Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
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作者感谢哈撒韦和金实验室的成员们的有益讨论。作者还感谢丹 Crona 和伊恩. 麦克唐纳对手稿的批判性阅读。这项工作部分是由美国国立卫生研究院授予 R01GM118653 (N.A.H.) 支持的;还有来自美国国立卫生研究院 (R01GM122749)、R01CA218600 和 R01HD088626 的赠款。这项工作还得到了3级的支持, 还有来自 Eshelman 创新研究所 (分别为 H 和上午 C) 的学生补助金。T-32 GM007092 (上午 C) 提供的额外资金支持这项工作。流式细胞术数据是在 unc 流式细胞术核心设施中获得的, 由 P30 CA016086 癌症中心核心支助赠款向 unc Lineberger 综合癌症中心提供资金。

1) 细胞线培养生产慢病毒北疆
<ol><li>生长新鲜, 低通道 (少于 30) 293T 人胚肾 (HEK) 细胞在高葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 基质中补充10% 胎牛血清 (血清), 10 毫米 HEPES, 1x 非必需氨基酸 (NEAA), 钢笔/链球菌, 2-mercaptoenthanol 在37°c 孵化器与 5% CO2。分裂细胞每 3-5 d 和之前, 他们成为 > 95% 汇合。</li>
	<li>通过 293T HEK 细胞与 18 x 106每 15 cm 板材 (一个 15 cm 板材为每种病毒生产)。<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

在这里, 我们描述了最近开发的杰姆系统是用来调节基因表达和染色质环境在特定的基因, 以剂量依赖性的方式。我们提供了一个准确的方法来研究调控基因表达的动态, 通过选择性地招募特定的内源性染色质调节蛋白。这是一种高度模块化的技术, 可用于研究不同的蛋白质和染色质修饰配合物在如何有效地调节染色质环境, 以及研究这些过程是如何失调的, 与实现基因特异性的好处。
<p class="jove...

染色质由 DNA 包裹在组蛋白 octamer 蛋白组成的核心核粒子。规范染色质压实是正确的 DNA 修复, 复制和表达1,2,3的基本机制。细胞控制压实水平的一种方法是通过添加或移除不同的平移后组蛋白尾修饰。两个这样的修改包括 (1) 赖氨酸乙酰化, 这是最常见的与基因激活, (2) 赖氨酸甲基化, 这可以与基因激活或压迫, 取决于氨基酸上下文。添加乙酰化和甲基的标记由组蛋白乙酰转移酶 (帽子) 和组蛋白甲基转移酶 (HMTs) 分别催化, 而去除标记是由组蛋白乙酰 (HDACs) 和组蛋白 demethylases (HDMs) 分别为4、5。虽然这些蛋白质的存在几十年来已经知道, 许多机制的染色修饰机制如何工作, 以适当调节基因表达仍然有待确定。由于染色质调控过程在许多人类疾病中失调, 新的机械洞察可能会导致未来的治疗应用。
染色质在体内检测 (CiA) 是最近被描述的技术, 使用化学诱导剂接近 (CIP) 控制染色质修改机械招募到特定的轨迹6。该技术已被用来研究一个不断扩大的染色质动力学列表, 包括组蛋白修饰蛋白, 染色质 remodelers, 转录因子6,7,8,9。以 CIP 为基础的外部表达蛋白的染色质结合也被延长过去中情局通过使用与停用的群集定期 Interspaced 短回文重复 (CRISPR) 相关蛋白 (dCas9) 来调节非修饰的遗传基因座10,11. 在中情局系统中, mESCs 被修改为在Oct4轨迹上表达 GFP 报告基因, 这是卓制基因组高度表达和严格调控的区域。以前, 这个系统被应用来描述剂量依赖性和可逆的招募外部表达染色质蛋白 1 (HP1), 一种酶, 结合 H3K9me3 和传播压制标记 (如, H3K9me3) 和 DNA甲基化6。为了完成这种类型的招聘策略, mESCs 感染了一种质粒, 表达 FK506-binding 蛋白 (FKBP) 链接到 Gal4, 这是一个 DNA 蛋白锚绑定到一个 Gal4-binding 阵列上游的 GFP 记者。细胞也感染了 FKBP-雷帕霉素结合域 (FRB) 连接到 HP1。当 mESCs 暴露于低 nanomolar 浓度的 CIP, 雷帕霉素, 无论是 FRB 和 FKBP, 都聚集在一起的目标轨迹。在雷帕霉素治疗几天内, 通过荧光显微镜和流式细胞仪对靶基因的表达进行抑制, 并通过芯片和亚硫酸氢化序列显示组蛋白乙酰化的降低。虽然这种方法的发展和验证在染色质研究和调控领域取得了重大进展, 但其中一个缺点是染色质修饰机械所需的外源表达。
为了使这项技术的基础上只有内生生理相关的酶和制造一个更模块化的系统, 我们设计和特点新的双分子, 称为 CEMs (图 1)12。CEMs 的一个组成部分包括 FK506, 与雷帕霉素相似, 紧密结合, 专门 FKBP。因此, CEMs 仍将被招募到中央情报局 mESCs 的Oct4轨迹。CEMs 的其他成分是一种结合内源染色质修饰机械的基团。在一项试验性研究中, 我们测试了含有 HDAC 抑制剂的 CEMs。虽然使用抑制剂来招募 HDACs 的概念似乎是反直觉的, 但抑制剂仍然能够招募 HDAC 活动的基因感兴趣。这是通过 (1) 重定向 HDAC 到轨迹, 释放酶, 并增加不受抑制的 HDACs 在该地区的密度和 (2) 保持 HDAC 抑制在这个轨迹, 但招募压制性复合物, 约束 HDACs,或 (3) 两者的结合。在先前的一项研究中, 我们表明 CEMs 能够以剂量和时间依赖性的方式成功地压制 GFP 的记者, 并且以一种快速可逆的方式 (即在24小时内)12。我们以 qPCR6的荧光显微镜、流式细胞术和控制染色质环境的能力为特点, 提出了利用该技术控制基因表达的能力。在这里, 我们描述了一种使用和表征 CEMs 的方法, 这将促进该系统的适应性, 以回答与染色质生物学有关的其他问题。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

染色质压实调控是控制高真核生物基因表达的重要过程。虽然染色质压实和基因表达调控在许多疾病中普遍被打乱, 但缺乏一个轨迹特异、内生和可逆的方法来研究和控制这些作用机制。为解决这一问题, 我们开发了新的基因调控双分子的特点。双分子的一个成分结合 DNA 蛋白锚, 使其被招募到一个等位基因特定的轨迹。另一个成分参与内源性细胞染色质修饰机制, 将这些蛋白质招募到感兴趣的基因上。这些小分子, 称为化学后生修饰语 (CEMs), 能够以剂量依赖性和可逆的方式控制基因表达和染色质环境。在这里, 我们详细介绍了一个方法和它的应用, 以减少基因表达和组蛋白尾乙酰化在绿色荧光蛋白 (GFP) 记者位于Oct4的位置在小鼠胚胎干细胞 (mESCs)。我们用荧光显微镜、流式细胞术和染色质免疫沉淀 (芯片) 来描述 CEM23 的铅, 然后定量聚合酶链反应 (qPCR)。虽然这个系统的力量在Oct4轨迹上显示, 在概念上, 杰姆技术是模块化的, 可以应用于其他细胞类型和其他基因组的基因座。

我们最近开发了 CEMs, 并证明该技术可以应用于调节基因表达和染色质环境在一个记者的轨迹, 以剂量依赖性和可逆的方式。在图 1中, 显示了 CEM23 的一个模型。HDAC 机械是由 HDAC 抑制剂招募到记者的轨迹, 在这种情况下, 是 GFP 记者插入到Oct4的轨迹。
我们试图在 CiA mESCs 的Oct4轨迹上描述杰姆系...

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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

用化学表观修饰因子重定向细胞机械抑制基因转录

对染色质环境的调节是正确基因表达所需的必要过程。在这里, 我们描述了一种方法来控制基因表达, 通过招募的染色质修改机制, 基因特异和可逆的方式。

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

该方法有助于回答表观遗传学领域关键问题，如基因调控机制和不同染色质调控元素之间的因果关系。该技术的主要优点是，首次能够将染色质位点与生理上相关的内源酶进行模块。通常，对于尚未接受过此技术培训的小鼠 ESL 培养者来说，新方法的个体将难以为之挣扎。这种方法的进一步演示是至关重要的，因为细胞病毒感染步骤是很难学习的。研究者必须对两条单独的细胞培养线进行时间，并且有必要在这些步骤中警惕地监控安全性。为了开始这个协议，每50厘米板通过1800万个293T HEK细胞。吸气旧介质，加入 10 毫升的一个 X 磷酸盐缓冲盐水，或 PBS。吸气PBS，并添加三毫升0.05%的三辛尝试。在37摄氏度下在尝试性素中孵育细胞8分钟。在孵育的中途摇动并敲击细胞。第二天，当细胞达到60%至80%的汇合时，执行聚乙酰胺，或PEI，转染。接下来，将脱氧核糖核酸、PEI 和转染介质轻轻混合在 15 毫升锥形管中。在室温下孵育样品15分钟。孵育后，将溶液滴到15厘米的板中。然后，在37摄氏度的培养箱中用5%的二氧化碳孵育样品16小时。第二天，吸气介质，轻轻地更换它与预谋，新鲜的293 HEK介质到15厘米板。媒体交换后，在37摄氏度的培养箱中孵育细胞，用5%的二氧化碳孵育48小时。用血细胞计计算细胞。在感染前一天，通过先前准备的MESC进入12个井板格式，每井有10万个细胞。对于以 10 厘米格式生长的细胞，吸气旧介质，添加 5 毫升的 X PBS，吸气 PBS，并添加 1 毫升 0.25% trypsin。在37摄氏度下孵育在尝试性细胞8分钟，在孵化中途敲击细胞。介质交换后 48 小时，取出 293T HEK 细胞的上经液并将其转移到 50 毫升锥形管中。将上一提液在300倍G下离心5分钟，以对细胞碎片进行颗粒状。接下来，通过0.45微米膜过滤上清液。通过SW32转子通过超离心将病毒集中，在4摄氏度下将样品在72，000次G旋转两个半小时。当病毒集中在超离心下时，用每毫升多聚布雷恩含有5微克的新鲜胚胎茎或ES介质在12井板中治疗CIA MESC。当病毒浓度完成时，小心吸上一道活，小心地将病毒颗粒悬浮在100微升的X PBS中，以避免多余的气泡。将病毒和一个X PBS添加到1.5毫升微模糊管中。在最低设置的管子漩涡完全挂起病毒。在迷你桌面离心机中旋转管，5 到 10 秒钟以清除气泡。在12个井板的每个井中加入30微升病毒。旋转板，然后以 1000 次 G 离心样品 20 分钟。将 12 个井板放回 37 摄氏度的孵化器中过夜。第二天早上，用新的ES媒体交换媒体，让感染发生48小时。感染48小时后，通过添加适当的抗生素，选择整合病毒质粒的细胞。每天更换媒体。在37摄氏度的培养箱中，将选择介质在细胞上保持72至96小时，并吸收5%的二氧化碳。继续化学表观遗传改性剂（CEM）的制备和处理，将粉末状的 CEM 和二甲基硫化物（或<a0></a0><a3></a3>DMSO"暂停为一毫摩尔和 100 微摩尔的工作浓度。经过72至96小时的选择后，将MESC的井分成12个井格式，每井有10万个细胞。在37摄氏度的培养箱中孵育细胞，用5%的二氧化碳孵育24小时。孵育后，准备100纳米摩尔CEM的介质溶液与ES介质。使用介质为 CIA MESC 提供一毫升好食物。在不添加任何 CEM 的情况下保持一个良好的细胞，以用作控制。接下来，在实验期间，每新鲜准备的 CEM 包含或 CEM 免费 ES 介质，每 24 小时添加一毫升，从而改变介质。经过 48 小时的 CEM 处理后，使用荧光显微镜对使用 100 纳米摩尔 CEM 处理的细胞中未进行 CEM 处理的细胞进行图像成像。使用相位或亮场拍摄具有代表性的图像，以 10 到 40 倍的放大率记录 mESC 形态。细胞应该在殖民地周围形成，并有几个分化的细胞。在 FITC 荧光通道下，对两个细胞条件进行成像。接下来，通过吸气介质，用一毫升的一毫升一个X PBS清洗细胞，吸气PBS，用EDTA加入0.25毫升0.25微蛋白，分离对照组和CEM处理的细胞进行流动细胞测量，8至10分钟。使用 20 倍的放大倍率确认细胞不再通过显微镜将大团块束成一体。如果细胞看起来不在单个细胞悬浮液中，用P1000移液器轻轻移液，以完全尝试细胞。用一毫升新鲜介质淬火，用血清移液器高速悬浮细胞，直到细胞处于单个细胞悬浮状态。然后，在室温下以300倍G旋转细胞，5分钟。吸上一液，用一个X PBS清洗细胞，并离心机。吸制PBS上流剂，并在200微升的FACS缓冲液中重新填充细胞颗粒。对大约5万多个带悬浮细胞的细胞进行流式细胞测量，以大约5000个细胞/秒的护套速度运行样本。最后，导出数据以作进一步分析。在10月4日位点和CIA MESC的CEM系统的相位图像在经过48小时的治疗后，用100纳米摩尔的CEM23或未经处理的细胞成像显示特定的GP抑制。荧光图像显示控制细胞中的明亮的 GFP 表达，以及使用 CEM23 处理的 MESC 中减少的 GFP 表达。流细胞学一直显示，在CIA MESC的100纳米摩尔的CEM23治疗48小时内，GFP表达的降幅超过30%。与对照细胞相比，色谱免疫沉淀（CHIP）对用100纳米摩尔的48小时治疗降低了靶点H3K27ac的水平。在尝试这个程序时，重要的是要记住要小心小鼠胚胎干细胞。如果它们在协议期间区分，结果将无效。该技术开发后，为合成生物学领域的研究人员探索哺乳动物基因组中的体内机制铺平了道路。

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