Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر أعضاء مختبرات هاثاوي وجين للمناقشات المفيدة. كما يشكر المؤلفون كرونا دان وإيان ماكدونالد للقراءة الحرجة من المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا R01GM118653 منحة من "معاهد الصحة الوطنية الأمريكية" (إلى N.A.H.)؛ وقبل منح R01GM122749، R01CA218600، و R01HD088626 من المستوى الوطني الأمريكي معاهد الصحة (ج. ج.). كما أيد هذا العمل مستوى 3 وطالب بمنحه من معهد اشيلمان UNC للابتكار (N.A.H و A.M.C، على التوالي). تمويل إضافي من GM007092 T-32 (A.M.C) تدعم هذا العمل. تم الحصول على بيانات التدفق الخلوي في UNC التدفق الخلوي الأساسية مرفق تموله P30 CA016086 السرطان مركز الأساسية دعم منحة لمركز السرطان الشامل لينبرجر UNC.

1) الخلية خط الثقافة لإنتاج لينتيفيروس
<ol><li>نمو جديدة، مرور منخفضة (أقل من مرور 30) خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK) 293T في دولبيكو الجلوكوز عالية تعديل النسر تكملة الوسائط الأساسية المتوسطة (دميم) مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 10 مم حبيس، 1 × الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، القلم/ بكتيري?...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

هنا، يمكننا وصف النظام جيم وضعت مؤخرا يجري تطبيقها على تنظيم التعبير الجيني والبيئة الكروماتين في جين معين بطريقة تعتمد على الجرعة. نحن نقدم طريقة دقيقة لدراسة ديناميات المشاركة في تنظيم التعبير الجيني من خلال التوظيف الانتقائي من البروتينات التنظيمية المحددة الكروماتين الذاتية. هذا هو...

الكروماتين يتكون من الحمض النووي الملتفة حول هيستون أوكتامير البروتينات التي تشكل الجسيمات نوكليوسومي الأساسية. تنظيم الضغط الكروماتين إليه أساسية للمناسبة الحمض النووي وإصلاح النسخ المتماثل، والتعبير1،2،3. إحدى الطرق التي الخلايا التحكم في مستوى الضغط عن طريق إضافة أو إزالة التعديلات ذيل هيستون بوستترانسلاشونال مختلفة. اثنان من هذه التعديلات تشمل acetylation يسين (1)، والأكثر شيوعاً المرتبطة التنشيط الجيني، ومثلايشن يسين (2)، التي يمكن أن تكون مرتبطة بتنشيط الجينات أو القمع، تبعاً للسياق من الأحماض الأمينية. إضافة علامات acetylation ومثلايشن هو تحفزها هيستون أسيتيلترانسفيراسيس (القبعات) وهيستون ميثيلترانسفيراسيس (همتس)، على التوالي، في حين يتم إزالة العلامة هيستون ديسيتيلاسيس (هداكس) وهيستون ديميثيلاسيس (HDMs )، على التوالي4،5. على الرغم من وجود هذه البروتينات معروفا منذ عقود، آليات عديدة كيف الكروماتين--تعديل إليه يظل يعمل بشكل صحيح تنظيم التعبير الجيني تعريف. نظراً للعمليات التنظيمية الكروماتين dysregulated في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، رؤى ميكانيكية جديدة يمكن أن تؤدي إلى تطبيقات علاجية في المستقبل.
الكروماتين في فيفو المقايسة (السي أي أية) هو تقنية وصف مؤخرا يستخدم محفز كيميائية القرب (CIP) للتحكم في الكروماتين--تعديل إليه التوظيف إلى موضع محدد6. قد استخدمت هذه التكنولوجيا لدراسة قائمة توسيع ديناميات الكروماتين، بما في ذلك البروتينات هستون تعديل, remodelers الكروماتين، والنسخ العوامل6،7،،من89. الكروماتين على أساس CIP الربط من البروتينات مناشئ أعرب أيضا قد مدد في الماضي وكالة المخابرات المركزية الأمريكية تعدل غير التعديل الجيني المكاني الاستخدام مع بروتين المرتبط بتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر كريسبر المعطلة (dCas9) 10 , 11-في نظام السي أي أية، وتم تعديل ميسكس للتعبير عن جين مراسل بروتينات فلورية خضراء في محور Oct4 ، منطقة الغاية المعلنة والتنظيم الصارم لجينوم مسك. سابقا، وقد طبق هذا النظام لوصف توظيف إنزيم التي تربط بين H3K9me3 وتنتشر علامات القمعية (مثلاً، H3K9me3) هيتيروتشروماتين أعرب عن مناشئ البروتين 1 (HP1)، تعتمد على الجرعة وعكسها والحمض النووي مثلايشن6. لإنجاز هذا النوع من استراتيجية التوظيف، مصابون ميسكس بلازميد يعبر عن FK506 ملزمة بروتين (فكبب) مرتبطة Gal4، وهو نقطة ربط الحمض النووي-بروتين الذي يربط بين مجموعة Gal4-ملزمة المنبع للمراسل بروتينات فلورية خضراء. الخلايا مصابون أيضا مجال فكبب-ربمسن-ملزمة (FRB) متصلاً HP1. عندما ميسكس يتعرضون لتركيزات منخفضة نانومولار المركز الدولي للبطاطا، ربمسن، FRB وفكبب، هي جمعت في المكان المستهدف. في غضون أيام علاج ربمسن، تقمع التعبير عن الجين المستهدف، كما يتضح من الأسفار مجهرية والتدفق الخلوي، وانخفض acetylation هستون، سيظهر برقاقة وتسلسل بيكبريتيت. بينما التنمية والتحقق من صحة هذا النهج تم تحقيق تقدم كبير في مجال البحوث الكروماتين والتنظيم، عيب واحد هو تعبير الخارجية المطلوبة لتعديل الكروماتين إليه.
لجعل التكنولوجيا القائمة على التوظيف فقط الإنزيمات ذات الصلة بالناحية الفسيولوجية الذاتية وجعل نظام المرن أكثر، مصممة، وتتميز جزيئات بيفونكشونال الرواية، ووصف يتبع (الشكل 1)12. يتضمن مكون واحد من يتبع FK506 الذي يماثل ربمسن، يربط محكم وعلى وجه التحديد إلى فكبب. وهكذا، سيتم تعيين يتبع لا يزال لمحور Oct4 في ميسكس السي أي أية. العناصر الأخرى من يتبع هو النصف الذي يربط إليه تعديل الكروماتين الذاتية. في دراسة تجريبية، اختبرنا CEMs التي تحتوي على مثبطات هداك. بينما مفهوم استخدام المانع تجنيد هداكس يبدو غير بديهية، المانع غير قادرة على توظيف النشاط هداك للجينات للفائدة. يتم ذلك عن طريق (1) إعادة توجيه في هداك إلى موضع، الإفراج عن الإنزيم، وزيادة كثافة هداكس تحول دون الأمم المتحدة في المنطقة، وتثبيط هداك (2) الحفاظ على في موضع، ولكن توظيف مجمعات القمعية التي تربط هداكس تحول دون، أو (3) مزيج من كليهما. في دراسة سابقة، نحن بينت أن يتبع قادرة على قمع بنجاح المراسل بروتينات فلورية خضراء بطريقة تعتمد على جرعة ووقت، وكذلك في طريقة سرعة عكسها (أيفي غضون 24 ساعة)12. نحن تتميز قدرة التكنولوجيا جيم المقدمة هنا للتعبير الجيني التحكم باستخدام مجهر الأسفار، والتدفق الخلوي، والقدرة للتحكم في بيئة الكروماتين باستخدام رقاقة قبكر6. هنا، يمكننا وصف طريقة لاستخدام وتميز CEMs، مما سيسهل التكيف مع هذا النظام للإجابة على الأسئلة الإضافية ذات الصلة بعلم الأحياء الكروماتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

تنظيم الضغط الكروماتين هو عملية هامة وينظم التعبير الجيني في حقيقيات النوى أعلى. على الرغم من أن الضغط الكروماتين وتنظيم تعبير الجينات تتعطل شائعة في العديد من الأمراض، يكن هناك طريقة محددة المكان، والذاتية، وعكسها لدراسة ومراقبة هذه الآليات من العمل. لمعالجة هذه القضية، لدينا المتقدمة وتتميز جزيئات بيفونكشونال رواية تنظيم الجينات. بربط واحد مكون من جزيء بيفونكشونال رابط بروتين الحمض النووي حيث أن أنه سيتم تعيين لمكان اليل على حدة. ويشرك العنصر الآخر الذاتية الآلية الخلوية تعديل الكروماتين، توظيف هذه البروتينات لجينات للفائدة. هذه الجزيئات الصغيرة، تسمى معدلات جينية الكيميائية (CEMs)، القادرة على التحكم في التعبير الجيني والبيئة الكروماتين بطريقة تعتمد على الجرعة وعكسها. هنا، نحن التفصيل نهجاً جيم وتطبيقه على إنقاص التعبير الجيني و acetylation الذيل هستون في مراسل أخضر نيون بروتين (بروتينات فلورية خضراء) يقع في محور Oct4 في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). نحن تميز القيادة جيم (CEM23) باستخدام مجهر فلوري والتدفق الخلوي إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة)، متبوعاً كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). بينما يتضح قوة هذا النظام في محور Oct4 ، نظرياً، التكنولوجيا جيم هو نمطي ويمكن تطبيقه في أنواع الخلايا الأخرى، وفي غيرها المكاني الجينوم.

ونحن مؤخرا نمواً يتبع وأثبتت أنه يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا لتنظيم التعبير الجيني والبيئة الكروماتين في موضع مراسل بطريقة تعتمد على الجرعة وعكسها. في الشكل 1، نموذجا للقيادة جيم، CEM23، ويرد. إليه هداك جندتهم لمحور مراسل المانع هداك هو، في هذه الحالة، المر?...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

تنظيم البيئة الكروماتين عملية أساسية للتعبير الجيني السليم. هنا، يمكننا وصف أسلوب للتحكم بالتعبير الجيني عن طريق تعيين الكروماتين--تعديل الآلية بطريقة خاصة بالجينات وعكسها.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة اللاجينية مثل آليات تنظيم الجينات وعلاقات السبب والنتيجة بين العناصر التنظيمية المختلفة للكروماتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه للمرة الأولى من الممكن أن وحدة loci الكروماتين مع الإنزيمات الذاتية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. عموما سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن ثقافة ESL الماوس من الصعب بطبيعتها بالنسبة لأولئك الذين لم يتم تدريبهم على هذه التقنية.مزيد من التوضيح من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما خطوات العدوى الفيروسية الخلية من الصعب تعلم. يجب على الباحث أن يُلزمنا خطين منفصلين لثقافة الخلية ومن الضروري مراقبة السلامة بيقظة خلال هذه الخطوات. للبدء في البروتوكول، مرور 18 مليون من خلايا HEK 293T لكل لوحة 50 سنتيمترا.التعرق وسائل الإعلام القديمة وإضافة 10 ملليلتر من واحد الفوسفات X المخزنة المالحة، أو برنامج تلفزيوني. استلهم برنامج تلفزيوني وإضافة ثلاثة ملليلترات من 0.05٪التربسين. احتضان الخلايا في التربسين لمدة ثماني دقائق في 37 درجة مئوية.صخرة والاستفادة من الخلايا في منتصف الطريق من خلال الحضانة. في اليوم التالي, عندما وصلت الخلايا 60 إلى 80٪ التقاء, أداء البولي إيثيلينمينمين, أو PEI, transfection. بعد ذلك، اخلط بلطف الحمض النووي، PEI، ووسائط النقل في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة، إضافة الحل قطرة إلى لوحة 15 سم. ثم، احتضان العينة لمدة 16 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي، تُطرّح وسائل الإعلام واستبدلها بلطف بـ 293 وسائط هكية جديدة إلى 15 سم. بعد تبادل وسائل الإعلام، احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت.تم إعداد mESC مسبقًا في شكل 12 طبقًا جيدًا مع 100,000 خلية في بئر واحد قبل يوم واحد من الإصابة. للخلايا التي تزرع في شكل 10 سم، التعرق وسائل الإعلام القديمة، إضافة خمسة ملليلترات من واحد X PBS، وpirpirate برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪التربسين. احتضان الخلايا في التربسين لمدة ثماني دقائق في 37 درجة مئوية والصخور والاستفادة من الخلايا في منتصف الطريق من خلال الحضانة.بعد 48 ساعة من تبادل وسائل الإعلام، وإزالة ونقل ناظر من خلايا 293T HEK إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه حطام الخلية. بعد ذلك، قم بتصفية الماظر من خلال غشاء 0.45 ميكرون.تركيز الفيروس عبر فائقة الطرد مع دوار SW32 وتدور العينة في 72، 000 مرات G لمدة ساعتين ونصف الساعة في أربع درجات مئوية. في حين أن الفيروس يركز تحت الطرد فائق التركيز ، وعلاج mESC وكالة المخابرات المركزية في لوحة 12 جيدا مع الجذعية الجنينية الطازجة أو وسائل الإعلام ES تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من البوليبرين. عندما تم الانتهاء من تركيز الفيروس، وpirpirate بعناية عظمى وتعليق بعناية بيليه الفيروس في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني X واحد لتجنب فقاعات الزائدة.إضافة الفيروس واحد X برنامج تلفزيوني إلى أنبوب Microfuge 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب في أدنى إعداد لتعليق تماما الفيروس. تدور أسفل الأنبوب في جهاز طرد مركزي منضدة مصغرة لمدة خمس إلى 10 ثوان لإزالة الفقاعات.إضافة 30 ميكروليتر من الفيروس إلى كل بئر من 12 لوحة جيدا. دوامة لوحة ومن ثم الطرد المركزي العينات في 1000 مرات G لمدة 20 دقيقة. ضع لوحة 12 بئرًا في حاضنة درجة مئوية 37 بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي، تبادل وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ES جديدة والسماح للعدوى أن تحدث لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة من العدوى، حدد للخلايا التي دمجت البلازميد الفيروسي عن طريق إضافة المضاد الحيوي المناسب. تغيير الوسائط يومياً.الحفاظ على وسائل الإعلام اختيار على الخلايا لمدة 72 إلى 96 ساعة في حاضنة درجة مئوية 37 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الاستمرار في تعديل اللاجينية الكيميائية، أو CEM، وإعداد والعلاج عن طريق تعليق CEM مسحوق وكبريتيد ثنائي الفينيل، أو DMSO، إلى تركيز المخزون من ملليمولار واحد وتركيز العمل من 100 ميكرومولار. بعد أن خضعت الخلايا للاختيار لمدة 72 إلى 96 ساعة ، قسمت mESC إلى تنسيق 12 جيدًا مع 100،000 خلية في البئر.احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، وإعداد حل وسائل الإعلام من 100 نانومولار CEM مع وسائل الإعلام ES. استخدام وسائل الإعلام لتغذية mESC وكالة المخابرات المركزية مع ملليلتر واحد جيدا.الحفاظ على جيدا من الخلايا دون أي CEM المضافة لتكون بمثابة عنصر تحكم. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط عن طريق التعرق في الوسائط القديمة وإضافة ملليلتر واحد لكل بئر من CEM الطازجة التي تحتوي على وسائط ES حرة أو CEM كل 24 ساعة لمدة التجربة. بعد 48 ساعة من العلاج CEM، صورة الخلايا دون CEM العلاج في الخلايا المعالجة مع 100 نانومولار CEM باستخدام المجهر المفلور.التقاط صور تمثيلية باستخدام المرحلة أو حقل مشرق لتسجيل مورفولوجيا mESC في 10 إلى 40 مرة التكبير. يجب أن تكون الخلايا حول المستعمرات مع عدد قليل من الخلايا المتمايزة. تحت قناة فيت سي fluorescence، صورة كلا ظروف الخلية.بعد ذلك ، عزل التحكم وCEM تعامل الخلايا لعملية استئصال الخلايا من خلال الاستنشاق الوسائط ، وغسل الخلايا بميليلتر واحد من X PBS ، وpirating PBS وإضافة 0.25 ملليلتر من 0.25 ٪ التربسين مع EDTA لمدة ثماني إلى 10 دقائق. تأكد من أن الخلايا لم تعد متجمعة في كتل كبيرة من خلال المجهر باستخدام التكبير 20 مرة. إذا كانت الخلايا لا يبدو أن في تعليق خلية واحدة، ماص بلطف لهم صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 لتسبيب الخلايا تماما.إخماد التربسين مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الطازجة وإعادة تعليق الخلايا بسرعة عالية مع ماصات المصلية حتى الخلايا في تعليق خلية واحدة. ثم، تدور أسفل الخلايا في 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشعاعات الماثرة، وغسل الخلايا مع واحد X برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي الخلايا.التعرق PBS supernatant و resuspend بيليه الخلية في 200 microliters من العازلة FACS. تنفيذ عملية استئصال الخلايا تدفق على ما يقرب من 50،000 الخلايا مع الخلايا المعلقة وتشغيل العينات بسرعة اغرم حوالي 5000 خلية في الثانية الواحدة. وأخيراً، قم بتصدير البيانات لمزيد من التحليل.صور المرحلة من نظام CEM في مركز Oct4 وmESC وكالة المخابرات المركزية هي صورة بعد 48 ساعة من العلاج مع 100 نانومولار من CEM23 أو مع الخلايا غير المعالجة تشير إلى قمع GFP محددة. تُظهر الصور الفلورية تعبيرًا ساطعًا من GFP في خلايا التحكم وتعبيرًا مخفضًا عن GFP في mESC المعالج بـ CEM23. تدفق cytometry كشفت باستمرار عن انخفاض أكبر من 30 ٪ في التعبير GFP في وكالة المخابرات المركزية mESC تعامل مع 100 نانوموللار من CEM23 لمدة 48 ساعة.Chromatin المناعي، أو CHIP، تبجح أن 48 ساعة من العلاج مع 100 نانومولار من CEM23 انخفض مستوى H3K27ac في مكان الهدف بالمقارنة مع الخلايا التحكم. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تكون حذراً مع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. إذا كانت التفريق أثناء البروتوكول، سيتم إبطال النتائج.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية لاستكشاف آليات vivo في الجينوم الثدييات.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

الخلوي تنشيط حصاد الضامة السنخية الفئران وتقييم المستحث بواسطة النانوية Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

عزل الخلوية الدهون قطرات: اثنان تقنيات تنقية بدءا من خلايا الخميرة ومشيمة الآدمي

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الأنزيمية الفحص لقياس النسخ تثبيط من قبل الغاليوم (III) وH<sub&gt; 3</sub&gt; 5،10،15-تريس (pentafluorophenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

والسريع والكيميائية خالية الفحص الهيموغلوبين مع ضوئي؛ ضوحراري الزاوي تشتت الضوء

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...