Name: dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

המחקר של CN, IA, מחוברים MFN SZ נתמך על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF), תוכנית ELAN את אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג, Kröner-Fresenius-Stiftung אחר, פריץ-בנדר-Stiftung, קרוהן, גרמנית ו קוליטיס קרן (DCCV), טופס קבוצת מחקר קליני של הגרמנית למחקר המועצה (DFG), התוכנית נושא DFG על Microbiota, היוזמה שדה המתעוררים את DFG שיתופי מחקר מרכזי 643, 796 and 1181.

המחקרים שתוארו בסעיפים הבאים בוצעו על פי אישור של ועדת האתיקה של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר ארלנגן-נירנברג.
1. הכנת נימים
<ol><li>להתחבר נימים מלבני לאורך צינור גומי על ידי מתיחה לאורך צינור בצד אחד עם מספריים קטנות והכנסת בקפידה את נימי (כ 0.5 ס מ) לתוך הצינור. חותם את הקשר בין נ?...

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;4&#946;1+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn's+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo.">The &#945;4&#946;1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s.">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).</li><li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+ulcerative+colitis.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+Germany+Consortium+Vedolizumab+induction+therapy+for+inflammatory+bowel+disease+in+clinical+practice--a+nationwide+consecutive+German+cohort+study.">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li><li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience.">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li><li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MAdCAM+antibody+(PF-00547659)+for+ulcerative+colitis+(TURANDOT):+a+phase+2+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).</li><li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis.">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-based+therapeutics:+biological+basis,+clinical+use+and+new+drugs.">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li><li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes.">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+&#945;4&#946;7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of &#945;4&#946;7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li><li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab.">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit:+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1.">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).</li><li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab,+an+Anti-&#945;4&#946;7+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-&#945;4&#946;7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li><li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis:+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study.">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li><li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis,+Calcium+Flux,+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells.">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin.">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+MRP8/14+is+a+regulator+of+&#946;2+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion.">Extracellular MRP8/14 is a regulator of &#946;2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s.">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature.">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye &amp; Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li><li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation.">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li><li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders.">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li><li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects.">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li><li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay.">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+&#945;E&#946;7+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8(+)+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo.">Blockade of &#945;E&#946;7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול הנ ל מתאר טכניקה שימושית ללמוד אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים אנושי כדי ליגנדים אנדותל. דרך וריאציה על ליגנדים מצופה, סוגי תאים perfused או קבוצות משנה, דגירה עם גירויים נוספים או נטרול נוגדנים שונים, הוא כמעט בלתי מוגבל של יישומים אפשריים. לכן, מבחני אדהזיה דינמי כזה עשוי להיות שימוש?...

תא תנועה הוא תהליך מוסדר בחוזקה לארגונה ההתפתחות והתפקוד של אורגניזמים רב תאית, אך הוא גם מעורב בפתוגנזה של שפע של מחלות1. לאחרונה, תהליך הביות של תאים חיסוניים של זרם הדם אל רקמות היקפיים צברה תשומת לב גדלה והולכת, מאז היא תורמת חידוש מלאי והרחבה של תאים פתוגניים ברקמות דלקתי במחלות immunologically בתיווך2 ,3. בפרט, יונת הוכח שיש רלוונטיות translational במחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). טיפולי אנטי-α4β7 אינטגרין נוגדן vedolizumab הפרעה המעיים יונת הראה יעילות בניסויים קליניים גדולים4,5 , נעשה בהצלחה בעולם האמיתי הקלינית6,7 , 8. תרכובות נוסף נוטים לעקוב אחר9,10. באופן דומה, הנוגדן אינטגרין טיפולי אנטי-α4, natalizumab, משמשת לטיפול של טרשת נפוצה (MS)11.
אולם, שלנו פונקציונלי להבנת תהליך הביות באופן כללי, מנגנון הפעולה של נוגדנים טיפולית כזה בפרט הוא עדיין מוגבל. היא מבוססת היטב כי יונת כוללת מספר שלבים לרבות תא tethering, מתגלגל עם תא עוקבות אדהזיה שמוביל המשרד מעצר ואחריו טרנס ההעברה אנדותל12,13. הנוגדנים הנ ל לנטרל אינטגרינים על פני התא מניעת אינטראקציה עם addressins על אנדותל של הקיר כלי. זה נחשב לעכב תא המשרד אדהזיה14,15. ובכל זאת, אנו רק מתחילים להבין את הרלוונטיות דיפרנציאלית של אינטגרינים ספציפי עבור תא אירוח של קבוצות משנה נפרדות תא. יתר על כן, ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין על שונים תא קבוצות משנה ואינם שיוכים מנה-תגובה במידה רבה ידועים שמוביל המון שאלות פתוחות בתחום של טיפולים ביות והצמדות אנטי-בטן ב מחלת המעי הדלקתי.
לכן, כלי עבודה נוחים כדי לטפל שאלות כאלה יש צורך נואשות. ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין על האינטראקציה addressin-אינטגרין עד כה בעיקר יוערכו על-ידי הערכת יעילות/איגוד מחייב עיכוב עם cytometry זרימה או דרך הידבקות סטטית מבחני16,17 ,18,19,20, ובכך עם פישוט לכאורה, סטייה במצב פיזיולוגי. לאחרונה הקמנו assay אדהזיה דינמי ללמוד תלויי-אינטגרין הידבקות של תאים אנושיים כדי addressins ואת ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין תחת גזירה2. העיקרון של הטכניקה הוכח מקודם עם העכבר תאים21,22. . כאן, זה היה הותאם ופיתח להתייחס אל כל השאלות translational שהוזכרו לעיל, הפתיחה השדרות רומן טוב יותר להבין את המנגנונים של טיפול עם אנטי-אינטגרין נוגדנים ויוו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-Well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin (BSA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20x2.00 mm ID, 50 mm length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>3520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL-2, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Rotixa 50 RS)</td>
			<td>Hettrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (TCS SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL-10, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA KE/9 ml Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc chimera isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1)</td>
			<td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG Isotype Control</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG isotype control</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6056-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natalizumab</td>
			<td>Biogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Counting chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-601000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182-10</td>
			<td>w/o Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-human CD18</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetts</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>553706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vedolizumab (Entyvio)</td>
			<td>Takeda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease

יונת הבטן של תאים חיסוניים חשוב בפתוגנזה של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). אינטגרין תלויית התא הדבקה על addressins שלב חיוני בתהליך זה, אסטרטגיות טיפוליות המפריעים אדהזיה הוקמו בהצלחה. הנוגדן אינטגרין anti-α4β7, vedolizumab, משמשת לטיפול קליני של מחלת קרוהן (CD) ו קוליטיס (UC) ותרכובות נוספות נוטים לעקוב.
הפרטים של ההליך אדהזיה ו את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-אינטגרין עדיין אינם ברורים בנוגע רבים בשל השיטות הזמינות מוגבל לחקר תפקודית בתחום זה.
כאן, אנו מציגים וזמינותו אדהזיה דינמי עבור ניתוח תפקודי של התא האנושי אדהזיה תחת תנאי זרימה וההשפעה של טיפולים אנטי-אינטגרין בהקשר של מחלת המעי הדלקתי. הוא מבוסס על זלוף תאים אנושיים הראשי דרך נימים addressin מצופה זכוכית ודק במיוחד עם ניתוח מיקרוסקופי בזמן אמת. וזמינותו מציע מגוון רחב של הזדמנויות עבור ליטושים והשינויים ומחזיק פוטנציאל תגליות מכניסטית ויישומים translational.

השיטה המובאת כתב יד זה שואף לדמות התהליך ויוו של התא האנושי אדהזיה לקיר אנדותל פונקציונלית ככל האפשר כדי להעריך תא אדהזיה ואת התפקיד של נוגדנים מפריעות. לכן, נימים זגוגית מצופה addressins, perfused עם תאים אנושיים fluorescently שכותרתו עניין באמצעות משאבה זלוף. ניתן לצפות באמצעות ת...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של אימונוביולוגיה בסיסית ומחקר מחלות מעי דלקתיות לגבי מפל ההיתוך של תאים חיסוניים הנדרשים עבור ביות לאיברים היקפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא גישה נוחה וישירה לענות על שאלות פונקציונליות בהקשר של הידבקות בתא בתנאי זרימה. למרות שיטה זו פותחה לחקר המנגנון של נוגדנים אנטי אונטגרין פואטי תא במחלות מעי דלקתיות, זה יכול להיות שונה כדי לנתח בעיות דומות בהגדרות מחלות דלקתיות אחרות.התחל על ידי מתיחת חתיכת צינורות גומי בצד אחד עם מספריים קטנים כדי לאפשר החדרת נימי מלבני כ 0.5 ס"מ לתוך הצינור. ואז לאטום את הקשר עם סרט פרפין. מצפים את נימי עם 20 microliters של כתובת עניין ולאטום את הצד לא מחובר צינורות עם סרט פרפין פלסטיק לפחות שעה אחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, להסיר את הסרט פרפין פלסטיק ולתת את הנוזל להשרות מתוך נימי על מגבת נייר כדי לרוקן את הצינורות. ואז לחסום נימי עם 20 microliters של פתרון חסימה לפחות שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד להחיל את החסימה על נימי ישירות לאחר הסרת הציפוי, כדי למנוע ייבוש של נימי כמו זה עלול לפגוע בפונקציונליות של חלבונים מקודד.בעוד נימי נחסם, להוסיף 18 מיליליטר של דם אנושי שלם נוגד קרישה מצינור 50 מיליליטר לדלל את הדם לנפח כולל של 35 מיליליטר עם PBS. שכבה 10 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות תחת ת פתרון הדם ולבודד את תאי הדם מונונוקלאריים בדם ההיקפיים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בסוף ההפרדה, להעביר את התאים mononuclear הדם ההיקפיים מהממשק של מדיום שיפוע צפיפות לצינור חדש 50 מיליליטר.ולהביא את הנפח הכולל בצינור עד 50 מיליליטר עם PBS טרי. לאחר צנטריפוגה, להשתמש מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של PBS טרי לספירה ולהכתים את התאים עם צבע מעקב תא מתאים על פי הוראות היצרן. בסוף הדגירה מכתים, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend את גלולה ב 1.5 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני RPMI מלא.ואז לזרוע מיליליטר אחד של תאים לתוך כמו בארות רבות של צלחת 48 גם כמו שיש תנאים. ותוסיפו את הנפח המתאים של נוגדן אנטי-אונטגרין ל בארות המתאימות לשעה אחת של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש פיפטה P1000 כדי לנצל מחדש את התאים מספר פעמים לפני העברת התאים לתוך צינורות בודדים שני מיליליטר.לשטוף כל היטב עם מיליליטר אחד של PBS ול בריכה את לשטוף את הצינורות המתאימים שני מיליליטר. לאחר הספירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspened התאים בנפח המתאים של חיץ הידבקות כדי להשיג 1.5 פעמים עשר לתאים השישי לכל מתלים מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים את הנפח המתאים של כלוריד מנגן לכל צינור לריכוז סופי מילימולר אחד.כאשר התאים מוכנים, הפעל את המיקרוסקופ ובחר את המסננים והלייזרים המתאימים, מצב מטרה ורכישה. הסר את סרט הפרפין מפלסטיק מה קצה הנימים ולהשתמש במספריים כדי למתוח חתיכה של חמישה סנטימטרים של צינורות גומי כדי לאפשר נימי להיות מחובר לצינור קטן יותר. לאטום את הקשר בין נימי הצינור עם סרט פרפין פלסטיק.ולהוות את נימי על מגש קיבעון. מניחים את המגש על מחזיק המגש של המיקרוסקופ כך נימי הוא בפוקוס. ולהכניס את צינורות הגומי לתוך הרץ המתאים של המשאבה peristaltic.מניחים את הקצה הלא מחובר של הצינור לתוך צינור הדגימה הראשון המכיל את ההשעיה התא. ולהכניס את הצינור הקצר בצד השני של נימי לתוך צינור 15 מיליליטר כדי לאסוף זרימה דרך. תן צינורות למלא בקצב זרימה של 500 microliters לדקה עד ההשעיה התא כמעט מגיע נימי.ואז לתת את המילוי נימי בקצב זרימה של 100 microliters לדקה. כאשר נימי מלא בתאים, להתאים את קצב הזרימה ל 10 microliters לדקה וללכוד זמן לשגות תמונות של התאים נעים לאט דרך נימי לאורך החלק הפנימי של הקיר מצופה addressin כל שתי שניות במשך שלוש דקות בסך הכל. ברגע ההשעיה התא מגיע החלק הפנימי של נימי, זה קריטי כדי למנוע כל הפרעה של הזרימה כמו זה יוביל אינטראקציה סטטית integrin addressin פוטנציאל הטיה המדידה.לפני השלכת זרם נימי שלם דרך העין של המיקרוסקופ כדי לוודא כי החלק שנצפה על המסך מייצג. שחררו את הצינורות מהמשאבה ותנו לנוזל הנותר לרוץ חזרה לצינור שני המיליליטר. לאחר מכן נתק את נימי ואת צינורות ממגש קיבעון ותמונה נימי הבא כפי שהודגם רק.כדי להעריך את הקלטות לשגות זמן, לפתוח את הרצף הראשון בתוכנת הניתוח המתאימה ולייצא את שלוש התמונות הראשונות והאחרונה כקבצי TIFF. פתחו את שלוש התמונות הראשונות ב-ImageJ ובחרו תמונה, כתב ו- 32 סיביות להמרת התמונות ל- 32 סיביות. לאחר מכן בחרו תמונה, צבעו ומזגו ערוצים כדי למזג את התמונות לתמונה אחת ולהמיר את התמונה ללא הפרדות צבע ל-RGB לשמירה כקובץ TIFF.לאחר המרת שלוש התמונות האחרונות באותו אופן, לספור את התאים הלבנים גלויים בהתחלה וסיום תמונות ללא הפרדות צבע. וחסיר את מספר התאים הלבנים בתמונה המתחילים ממספר התאים הלבנים בתמונה המסתיימת. זירוז של נימים מצופה ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, אבל לא Isotype Fc כימרה עם PBMCs אנושי מוביל הידבקות מסומנת כאשר אחד משלושת addressins קיים.לעומת זאת, עיכוב של אינטראקציות integrin addressin באמצעות נוגדנים נטרול בדרך כלל מוביל לירידה ניכרת של הידבקות דינמית כי הוא נעדר כאשר נוגדנים בקרת isotype מתווספים. יתר על כן, טיפול בתאי T אנושיים CD4 עם כימוקינים ספציפיים מוביל הידבקות מוגברת addressins לעומת תאים אנושיים מטופלים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור כי גורמים שונים תורמים הידבקות תאים דינמית ב vivo כי לא ניתן לכבוש מחדש לחלוטין בהכנעה זו.עם זאת, ניתן להתאים את ההתכווננות כדי לענות על שאלות מורכבות מאוד. על מנת לענות על שאלות נוספות על התנהגות הידבקות דיפרנציאלית של בדיקת סוגי תאים, ניתן גם לבצע בדיקות הידבקות תחרותיות עם סוגי תאים שונים המסווים בצבעי מעקב תאים שונים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו אפשרה לנו לחקור את ההשפעות של נוגדנים אנטי אונטגרין שונים המשמשים או נמצאים כעת בפיתוח לטיפול במחלות מעי דלקתיות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...