,+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells.">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin.">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+MRP8/14+is+a+regulator+of+&#946;2+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion.">Extracellular MRP8/14 is a regulator of &#946;2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s.">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature.">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye &amp; Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li><li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation.">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li><li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders.">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li><li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects.">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li><li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay.">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+&#945;E&#946;7+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8(+)+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo.">Blockade of &#945;E&#946;7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li></ol>

Den ovennævnte protokol beskriver en nyttig teknik til at studere dynamisk vedhæftning af menneskelige immunceller til endotel ligander. Gennem variation af de coatede ligander, perfunderet celletyper eller delgrupper, inkubation med yderligere stimuli eller forskellige neutraliserende antistoffer, det har næsten ubegrænset potentielle anvendelsesmuligheder. Sådanne dynamiske friktion assays kan derfor nyttigt at besvare begge grundlæggende spørgsmål af grundlæggende forskning samt translationel forespørgsler, ...

Celle bevægelse er en stramt reguleret proces uundværlige for udvikling og funktion af multi-cellulære organismer, men er også involveret i patogenesen af en lang række sygdomme1. For nylig, den homing proces af immunceller fra blodet til de perifere væv har fået stigende opmærksomhed, da det bidrager til genbestilling og udvidelse af sygdomsfremkaldende celler i betændt væv i immunologisk medierede sygdomme2 ,3. Især har homing vist sig at have translationel relevans i inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Den terapeutiske anti-α4β7 integrin antistof vedolizumab forstyrrer gut homing har vist effekt i store kliniske forsøg4,5 og held har været anvendt i virkelige verden klinisk praksis6,7 , 8. yderligere forbindelser er tilbøjelige til at følge9,10. Ligeledes, den terapeutiske anti-α4-integrin antistof, natalizumab, bruges til behandling af multipel sklerose (MS)11.
Men vores funktionel forståelse af målsøgende processen i almindelighed og virkningsmekanisme af sådanne terapeutiske antistoffer i særdeleshed er stadig begrænset. Det er godt etableret, målsøgende består af flere trin, herunder celle tøjring og rullende med efterfølgende celle vedhæftning fører til fast anholdelse efterfulgt af trans endotel migration12,13. De ovennævnte antistoffer neutralisere integriner på cellens overflade forhindrer interaktion med addressins på endotelet i karvæggen. Dette menes at hæmme fast celle vedhæftning14,15. Endnu, vi kun begyndt at forstå differential relevansen af specifikke integriner for celle homing af særskilt celle subsets. Desuden virkningerne af anti-integrin antistoffer på forskellige celle subsets og dosis-respons foreninger er stort set ukendt, fører til masser af åbne spørgsmål inden for gut målsøgende og anti-friktion behandlingsformer i IBD.
Derfor er der desperat behov for praktiske værktøjer til at løse sådanne spørgsmål. Effekten af anti-integrin antistoffer på integrin-addressin interaktion er hidtil overvejende blevet evalueret af vurderingen bindende effekt/bindende hæmning med flowcytometri eller via statisk friktionskoefficient assays16,17 ,18,19,20, dermed med tilsyneladende forenkling og afvigelse fra den fysiologiske situation. Vi for nylig har etableret en dynamisk friktionskoefficient assay for at studere integrin-afhængige vedhæftning af menneskelige celler til addressins og virkningerne af anti-integrin antistoffer under shear stress2. Princippet om teknikken er tidligere blevet påvist med musen celler21,22. Her, det blev tilpasset og udviklet for at løse de ovennævnte translationel spørgsmål, åbning nye veje for bedre at forstå mekanismerne af behandling med anti-integrin antistoffer i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-Well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin (BSA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20x2.00 mm ID, 50 mm length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>3520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL-2, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Rotixa 50 RS)</td>
			<td>Hettrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (TCS SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL-10, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA KE/9 ml Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc chimera isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1)</td>
			<td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG Isotype Control</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG isotype control</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6056-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natalizumab</td>
			<td>Biogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Counting chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-601000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182-10</td>
			<td>w/o Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-human CD18</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetts</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>553706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vedolizumab (Entyvio)</td>
			<td>Takeda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease

Gut homing af immunceller er vigtigt for patogenesen af inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Integra-afhængige celle vedhæftning til addressins er et afgørende skridt i denne proces og terapeutiske strategier forstyrrer vedhæftning har været med succes etableret. Anti-α4β7 integrin antistof, vedolizumab, der bruges til den kliniske behandling af Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC) og yderligere forbindelser er tilbøjelige til at følge.
Nærmere oplysninger om proceduren vedhæftning og handling mekanismer for anti-integrin antistoffer er stadig uklart i mange henseender på grund af den begrænsede tilgængelige teknik for den funktionelle forskning på dette område.
Her præsenterer vi en dynamisk friktionskoefficient assay for den funktionelle analyse af humane celle vedhæftning flow betingelser og virkningen af anti-integrin behandlingsformer i forbindelse med IBD. Det er baseret på perfusion af primære menneskelige celler gennem addressin-belagt ultratynde glas kapillærer med real-time mikroskopisk analyse. Analysen tilbyder en bred vifte af muligheder for forbedringer og ændringer og holder potentialer for mekanistisk opdagelser og translationel applikationer.

Metoden fremlægges i dette manuskript har til formål at simulere i vivo proces af humane celle vedhæftning til i endothelial væggen så tæt som muligt til funktionelt vurdere celle vedhæftning og rollen som interfererende antistoffer. Derfor, ultratynde kapillærer er belagt med addressins og perfunderet med fluorescently mærket menneskelige celler af interesse ved hjælp af en perfusion pumpe. Ved hjælp af levende celle imaging vedhæftning af menneskelige celler til at ...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamisk friktionskoefficient Assay for den funktionelle analyse af anti-friktion behandlinger i inflammatorisk tarmsygdom

Dynamisk vedhæftning af immunceller til karvæggen er en forudsætning for gut målsøgende. Her præsenterer vi en protokol til en funktionel i vitro assay for konsekvensanalyse af anti-integrin antistoffer, kemokiner eller andre faktorer på den dynamiske celle vedhæftning af menneskelige celler ved hjælp af addressin-belagt kapillærer.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om grundlæggende immunbiologi og inflammatorisk tarmsygdom forskning vedrørende vedhæftning kaskade af immunceller, der kræves for homing til perifere organer. Den største fordel ved denne teknik er, at det er en bekvem og ligetil tilgang til besvarelse af funktionelle spørgsmål i forbindelse med celle vedhæftning under strømningsforhold. Selv om denne metode blev udviklet til at udforske mekanismen af celle poietiske anti-integrin antistoffer i inflammatoriske tarmsygdomme, det kan ændres til at analysere lignende problemer i andre inflammatoriske sygdomsindstillinger.Begynd med at strække et stykke gummislang på den ene side med en lille saks for at tillade indsættelse af en rektangulær kapillær ca. 0,5 centimeter ind i røret. Derefter forsegle forbindelsen med paraffin film. Coat kapillær med 20 mikroliter af addressin af interesse og forsegle den side, der ikke er forbundet til slangen med plast paraffin film i mindst en time inkubation ved 37 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen fjernes plastparaffinfilmen og væsken suges ud af kapillæren på et køkkenrulle for at tømme slangen. Derefter blokere kapillær med 20 mikroliter af blokerende opløsning i mindst en time ved 37 grader Celsius. Det er meget vigtigt at anvende blokeringen på kapillæren direkte efter fjernelse af belægningen for at undgå udtørring af kapillær, da dette kan forringe funktionaliteten af de kodede proteiner.Mens kapillæren blokeres, tilsættes 18 milliliter antikoaguleret fuldblod fra et 50 milliliterrør og blodfortyndes til et samlet volumen på 35 milliliter med PBS. Lag 10 milliliter densitet gradient medium under blodopløsningen og isolere det perifere blod mononukleare blodlegemer ved densitet gradient centrifugering. Ved afslutningen af adskillelsen overføres de perifere mononukleerede celler fra tæthedens gradientmedens grænseflade til et nyt 50 milliliterrør.Og bring det samlede volumen i røret op til 50 milliliter med frisk PBS. Efter centrifugering skal pelleten resuspenres i 10 milliliter frisk PBS til optælling og pletter cellerne med et egnet cellesporingsfarvestof i henhold til producentens anvisninger. Ved afslutningen af farvning inkubationen, indsamle cellerne ved centrifugering og resuspend pellet på en 1,5 gange 10 til de seks celler pr milliliter af fuldstændig RPMI medium koncentration.Så frø en milliliter celler i så mange brønde af en 48 godt plade, som der er betingelser. Og tilsæt passende volumen af anti-integrin antistof til de relevante brønde for en time inkubation ved 37 grader Celsius. Næste brug en P1000 pipette til at resuspendere cellerne flere gange, før du overfører cellerne til individuelle to milliliter rør.Skyl hver brønd med en milliliter PBS og pool vaskerne i de relevante to milliliter rør. Efter optælling pellets cellerne ved centrifugering og opsbrugte cellerne i det relevante volumen af vedhæftningsbuffer for at opnå 1,5 gange ti til de sjette celler pr. millilitersuspensioner. Derefter tilsættes den passende mængde manganchlorid til hvert rør til en 1 millimolar endelig koncentration.Når cellerne er klar, skal du tænde for mikroskopet og vælge de relevante filtre og lasere, objektive og anskaffelsestilstand. Fjern plast paraffin film fra spidsen af kapillær og bruge en saks til at strække en fem centimeter stykke gummislange at tillade kapillær, der skal tilsluttes til de mindre rør. Forsegl forbindelsen mellem kapillæren og røret med plastparaffinfilm.Og monter kapillæren på en fikseringsbakke. Anstærr bakken på bakkeholderen på mikroskopet, så kapillæren er i fokus. Og sæt gummislangen i det tilsvarende hak i den peristaltiske pumpe.Den uopsluttede ende af slangen anbringes i det første prøverør, der indeholder cellesuspensionen. Og indsæt det korte rør på den anden side af kapillæren i et 15 milliliterrør for at indsamle flowet igennem. Lad slangen fyldes med 500 mikroliter pr. minut strømningshastighed, indtil celleaffjedringen næsten når kapillæren.Lad derefter kapillæren fylde med en strømningshastighed på 100 mikroliter i minuttet. Når kapillæren er fyldt med celler, justeres strømningshastigheden til 10 mikroliter pr. minut, og der skal i alt optages billeder af cellerne gennem kapillæren langs indersiden af addressin-belagt væg hvert andet sekund i i alt tre minutter. Når cellesuspensionen når indersiden af kapillæren, er det afgørende at undgå enhver afbrydelse af flowet, da dette vil føre til statisk integrin-adresseinteraktion, der potentielt kan påvirke målingen.Før du kasserer strøm hele kapillær gennem okularet af mikroskopet for at sikre, at afsnittet observeret på skærmen er repræsentativ. Frigør slangen fra pumpen og lad den resterende væske løbe tilbage i de to milliliterrør. Fjern derefter kapillæren og slangen fra fikseringsbakken og billedet den næste kapillær som netop påvist.Hvis du vil evaluere tidsforfaldenes optagelser, skal du åbne den første sekvens i den relevante analysesoftware og eksportere de første og sidste tre billeder som TIFF-filer. Åbn de tre startbilleder i ImageJ, og vælg billede, tekst og 32-bit for at konvertere billederne til 32-bit. Vælg derefter billed-, farve- og flettekanaler for at flette billederne til ét billede og konvertere det sammensatte billede til RGB for at gemme som en TIFF-fil.Når du har konverteret de sidste tre billeder på samme måde, skal du tælle de hvide celler, der er synlige i begyndelsen og afslutte sammensatte billeder. Og træk antallet af hvide celler i begyndelsen billedet fra antallet af hvide celler i slutter billedet. Perfusion af kapillærer belagt med ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, men ikke Isotype Fc kimærer med menneskelige PBMCs fører til markeret vedhæftning, når en af de tre adressins er til stede.I modsætning hertil fører hæmning af integrin addressin interaktioner ved hjælp af neutraliserende antistoffer typisk til et markant fald i dynamisk vedhæftning, der er fraværende, når isotype kontrol antistoffer tilsættes. Endvidere fører behandling af CD4 humane T-celler med specifikke chemokines til en øget vedhæftning til adressiner sammenlignet med ubehandlede humane celler. Mens du forsøger denne procedure, er det meget vigtigt at huske, at forskellige faktorer bidrager til dynamisk celle vedhæftning in vivo, der ikke helt kan opsummeres i denne analyse.Det er dog muligt at justere analysen for at behandle meget komplekse spørgsmål. For at løse yderligere spørgsmål om differentialvedhæftning adfærd testcelletyper, er det også muligt at udføre konkurrencedygtige vedhæftning assays med forskellige celletyper mærket med forskellige celle tracking farvestoffer. Efter sin udvikling, denne teknik gjorde det muligt for os at udforske virkningerne af de forskellige anti-integrin antistoffer, der anvendes eller i øjeblikket er under udvikling til behandling af inflammatoriske tarmsygdomme.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk Manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer til Functional Genomisk Analyse af<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human neutrofil strømningskammeret adhæsionsassay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Static adhæsionsassayet for Studiet af Integrin Aktivering i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikal Actin Flow i T-celler kvantificeret ved Spatio-temporale billede Korrelation spektroskopi af Struktureret Illumination Microscopy data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...