Name: dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

CN, アイオワ、MFN と SZ の研究臨床研究 (IZKF) のエアランゲン ・ ニュルンベルグ大学他 Kröner フレゼニウス財団、フリッツ ・ ベンダー財団、ドイツ Crohn のエラン プログラム学際センターに支えられ、大腸炎財団 (DCCV) が臨床研究グループ杉ドイツ研究議会 (DFG)、細菌叢、フィールドの新たなイニシアチブ、DFG 共同研究センター 643, 796 と 1181 DFG トピック プログラムの。

次のセクションで説明した研究は、フリードリヒ ・ アレクサンダー大学エアランゲン-ニュルンベルグの倫理委員会の承認に従ってなされています。
1. 毛細血管の準備
<ol><li>小さなハサミで一側のチューブを伸ばし、慎重に毛細血管 (約 0.5 cm) をチューブに挿入によって長方形の毛細血管をゴム管に接続します。毛細血管とプラスチック パラフィン フィルム チューブ?...

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;4&#946;1+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn's+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo.">The &#945;4&#946;1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s.">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).</li><li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+ulcerative+colitis.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+Germany+Consortium+Vedolizumab+induction+therapy+for+inflammatory+bowel+disease+in+clinical+practice--a+nationwide+consecutive+German+cohort+study.">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li><li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience.">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li><li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MAdCAM+antibody+(PF-00547659)+for+ulcerative+colitis+(TURANDOT):+a+phase+2+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).</li><li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis.">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-based+therapeutics:+biological+basis,+clinical+use+and+new+drugs.">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li><li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes.">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+&#945;4&#946;7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of &#945;4&#946;7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li><li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab.">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit:+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1.">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).</li><li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab,+an+Anti-&#945;4&#946;7+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-&#945;4&#946;7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li><li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis:+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study.">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li><li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis,+Calcium+Flux,+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells.">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin.">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+MRP8/14+is+a+regulator+of+&#946;2+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion.">Extracellular MRP8/14 is a regulator of &#946;2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s.">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature.">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye &amp; Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li><li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation.">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li><li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders.">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li><li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects.">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li><li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay.">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+&#945;E&#946;7+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8(+)+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo.">Blockade of &#945;E&#946;7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li></ol>

上記のプロトコルでは、内皮細胞リガンドに人間の免疫細胞の動的接着を研究する有用な手法について説明します。コーティングされた配位子、灌流セルタイプまたはサブセット、追加刺激または異なる中和抗体の孵化の変化を通じてそれがほぼ無制限の潜在的なアプリケーション。したがって、このような動的接着アッセイを開発し、接着プロセスと干渉する薬剤と臨床治療を最適化に役?...

細胞運動は堅く調整されたプロセスの開発と多細胞生物の機能に不可欠なのですが、疾患1の多数の発症にも関与しています。最近では、末梢の組織に血流から免疫細胞のホーミング過程注目を集めて増加、以来、補給と免疫学的疾患2 の炎症組織における病原性細胞の拡大に貢献 ,3。特に、ホーミングは、炎症性腸疾患 (IBD) の並進運動の関連性を持っている示されています。腸ホーミング干渉治療抗 α4β7 インテグリン抗体 vedolizumab 大規模臨床試験4,5で効力を示したし、リアルな実習6,7で正常に使用されています,8します。 それ以上の化合物が9,10をたどる可能性が高い。同様に、示す間、natalizumab、治療抗 α4 インテグリン抗体は多発性硬化症 (MS)11の治療に使用されます。
しかし、一般的にホーミング過程の機能理解とそのような抗体医薬の作用機序特にはまだ限られています。それ、定着してホーミングは携帯のテザリングとトランス内皮移行12,13続いて事務所の逮捕に至るその後の細胞接着とローリングなどを含むいくつかの手順で構成されています。上記の抗体は、血管壁の内皮細胞上の addressins との相互作用を防止する細胞表面のインテグリンを中和します。これはしっかりした細胞接着14,15を妨げると考えられます。まだ、我々 はのみ特定インテグリンの細胞のサブセットの細胞のホーミングの差分の関連性を理解し始めています。また、別に及ぼす抗インテグリン抗体細胞サブセット、用量反応の関連付けが IBD の腸ホーミングと癒着防止療法の分野でオープンな質問の多くにつながる主に知られています。
したがって、このような質問に対処するための便利なツールは必死に必要とします。インテグリン アドレスを持つ相互作用に及ぼす抗インテグリン抗体が結合効果/結合阻害フローサイトメトリーまたは静的接着アッセイ16,17 までを評価することによって主に評価されたところ、18,19、20、従って明白な簡素化と生理学的な状況からの偏差。最近、addressins にひと細胞のインテグリン依存付着とせん断応力2抗インテグリン抗体の効果を研究する動的接着アッセイを設立しました。技術の原理は以前マウス細胞21,22で実証されています。ここでは、適応され、上記の並進の質問に対処する開発、開口部より新規道療法抗インテグリン抗体は体内のメカニズムを理解します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-Well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin (BSA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20x2.00 mm ID, 50 mm length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>3520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL-2, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Rotixa 50 RS)</td>
			<td>Hettrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (TCS SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL-10, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA KE/9 ml Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc chimera isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1)</td>
			<td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG Isotype Control</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG isotype control</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6056-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natalizumab</td>
			<td>Biogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Counting chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-601000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182-10</td>
			<td>w/o Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-human CD18</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetts</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>553706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vedolizumab (Entyvio)</td>
			<td>Takeda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease

腸の免疫細胞のホーミングは、炎症性腸疾患 (IBD) の病因のために重要です。Addressins インテグリン依存性細胞接着はこのプロセスの重要なステップと接着を妨げる治療戦略が確立されました。Vedolizumab、反 α4β7 インテグリン抗体はクローン病 (CD) の臨床治療に使用されて、潰瘍性大腸炎 (UC) やさらに化合物に従う可能性があります。
接着手順の詳細と抗インテグリン抗体の作用機構はこの分野の機能研究の限られた利用可能な技術のための多くの点でまだ不明。
IBD のコンテキストのフロー条件の下でひと細胞接着の機能解析と抗インテグリン療法の影響の動的接着アッセイを紹介します。それはリアルタイムの微視的解析とのアドレスを持つ極薄ガラス毛細血管を通じてひと初代細胞の灌流に基づいています。アッセイは、さまざまな改良と変更のための機会を提供しています、機構の発見と医療応用のためのポテンシャルを保持します。

提示法細胞接着と干渉している抗体の役割この原稿で機能的にできるだけ密接に人間細胞接着内皮壁体内プロセスをシミュレートすることを目的を評価します。したがって、極薄の毛細血管は addressins でコーティング、灌流ポンプを使用して興味の蛍光に分類されたひと細胞の灌流します。生細胞イメージング、addressins にひと細胞の接着を使用しては、リア?...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in vitroアッセイ抗インテグリン抗体、ケモカインやその他の要因の影響分析のためのプロトコルを紹介します。

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

この方法は、末梢器官へのホーミングに必要な免疫細胞の接着カスケードに関する基礎免疫生物学および炎症性腸疾患研究の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、フロー条件下での細胞接着のコンテキストで機能的な質問に答える便利でわかりやすいアプローチであるということです。この方法は炎症性腸疾患における細胞ポワチン抗インテグリン抗体のメカニズムを探索するために開発されたが、他の炎症性疾患の設定で同様の問題を分析するために変更することができる。小さいはさみで片側にゴム製のチューブを伸ばし、管に約0.5センチメートルの長方形の毛細管を挿入できるようにすることから始めます。その後、パラフィンフィルムとの接続をシールします。目的のアドレス20マイクロリットルでキャピラリーをコーティングし、37°Cで少なくとも1時間インキュベーションのプラスチックパラフィンフィルムでチューブに接続されていない側を密封します。インキュベーションの最後に、プラスチックパラフィンフィルムを取り出し、液体をキャピラリーからペーパータオルに浸してチューブを空にします。その後、37°Cで少なくとも1時間、20マイクロリットルのブロッキング溶液でキャピラリーをブロックします。コード化されたタンパク質の機能性を損なう可能性があるため、コーティングを取り除いた直後に毛細管にブロッキングを適用することが非常に重要です。毛細血管がブロックされている間に、 50 ミリリットルチューブから抗凝固全人間の血液 18 ミリリットルを加え、PBS で合計 35 ミリリットルの血液を希釈します。血液溶液下の密度勾配培地の層10ミリリットルを、密度勾配遠心分離によって末梢血単核血球を単離する。分離の終わりに、末梢血単核細胞を密度勾配媒体の界面から新しい50ミリリットルチューブに移す。そして、新鮮なPBSで50ミリリットルまでのチューブ内の総体積を持って来ます。遠心分離後、ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSでカウントし、メーカーの指示に従って適切な細胞追跡染料で細胞を染色します。染色インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、完全なRPMI培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に1.5倍10回でペレットを再懸濁する。その後、条件がある48ウェルプレートの多くの井戸に細胞の1ミリリットルを播種します。そして、37°Cで1時間インキュベーションのために適切なウェルに抗インテグリン抗体の適切な量を追加します。次に、P1000ピペットを使用して細胞を数回再懸濁してから、細胞を個々の2ミリリットルチューブに移します。PBSを1ミリリットルずつよくすすい、適切な2ミリリットルのチューブにスリーチをプールします。カウント後、ペレット細胞を遠心分離し、適切な量の接着バッファーで細胞をリサスペンし、ミリリットル懸濁液当たり10〜6番目の細胞を1.5倍得た。次に、適切な量の塩化マンガンを各チューブに1ミリモルの最終濃度に加えます。細胞の準備ができたら、顕微鏡をオンにし、適切なフィルターとレーザー、目的および取得モードを選択します。毛細血管の先端からプラスチックパラフィンフィルムを取り出し、毛細血管を小さなチューブに接続できるように、はさみを使用して5センチメートルのゴムチューブを伸ばします。毛細管とチューブの間の接続をプラスチックパラフィンフィルムで密封します。そして、固定トレイに毛細血管を取り付けます。毛細管が焦点を合わせるように、顕微鏡のトレイホルダーにトレイを置きます。そして、ゴムチューブを蠕動ポンプの対応するノッチに挿入します。チューブの未接続の端部を、細胞懸濁液を含む最初のサンプルチューブに入れる。そして、毛細血管の反対側の短いチューブを15ミリリットルのチューブに挿入して、流れを収集します。細胞懸濁液がキャピラリーに近くなるまで、チューブを毎分500マイクロリットルの流量で満たします。次に、1分間に100マイクロリットルの流量で毛細管を充填させます。毛細血管が細胞で満たされたら、流量を毎分10マイクロリットルに調整し、2秒ごとにアコティンコーティングされた壁の内側に沿って毛細血管をゆっくりと移動する細胞のタイムラプス画像を合計3分間キャプチャします。細胞懸濁液が毛細管の内側に達すると、静的インテグリンアカテイン相互作用が測定に偏る可能性を招く可能性を招くため、フローの中断を避けるのが重要です。マイクロスコープの接眼部を通して毛細管全体を廃棄する前に、画面で観察されたセクションが代表的であることを確認する。ポンプからチューブを解放し、残りの流体を2ミリリットルチューブに戻します。次に、キャピラリーとチューブを固定トレイから取り外し、ちょうど実証したように次の毛細管を画像化します。タイムラプスの記録を評価するには、適切な解析ソフトウェアの最初のシーケンスを開き、最初と最後の3つの画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。ImageJ で 3 つの開始イメージを開き、イメージ、タイプ、および 32 ビットを選択して、イメージを 32 ビットに変換します。次に、画像、カラー、およびマージチャネルを選択して画像を1つの画像にマージし、合成画像をRGBに変換してTIFFファイルとして保存します。最後の 3 つの画像を同じ方法で変換した後、合成画像の先頭と末尾に表示される白いセルを数えます。終了画像の白いセルの数から、開始画像の白いセルの数を減算します。ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1でコーティングされた毛細血管の灌流は、人間のPBMCを有するイソタイプFcキメラではないが、3つのアカチンのいずれかが存在すると顕著な接着をもたらす。対照的に、中和抗体を用いたインテグリン・アカテニン相互作用の阻害は、典型的には、アイソタイプ対照抗体が添加された場合に存在しない動的接着の著しい減少をもたらす。さらに、特定のケモカインを有するCD4ヒトT細胞の治療は、未治療のヒト細胞と比較してアカチンへの接着性の増加をもたらす。この手順を試みる間、このアッセイでは完全に再現できない生体内の動的細胞接着に様々な要因が寄与することを覚えておくことは非常に重要です。しかし、非常に複雑な質問に対処するためにアッセイを調整することが可能です。試験細胞タイプの差付着挙動に関する追加の質問に対処するために、異なる細胞追跡色素で標識された異なる細胞タイプで競合接着アッセイを行うことも可能である。その開発後、この技術は、炎症性腸疾患の治療のために使用または現在開発中の異なる抗インテグリン抗体の効果を探求することを可能にしました。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...