Name: dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Die Forschung von CN, IA, MFN und SZ wurde unterstützt durch das interdisziplinäre Zentrum für klinische Forschung (IZKF) und der ELAN-Programm der Universität Erlangen-Nürnberg, der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, der Fritz-Bender-Stiftung, die deutsche Morbus Crohn und Ulcerosa Foundation (DCCV), die klinische Forschung Gruppe CEDER von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das DFG-Thema-Programm auf Mikrobiota, Emerging-Feld-Initiative und die DFG Collaborative Research Centers 643, 796 und 1181.

In den folgenden Abschnitten beschriebenen Studien wurden nach Genehmigung der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
1. Vorbereitung der Kapillaren
<ol><li>Verbinden Sie rechteckige Kapillaren mit den Gummischlauch durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln.<...

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;4&#946;1+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn's+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo.">The &#945;4&#946;1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s.">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).</li><li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+ulcerative+colitis.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+Germany+Consortium+Vedolizumab+induction+therapy+for+inflammatory+bowel+disease+in+clinical+practice--a+nationwide+consecutive+German+cohort+study.">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li><li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience.">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li><li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MAdCAM+antibody+(PF-00547659)+for+ulcerative+colitis+(TURANDOT):+a+phase+2+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).</li><li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis.">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. 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Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit:+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1.">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).</li><li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. 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E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s.">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature.">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye &amp; Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li><li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation.">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li><li>Zundler, S., Neurath, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay.">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+&#945;E&#946;7+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8(+)+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo.">Blockade of &#945;E&#946;7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li></ol>

Das obige Protokoll beschreibt eine nützliche Technik, um dynamische Haftung der menschlichen Immunzellen zur endothelialen Liganden zu studieren. Durch Variation der beschichteten Liganden PERFUNDIERTEN Zelltypen oder Teilmengen, die Inkubation mit zusätzlichen Reize oder verschiedene neutralisierende Antikörper, es hat fast unbegrenzte Einsatzmöglichkeiten. Daher können solche dynamischen Adhäsion Assays nützlich sein, sowohl grundlegende Fragen der Grundlagenforschung sowie translational Abfragen, die helfen k?...

Zelle Bewegung ist ein streng regulierten Prozess unverzichtbar für die Entwicklung und Funktion der mehrzelligen Organismen, sondern ist auch in der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen1verwickelt. Homing Prozess der Immunzellen aus dem Blutstrom zu den peripheren Geweben hat vor kurzem, zunehmende Aufmerksamkeit gewonnen, da sie Nachschub und Ausbau der pathogene Zellen in entzündetem Gewebe bei immunologisch vermittelten Erkrankungen2 fördert ,3. Referenzfahrt ist insbesondere nachweislich, translationale Relevanz bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zu haben. Die therapeutische Anti-α4β7 Integrin Antikörper Vedolizumab Darm referenzieren stören hat Wirksamkeit gezeigt, in großen klinischen Studien4,5 und erfolgreich eingesetzt in der klinischen Praxis6,7 , 8. weitere Verbindungen sind wahrscheinlich9,10folgen. Ebenso ist der therapeutische Anti-α4-Integrin-Antikörper, Natalizumab, zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11verwendet.
Unsere funktionalen Verständnis des homing-Prozesses im allgemeinen und der Mechanismus der Wirkung solcher therapeutischer Antikörper ist insbesondere jedoch nach wie vor begrenzt. Es ist allgemein bekannt, dass Homing aus mehreren Schritten besteht, einschließlich der Zelle tethering und Walzen mit nachfolgenden Zelladhäsion, zur festen Festnahme gefolgt von Trans endotheliale Migration12,13. Die oben genannten Antikörper neutralisieren Integrine auf der Zelloberfläche, die Interaktion mit Addressins auf das Endothel der Gefäßwand zu verhindern. Dies ist gedacht, um feste Zelle Adhäsion14,15behindern. Allerdings sind wir erst am Anfang zu verstehen, die differenzierte Relevanz der spezifischen Integrine für Zelle Homing von eindeutigen Zelle Teilmengen. Darüber hinaus die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörper auf verschiedenen Zelle Teilmengen und Dosis-Wirkungs-Verbände sind weitgehend unbekannt, was zu viele offene Fragen auf dem Gebiet der Darm homing und Anti-Adhäsion Therapien in IBD.
Praktische Tools für solche Fragen sind daher dringend erforderlich. Die Wirkung von Anti-Integrin-Antikörper auf Integrin-Bearbeit Interaktion ist bisher überwiegend ausgewertet worden, durch die Beurteilung verbindliche Wirksamkeit/Bindung Hemmung mit Durchflusszytometrie oder durch statische Haftung Assays16,17 ,18,19,20, also mit scheinbaren Vereinfachung und Abweichung von der physiologischen Situation. Wir hat kürzlich einen dynamischen Adhäsion-Assay Integrin-abhängige Adhäsion von menschlichen Zellen, Addressins und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörpern unter Scherbelastung2studieren. Das Prinzip der Technik wurde früher mit Maus Zellen21,22nachgewiesen. Hier wurde es angepasst und entwickelt, um die oben genannten translatorische Fragen, Eröffnung neuartige Wege zum besseren Verständnis der Mechanismen der Therapie mit Anti-Integrin Antikörper in Vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-Well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin (BSA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20x2.00 mm ID, 50 mm length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>3520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL-2, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Rotixa 50 RS)</td>
			<td>Hettrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (TCS SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL-10, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA KE/9 ml Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc chimera isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1)</td>
			<td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG Isotype Control</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG isotype control</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6056-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natalizumab</td>
			<td>Biogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Counting chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-601000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182-10</td>
			<td>w/o Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-human CD18</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetts</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>553706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vedolizumab (Entyvio)</td>
			<td>Takeda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease

Darm-Homing von Immunzellen ist wichtig für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen (IBD). Integrin-abhängige Zelladhäsion, Addressins ist ein entscheidender Schritt in diesem Prozess und therapeutische Strategien stören Adhäsion haben erfolgreich etabliert. Der Anti-α4β7 Integrin Antikörper, Vedolizumab, dient der klinischen Behandlung von Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) und weitere Verbindungen sind wahrscheinlich folgen.
Die Einzelheiten des Verfahrens Adhäsion und Wirkungsmechanismen von Anti-Integrin-Antikörper sind in vielerlei Hinsicht aufgrund der begrenzten verfügbaren Techniken für die funktionelle Forschung in diesem Bereich noch unklar.
Hier präsentieren wir Ihnen eine dynamische Adhäsion-Assay für die funktionelle Analyse der menschlichen Zelle Adhäsion unter Strömungsverhältnisse und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Therapien im Rahmen der IBD. Es basiert auf die Perfusion der primären humanen Zellen durch Bearbeit-beschichtete ultradünnen Glaskapillaren mit mikroskopischen Analysen in Echtzeit. Der Test bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten für Verbesserungen und Modifikationen und Potenziale für die mechanistischen Entdeckungen und Translationale Anwendungen hält.

Die vorgestellte Methode in diesem Manuskript zielt darauf ab, die in Vivo -Prozess der menschlichen Zelle Adhäsion an der endothelialen Wand so nah wie möglich an funktionell simulieren bewerten Zelladhäsion und die Rolle der störende Antikörper. Daher sind ultradünne Kapillaren mit Addressins beschichtet und mit Gewebekulturen beschriftete menschliche Zellen mit einer Perfusion Pumpe durchströmt. Mit live Cell imaging das Anhaften von menschlichen Zellen, die Addressins ...

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Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselnotwendige Fragen der grundlegenden Immunbiologie und entzündlichen Darmerkrankungen Forschung in Bezug auf die Adhäsionskaskade von Immunzellen für homing zu peripheren Organen erforderlich zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein bequemer und unkomplizierter Ansatz ist, um funktionale Fragen im Kontext der Zellhaftung unter Strömungsbedingungen zu beantworten. Obwohl diese Methode für die Erforschung des Mechanismus der Zell poietischen Anti-Integrin-Antikörper bei entzündlichen Darmerkrankungen entwickelt wurde, Kann es modifiziert werden, um ähnliche Probleme in anderen entzündlichen Erkrankungen zu analysieren.Beginnen Sie, indem Sie ein Stück Gummischläuche auf einer Seite mit einer kleinen Schere dehnen, um das Einführen einer rechteckigen Kapillare etwa 0,5 Zentimeter in das Rohr zu ermöglichen. Dann versiegeln Sie die Verbindung mit Paraffinfolie. Beschichten Sie die Kapillare mit 20 Mikrolitern der Adressein von Interesse und versiegeln Sie die Seite, die nicht mit dem Schlauch verbunden ist, mit Kunststoffparaffinfolie für mindestens eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Kunststoff-Paraffinfolie entfernen und die Flüssigkeit aus der Kapillare auf ein Papiertuch einweichen lassen, um die Schläuche zu entleeren. Dann Kapillare mit 20 Mikroliter Blockierlösung für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius blockieren. Es ist sehr wichtig, die Blockierung direkt nach dem Entfernen der Beschichtung auf die Kapillare anzuwenden, um ein Austrocknen der Kapillare zu vermeiden, da dies die Funktionalität der kodierten Proteine beeinträchtigen kann.Während die Kapillare blockiert wird, fügen Sie 18 Milliliter antikoaguliertes Vollmenschliches Blut aus einer 50-Milliliter-Röhre hinzu und verdünnen Sie das Blut auf ein Gesamtvolumen von 35 Millilitern mit PBS. Schicht 10 Milliliter Dichte Gradient medium unter der Blutlösung und isolieren die peripheren Blut mononukleären Blutzellen durch Dichte Gradient Zentrifugation. Übertragen Sie am Ende der Trennung die peripheren mononukleären Blutzellen von der Schnittstelle des Dichtegradientenmediums auf eine neue 50-Milliliter-Röhre.Und bringen Sie das Gesamtvolumen in der Röhre auf bis zu 50 Milliliter mit frischem PBS. Nach der Zentrifugation das Pellet in 10 Millilitern frischer PBS zum Zählen und Färben der Zellen mit einem geeigneten Zellverfolgungsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder aufsetzen. Am Ende der Färbeininkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet 1,5 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter vollständiger RPMI-Mittlerer Konzentration wieder aufsetzen.Dann säen Sie einen Milliliter Zellen in so viele Brunnen einer 48-Well-Platte, wie es Bedingungen gibt. Und fügen Sie das entsprechende Volumen an Anti-Integrin-Antikörper in die entsprechenden Brunnen für eine eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie als Nächstes eine P1000 Pipette, um die Zellen mehrmals wieder aufzuhängen, bevor die Zellen in einzelne Zwei-Milliliter-Röhren übertragen werden.Spülen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter PBS und bündeln Sie die Waschungen in den entsprechenden zwei Milliliter-Röhren. Nach dem Zählen pellet die Zellen durch Zentrifugation und resuspened die Zellen in der entsprechenden Volumen des Haftpuffers, um 1,5 mal zehn bis die sechsten Zellen pro Milliliter Suspensionen zu erhalten. Dann fügen Sie das entsprechende Volumen von Manganchlorid zu jedem Rohr zu einer millimolaren Endkonzentration hinzu.Wenn die Zellen bereit sind, schalten Sie das Mikroskop ein und wählen Sie die entsprechenden Filter und Laser, objektiv und Erfassungsmodus. Entfernen Sie die Kunststoff-Paraffinfolie von der Spitze der Kapillare und verwenden Sie eine Schere, um ein fünf Zentimeter großes Stück Gummischläuche zu dehnen, damit die Kapillare mit dem kleineren Rohr verbunden werden kann. Versiegeln Sie die Verbindung zwischen kapillarund dem Rohr mit Einer Kunststoffparaffinfolie.Und montieren Sie die Kapillare auf einer Befestigungsschale. Legen Sie das Fach auf den Schalenhalter des Mikroskops, damit die Kapillare im Fokus steht. Und setzen Sie den Gummischlauch in die entsprechende Kerbe der Peristaltikpumpe ein.Legen Sie das unbefestigte Ende des Schlauches in das erste Probenrohr, das die Zellsuspension enthält. Und legen Sie das kurze Rohr auf der anderen Seite der Kapillare in ein 15-Milliliter-Rohr, um den Durchfluss zu sammeln. Lassen Sie die Schläuche mit einem Durchfluss von 500 Mikrolitern pro Minute füllen, bis die Zellsuspension fast die Kapillare erreicht.Dann lassen Sie die Kapillare mit einer Durchflussrate von 100 Mikroliter pro Minute füllen. Wenn die Kapillare mit Zellen gefüllt ist, passen Sie die Durchflussrate auf 10 Mikroliter pro Minute an und erfassen Sie Zeitrafferbilder der Zellen, die sich alle zwei Sekunden für insgesamt drei Minuten langsam durch die Kapillare entlang der Innenseite der Adresswand bewegen. Sobald die Zellsuspension das Innere der Kapillare erreicht, ist es wichtig, jede Unterbrechung des Flusses zu vermeiden, da dies zu statischen Integrin-Adressin-Interaktionen führt, die die Messung möglicherweise verzerrt.Vor dem Entsorgen streamen Sie die gesamte Kapillare durch das Okular des Mikroskops, um sicherzustellen, dass der auf dem Bildschirm beobachtete Abschnitt repräsentativ ist. Befreien Sie die Schläuche von der Pumpe und lassen Sie die verbleibende Flüssigkeit wieder in das Zwei-Milliliter-Rohr laufen. Trennen Sie dann die Kapillare und den Schlauch von der Befestigungsschale und stellen Sie die nächste Kapillare ab, wie gerade gezeigt.Um die Zeitrafferaufzeichnungen auszuwerten, öffnen Sie die erste Sequenz in der entsprechenden Analysesoftware und exportieren Sie die ersten und letzten drei Bilder als TIFF-Dateien. Öffnen Sie die drei Anfangsbilder in ImageJ, und wählen Sie Bild, Typ und 32-Bit aus, um die Bilder in 32-Bit zu konvertieren. Wählen Sie dann Bild-, Farb- und Zusammenführungskanäle aus, um die Bilder in einem Bild zusammenzuführen, und konvertieren Sie das zusammengesetzte Bild in RGB, um es als TIFF-Datei zu speichern.Nachdem Sie die letzten drei Bilder auf die gleiche Weise konvertiert haben, zählen Sie die weißen Felder, die am Anfang und am Ende der zusammengesetzten Bilder sichtbar sind. Und subtrahieren Sie die Anzahl der weißen Felder im Anfangsbild von der Anzahl der weißen Felder im Endbild. Die Perfusion von Kapillaren, die mit ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, aber nicht isotype Fc chimäre mit menschlichen PBMCs beschichtet sind, führt zu einer ausgeprägten Haftung, wenn eine der drei Adressen vorhanden ist.Im Gegensatz dazu führt die Hemmung von Integrin-Adressin-Wechselwirkungen mit neutralisierenden Antikörpern in der Regel zu einer deutlichen Abnahme der dynamischen Haftung, die fehlt, wenn Isotyp-Kontrollantikörper hinzugefügt werden. Darüber hinaus führt die Behandlung von CD4-Human-T-Zellen mit spezifischen Chemokinen zu einer erhöhten Haftung an Adressen im Vergleich zu unbehandelten menschlichen Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass verschiedene Faktoren zur dynamischen Zellhaftung in vivo beitragen, die in diesem Test nicht vollständig rekapituliert werden kann.Es ist jedoch möglich, den Test so anzupassen, dass er sehr komplexe Fragen anspricht. Um zusätzliche Fragen zum Differenzhaftverhalten von Testzelltypen zu beantworten, ist es auch möglich, kompetitive Adhäsionstests mit verschiedenen Zelltypen durchzuführen, die mit verschiedenen Zelltracking-Farbstoffen gekennzeichnet sind. Nach seiner Entwicklung ermöglichte uns diese Technik, die Auswirkungen der verschiedenen Anti-Integrin-Antikörper zu erforschen, die für die Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen verwendet werden oder sich derzeit in der Entwicklung befinden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

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Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

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Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...