Name: dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Araştırma CN, IA, MFN ve SZ klinik araştırma (IZKF) ve Erlangen-Nürnberg Üniversitesi, başka Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, Alman Crohn ELAN programı için disiplinlerarası Center tarafından desteklendi ve Kolit Vakfı (DCCV), klinik araştırma grubu CEDER, Alman Araştırma Konseyi (DFG), DFG konu programın Microbiota, ortaya çıkan alan girişimi ve DFG işbirlikçi araştırma merkezleri 643, 796 ve 1181.

Aşağıdaki bölümlerde açıklanan çalışmalar Etik Komitesi Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg onayı göre gerçekleştirilmiş.
1. kılcal hazırlanması
<ol><li>Dikdörtgen kılcal tüp bir tarafta küçük makasla germe ve dikkatle (yaklaşık 0.5 cm) kılcal tüp içine ekleme tarafından alıpkendi için bağlayın. Kılcal boru plastik parafin film arasındaki bağlantıyı kapatın.</li>
	<li>İsteyebileğinizi (rekombinant Fc chimera; 5 µg/isteyebileğinizi,...

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;4&#946;1+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn's+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo.">The &#945;4&#946;1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s.">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).</li><li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+ulcerative+colitis.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+Germany+Consortium+Vedolizumab+induction+therapy+for+inflammatory+bowel+disease+in+clinical+practice--a+nationwide+consecutive+German+cohort+study.">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology &amp; Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li><li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience.">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li><li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-MAdCAM+antibody+(PF-00547659)+for+ulcerative+colitis+(TURANDOT):+a+phase+2+randomised,+double-blind,+placebo-controlled+trial.">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).</li><li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis.">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-based+therapeutics:+biological+basis,+clinical+use+and+new+drugs.">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li><li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes.">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+&#945;4&#946;7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of &#945;4&#946;7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li><li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab.">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit:+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1.">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).</li><li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab,+an+Anti-&#945;4&#946;7+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases.">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-&#945;4&#946;7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li><li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis:+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study.">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li><li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis,+Calcium+Flux,+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells.">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li><li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin.">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+MRP8/14+is+a+regulator+of+&#946;2+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion.">Extracellular MRP8/14 is a regulator of &#946;2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li><li>Binder, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s.">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature.">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye &amp; Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li><li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation.">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li><li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders.">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li><li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects.">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li><li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay.">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+&#945;E&#946;7+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8(+)+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo.">Blockade of &#945;E&#946;7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li></ol>

Yukarıdaki Protokolü dinamik adezyonu endotel ligandlar için insan bağışıklık hücrelerinin çalışma için yararlı bir yöntem açıklanır. Kaplamalı ligandlar, periosteum hücre tipleri veya alt kümeleri, kuluçka ek uyaranlara veya farklı nötralize antikorlar ile varyasyon ile neredeyse var sınırsız potansiyel uygulamalar. Bu nedenle, bu tür dinamik yapışma deneyleri temel araştırma hem de geliştirmek ve klinik tedavisi ilaçlarla yapışma işlemine engel optimize etmek için yardımcı olabil...

Hücre hareket vazgeçilmez geliştirme ve işlevi çok hücreli organizmalar için sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir ama aynı zamanda çok sayıda hastalıkları1patogenezinde karıştığı. Stok yenileme ve genişletme iltihaplı dokulara immunologically aracılı hastalıkları2 patojen hücrelerinin katkıda beri son zamanlarda artan ilgi, periferik dokulara kan akışından bağışıklık hücreleri izleme sürecinin kazanmıştır ,3. Özellikle, posta iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD) translasyonel yakınlık derecesine sahip olduğu gösterilmiştir. Gut posta ile müdahale tedavi anti-α4β7 integrin antikor vedolizumab etkinliği büyük klinik çalışmalarda4,5 ' te gösterilen ve gerçek klinik pratikte6,7 ' başarılı bir şekilde kullanılmıştır , 8. daha fazla bileşikler9,10izleyin muhtemeldir. Benzer şekilde, tedavi anti-α4 integrin antikor, natalizumab, multipl skleroz (MS)11tedavisi için kullanılır.
Ancak, bizim işlevsel izleme süreci genel olarak anlama ve bu tür tedavi antikorların etki mekanizması özellikle hala sınırlı. İyi posta hücre hayvan zinciri ve sağlam tutuklama trans endotel geçiş12,13tarafından takip önde gelen sonraki hücre adezyon ile çalışırken de dahil olmak üzere birkaç adımdan oluşan kuruldu. Yukarıda bahsedilen antikorlar integrinler damar duvarının addressins üzerinde endotel ile etkileşimi engelleyen hücre yüzeyinde etkisiz hale getirin. Bu firma hücre adezyon14,15engel düşünülmektedir. Henüz, biz sadece hücre posta, farklı hücre alt kümeleri için belirli integrinler fark uygunluğunu anlamaya başlıyor. Ayrıca, farklı anti-integrin antikorlar etkisi alt kümeleri hücre ve bir sürü açık soru IBD gut izleme ve anti-yapışma tedaviler alanında önde gelen büyük ölçüde bilinmeyen doz-yanıt ilişkilerdir.
Bu nedenle, bu tür soruları çözmek için uygun araçlar umutsuzca ihtiyaç vardır. Anti-integrin antikorlar etkisi integrin isteyebileğinizi etkileşim defa ağırlıklı olarak bağlama etkinliği/bağlama inhibisyon veya statik yapışma deneyleri16,17 akış sitometresi ile değerlendirilmesi tarafından değerlendirilmiştir ,18,19,20, böylece bariz basitleştirilmesi ve fizyolojik durum sapma ile. Biz son zamanlarda insan addressins hücrelere integrin bağımlı yapışma ve anti-integrin antikorlar altında kesme stres2etkileri çalışmaya dinamik yapışma tahlil kurulmuş. Teknik prensibi daha önce fare hücreleri21,22ile göstermiştir. Burada, bu uyarlanmış ve yukarıda belirtilen çevirim sorulara yönelik olarak geliştirilen, mekanizmaları ile anti-integrin antikorlar vivo içindetedavisinin açılış roman caddeleri için daha iyi anlıyorum.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-Well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin (BSA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20x2.00 mm ID, 50 mm length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>3520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL-2, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace&#8482; CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Rotixa 50 RS)</td>
			<td>Hettrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope (TCS SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL-10, human</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA KE/9 ml Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcons (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc chimera isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>110-HG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1)</td>
			<td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J848-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG Isotype Control</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse IgG isotype control</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6056-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natalizumab</td>
			<td>Biogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Counting chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancoll, human</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-601000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 182-10</td>
			<td>w/o Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-human CD18</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipetts</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861,254,025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>553706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vedolizumab (Entyvio)</td>
			<td>Takeda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic adhesion assay for the functional analysis of anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease

Gut posta bağışıklık hücrelerinin inflamatuvar barsak hastalıkları (IBD) patogenezinde için önemlidir. Integrin bağımlı hücre adezyon addressins için bu süreçte önemli bir adımdır ve tedavi stratejileri ile yapışma müdahale başarıyla kurulmuştur. Anti-α4β7 integrin antikor, vedolizumab, Crohn hastalığı (CD) klinik tedavisi için kullanılır ve ülseratif kolit (UC) ve daha fazla bileşikler takip etmek olasıdır.
Yapışma yordamı ayrıntılarını ve anti-integrin antikorlar eylem mekanizmaları hala bu alanda fonksiyonel araştırma için sınırlı kullanılabilir teknikleri nedeniyle birçok bakımdan pek açık değildir.
Burada, IBD bağlamında insan hücre adezyon akışı koşullar altında fonksiyonel analiz ve anti-integrin tedavilerin etkisi için bir dinamik yapışma tahlil mevcut. Gerçek zamanlı mikroskobik analizi ile ultrathin cam kaplı isteyebileğinizi kılcal damarlar ile birincil insan hücreleri perfüzyon dayanmaktadır. Tahlil iyileştirmeler ve değişiklikler için fırsatlar sunar ve potansiyelleri mekanik keşifler ve çevirim uygulamalar için tutar.

Yöntemi sunulan bu el yazması amacı insan hücre adezyonu endotel duvara vivo içinde süreci yakın olarak işlevsel olarak benzetimini yapmak için hücre adezyon ve müdahaleci antikorların rol değerlendirmek. Bu nedenle, ultrathin kılcal addressins ile kaplı ve perfüzyon pompa kullanarak faiz fluorescently etiketli insan hücreleri ile derin. Canlı hücre addressins için insan hücrelerinin yapışma Imaging kullanarak gerçek zamanlı (Şekil 1...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease at JoVE.com

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Bu yöntem, periferik organlara homing için gerekli bağışıklık hücrelerinin adezyon kaskad ile ilgili temel immünobiyoloji ve inflamatuar barsak hastalığı araştırma anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, akış koşullarında hücre yapışması bağlamında fonksiyonel soruları yanıtlamak için kullanışlı ve basit bir yaklaşım olmasıdır. Bu yöntem inflamatuar barsak hastalıklarında hücre poietik anti-integrin antikorlarının mekanizmasını araştırmak için geliştirilmiş olsa da, diğer inflamatuar hastalık ortamlarında benzer sorunları analiz etmek için değiştirilebilir.Bir tarafta küçük makaslarla bir parça kauçuk boru gererek başlayın ve tüpe yaklaşık 0,5 santimetre lik dikdörtgen bir kılcal damar ın yerleştirilmesine izin verin. Sonra parafin film ile bağlantı mühür. Kap20 mikrolitre ilgi adresleri ile kılcal ve plastik parafin film ile boru bağlı olmayan tarafı mühür en az bir saat kuluçka için 37 santigrat derece.Kuluçka sonunda, plastik parafin film çıkarın ve tüp boşaltmak için bir kağıt havlu üzerine kılcal dışarı ıslatın sıvı sağlar. Daha sonra 37 santigrat derecede en az bir saat boyunca 20 mikrolitre bloklama çözeltisi ile kılcal damarı kesin. Bu kodlanmış proteinlerin işlevselliğini bozabilir gibi kılcal kurumasını önlemek için kaplama çıkardıktan sonra doğrudan kılcal damara tıkanıklık uygulamak çok önemlidir.Kılcal damar lar tıkanırken, 50 mililitrelik bir tüpten 18 mililitre antikoagüle tam insan kanı ekleyin ve kanı PBS ile toplam 35 mililitrelik bir hacimle seyreltin. Kan çözeltisi altında yoğunluk gradyan orta Katman 10 mililitre ve yoğunluk gradyan santrifüj tarafından periferik kan mononükleer kan hücrelerini izole. Ayırma sonunda, yoğunluk gradyan ortamının arabiriminden periferik kan mononükleer hücrelerini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Ve taze PBS ile 50 mililitreye kadar tüp toplam hacmi getirmek. Santrifüjden sonra, 10 mililitre taze PBS'deki peleti, üreticinin talimatlarına göre uygun bir hücre izleme boyası ile saymak ve lekelemek için yeniden askıya alın. Boyama kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve tam RPMI orta konsantrasyonmililitre başına altı hücre için 1,5 kez 10 pelet resuspend.Sonra 48 kuyu plaka gibi birçok kuyuiçine hücrelerin bir mililitre tohum koşulları vardır. Ve 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara uygun anti-integrin antikor hacmiekleyin. Daha sonra hücreleri tek tek iki mililitrelik tüplere aktarmadan önce hücreleri birkaç kez yeniden askıya almak için bir P1000 pipet kullanın.Her birini bir mililitre PBS ile yıkın ve yıkamayı uygun iki mililitrelik tüplerde havuzlayın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri pelet ve mililitre süspansiyonlar başına altıncı hücrelere 1,5 kez on elde etmek için yapışma tampon uygun hacimde hücreleri resuspened. Sonra bir milimolar son konsantrasyoniçin her tüp için manganez klorür uygun hacmi ekleyin.Hücreler hazır olduğunda, mikroskobu açın ve uygun filtreleri ve lazerleri, nesnel ve edinme modunu seçin. Kılcal damar ın ucundan plastik parafin film çıkarın ve kılcal küçük tüp bağlı izin vermek için kauçuk boru beş santimetrelik bir parça germek için makas kullanın. Kılcal damar ve tüp arasındaki bağlantıyı plastik parafin filmile kapatın.Ve kılcal damarı bir sabitleme tepsisine monte edin. Kapiller odak olacak şekilde tepsiyi mikroskobun tepsi tutucuya yerleştirin. Ve peristaltik pompa nın ilgili çentik içine kauçuk boru takın.Tüpün bekar ucunu hücre süspansiyonuna içeren ilk numune tüpüne yerleştirin. Ve kapiller diğer tarafında kısa tüp ekleyin 15 mililitrelik tüp içine akış toplamak için. Hücre süspansiyonu neredeyse kılcal damara ulaşana kadar tüpün dakikada 500 mikrolitre akış hızıyla dolmasına izin verin.Sonra kılcal damar dakikada 100 mikrolitre bir akış hızında doldurmak sağlar. Kılcal damar hücrelerle dolduğunda, akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve toplam üç dakika boyunca her iki saniyede bir, kaplanmış duvarın içindeki adresin iç kısmı boyunca yavaşça hareket eden hücrelerin zaman atlamalı görüntülerini yakalayın. Hücre süspansiyonu kılcal damarın içine ulaştığında, akışta herhangi bir kesinti olmasını önlemek önemlidir, çünkü bu, etkileşimde statik integrin adresine yol açacaktır.Ekranda gözlenen bölümün temsili olduğundan emin olmak için tüm kılcal damarı mikroskop un merceğine atmadan önce. Pompadan tüp serbest ve kalan sıvı iki mililitrelik tüp içine geri çalışmasına izin. Daha sonra kılcal damarı ve tüpü fiksasyon tepsisinden çıkarın ve bir sonraki kılcal damarı az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.Zaman atlamalı kayıtları değerlendirmek için, uygun analiz yazılımındaki ilk sırayı açın ve ilk ve son üç görüntüyü TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. ImageJ'deki üç başlangıç görüntüsünü açın ve görüntüleri 32 bit'e dönüştürmek için görüntüyü, yazıyı ve 32 bit'i seçin. Ardından, görüntüleri tek bir görüntüde birleştirmek için görüntü, renk ve birleştirme kanallarını seçin ve tiff dosyası olarak kaydetmek için bileşik görüntüyü RGB'ye dönüştürün.Son üç görüntüyü aynı şekilde dönüştürdükten sonra, bileşik görüntülerin başında ve sonunda görünen beyaz hücreleri sayın. Ve başlangıç görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısını, bitiş görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısından çıkarın. ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 ile kaplanmış ancak insan PBMC'leri ile İzotip Fc chimera ile kaplanmış kılcal damarların perfüzyonu, üç adresten biri mevcut olduğunda belirgin yapışmaya yol açar.Buna karşılık, nötralize antikorlar kullanarak integrin adreslerinin inhibisyonu genellikle iyotip kontrol antikorları eklendiğinde olmayan dinamik yapışma belirgin bir azalmaya yol açar. Ayrıca, cd4 insan T hücrelerinin belirli kemokinler ile tedavisi tedavi edilmeyen insan hücrelerine göre adresinler için artan bir yapışma yol açar. Bu yordamı denerken, çeşitli faktörlerin bu istozda tamamen özetlenemez in vivo dinamik hücre adezyonuna katkıda bulunmak çok önemlidir.Ancak, çok karmaşık sorulara hitap etmek için tsay ayarlamak mümkündür. Hücre türlerinin diferansiyel yapışma davranışı ile ilgili ek soruları ele almak için, farklı hücre izleme boyaları ile etiketlenmiş farklı hücre türleri ile rekabetçi yapışma testleri yapmak da mümkündür. Bu teknik, geliştirildikten sonra inflamatuar barsak hastalıklarının tedavisinde kullanılan veya şu anda geliştirilmekte olan farklı anti-integrin antikorlarının etkilerini keşfetmemizi sağladı.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...