Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Hathaway og Jin laboratorierne for deres nyttige diskussioner. Forfatterne også takke Dan Crona og Ian MacDonald for deres kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet i en del af Grant R01GM118653 fra USA National Institutes of Health (til N.A.H.); og af tilskud R01GM122749, R01CA218600 og R01HD088626 fra det amerikanske nationale institutter for sundhed (til J.J.). Dette arbejde blev også støttet af en tier 3 og en studerende tilskud fra UNC Eshelman Institut for Innovation (N.A.H og A.M.C, henholdsvis). Yderligere finansiering fra en T-32 GM007092 (til A.M.C) støttet dette arbejde. Flow flowcytometri data blev opnået på UNC-Flow flowcytometri Core facilitet finansieret af en P30 CA016086 Cancer Center Core støtte tilskud til UNC-Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) celle linje kultur for at producere Lentivirus
<ol><li>Vokse friske, lav-passage (mindre end passage 30) 293T menneskelige embryonale nyre (HEK) celler i høj-glucose Dulbecco ændrede Eagle er medium (DMEM) base media suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2. Opdel celler hver 3-5 d og før de bliver > 95% sammenflydende.</li>
	<li>Passage 293T HEK celler med 18 x 106 pr. 15...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Her, beskrev vi for nylig udviklede CEM systemet anvendes til at regulere genekspression og kromatin miljø på et specifikt gen i en dosisafhængig måde. Vi leverer en præcis metode til at studere dynamikken involveret i reguleringen af genekspression gennem selektiv rekruttering af specifikke endogene kromatin regulerede proteiner. Dette er en yderst modulære teknologi, der kan anvendes til at undersøge, hvordan forskellige protein - og kromatin-ændre komplekser arbejde i koncert til korrekt regulere kromatin milj...

Kromatin består af DNA snoet omkring Histon octamer proteiner, der danner kernen nucleosome partikel. Regulering af kromatin jordpakning er en helt nødvendig mekanisme for ordentlig DNA reparation, replikering og udtryk1,2,3. En måde hvorpå celler styre niveauet af jordpakning er gennem tilføjelse eller fjernelse af forskellige posttranslationelle Histon hale ændringer. To sådanne ændringer omfatter (1) lysin acetylation, som er oftest forbundet med genaktivering, og (2) lysin methylering, som kan være forbundet med enten genaktivering eller undertrykkelse, afhængigt af konteksten aminosyre. Tilføjelsen af acetylation og methylering varemærkerne er katalyseret af Histon acetyltransferases (hatte) og Histon methyltransferases (HMTs), henholdsvis, der henviser til, at fjernelse af mærket er udført af Histon deacetyltransferase (HDAC'er) og Histon demethylases (P550 ), henholdsvis4,5. Selv om eksistensen af disse proteiner har været kendt i årtier, mange mekanismer af hvordan ændring af kromatin maskiner værker til korrekt regulere genekspression fortsat være defineret. Da kromatin lovgivningsprocesser er dysregulated i mange menneskelige sygdomme, kunne nye mekanistiske indblik føre til fremtidig terapeutisk anvendelse.
Kromatin i vivo assay (CiA) er en nylig beskrevet teknik, der bruger et kemisk inducer af nærhed (CIP) til at styre ændring af kromatin maskiner rekruttering til en specifik locus6. Denne teknologi har været brugt til at studere en voksende liste af kromatin dynamics, herunder ændring af Histon proteiner, kromatin remodelers og transskription faktorer6,7,8,9. CIP-baserede kromatin tøjring af eksogent udtrykte proteiner har også forlænget forbi CiA til at modulere ikke-modificerede genetiske loci ved brug med en deaktiveret grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager CRISPR-forbundet protein (dCas9) 10 , 11. i CiA-systemet, mESCs er blevet ændret for at give udtryk for en normal god landbrugspraksis reporter gen i Oct4 locus, et stærkt udtryk og strengt regulerede område af mESC genom. Tidligere, dette system er blevet anvendt til at beskrive dosisafhængig og reversible ansættelse af eksogent udtrykt heterochromatin protein 1 (HP1), et enzym, der binder H3K9me3 og overfører repressive mærker (f.eks.H3K9me3) og DNA methylering6. For at opnå denne form for rekruttering strategi, er mESCs inficeret med et plasmid, der udtrykker en FK506-bindende protein (FKBP) forbundet til en Gal4, som er en DNA-protein anker, der binder sig til en Gal4-binding array opstrøms af normal god landbrugspraksis reporter. Cellerne er også smittet med en FKBP-rapamycin-bindende domæne (FRB) forbundet til HP1. Når mESCs udsættes for lav nanomolar koncentrationer af CIP, rapamycin, både FRB og FKBP, er bragt sammen på target locus. Inden for dage af rapamycin behandling, udtryk for mål-genet er undertrykt, som det fremgår af Fluorescens mikroskopi og flow flowcytometri og Histon acetylation er faldet, vist af ChIP og bisulfite-sekventering. Mens udviklingen og valideringen af denne tilgang har været betydelige fremskridt inden for kromatin forskning og forordning, en ulempe er det krævede eksogene udtryk for ændring af kromatin maskiner.
For at gøre den teknologi baseret på rekruttering af kun endogene fysiologisk relevante enzymer og gøre en mere modulopbygget system, vi designet og kendetegnet roman bifunctional molekyler, betegnes CEMs (figur 1)12. En komponent i CEMs omfatter FK506, som svarer til rapamycin, bindes stramt og specifikt til FKBP. Således, CEMs vil stadig være ansat til Oct4 locus i CiA mESCs. Anden del af CEMs er en gruppe, der binder endogene ændring af kromatin maskiner. I en pilotundersøgelse testede vi CEMs, der indeholder HDAC-hæmmere. Mens begrebet ved hjælp af en inhibitor for at rekruttere HDAC'er synes counter-intuitive, er inhibitoren ikke desto mindre kan rekruttere HDAC aktivitet til gen af interesse. Dette opnås ved at (1) omdirigere HDAC til locus, frigiver enzymet, og øge tætheden af un-hæmmet HDAC'er i området og (2) opretholder HDAC-hæmning på locus, men rekruttere repressive komplekser, der binder til de hæmmet HDAC'er, eller (3) en kombination af begge. I en tidligere undersøgelse, viste vi, at CEMs var købedygtig med held undertrykke normal god landbrugspraksis reporter på en måde, afhængig af dosis og tidspunkt og på en måde, der var hurtigt reversible (dvs.inden for 24 timer)12. Vi kendetegnet evne til CEM teknologi præsenteres her til kontrol genekspression ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, flowcytometri og evnen til at styre kromatin miljø ved hjælp af ChIP-qPCR6. Her, beskriver vi en metode til at bruge og kendetegner CEMs, som vil lette tilpasning af dette system til at besvare yderligere spørgsmål relateret til kromatin biologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Regulering af kromatin jordpakning er en vigtig proces, der styrer genekspression i højere eukaryoter. Selvom kromatin jordpakning og genregulering udtryk er almindeligt forstyrret i mange sygdomme, har et locus-specifikke, endogene og reversible metode til at studere og kontrollere disse virkningsmekanismer manglet. For at løse dette problem, har vi udviklet og karakteriseret roman gen-regulerende bifunctional molekyler. En del af den bifunctional molekyle binder sig til en DNA-protein anker så at det vil blive ansat til en allel-specifik locus. Anden komponenten engagerer endogene cellulære ændring af kromatin maskiner, rekruttere disse proteiner til et gen af interesse. Disse små molekyler kaldet kemisk epigenetiske modifikatorer (CEMs), er i stand til at kontrollere genekspression og kromatin miljø i en dosisafhængig og reversibel måde. Vi detalje her, en CEM tilgang og dens anvendelse til at formindske genekspression og Histon hale acetylation på en grøn fluorescerende proteiner (NGL) reporter beliggende på Oct4 locus i mus embryonale stamceller (mESCs). Vi karakteriserer føringen CEM (CEM23) ved hjælp af fluorescerende mikroskopi, flowcytometri og kromatin immunoprecipitation (ChIP), efterfulgt af en kvantitativ Polymerasekædereaktionen (qPCR). Mens styrken af dette system er demonstreret på locus Oct4 begrebsmæssigt, CEM-teknologi er modulopbygget og kan anvendes i andre celletyper og på andre genomisk loci.

Vi har for nylig udviklet CEMs og påvist, at denne teknologi kan anvendes til at regulere genekspression og kromatin miljø på en reporter locus i en dosisafhængig og reversibel måde. I figur 1vist CEM, CEM23, en model af bly. HDAC maskiner er rekrutteret til reporter locus af HDAC-hæmmer, som i dette tilfælde, er normal god landbrugspraksis reporter indsat i Oct4 locus.
Vi forsøgte ...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulering af kromatin miljø er en afgørende proces kræves for korrekt genekspression. Her, vi beskriver en metode til at kontrollere genekspression gennem ansættelse af ændring af kromatin maskiner i en gen-specifikke og reversibel måde.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for epigenetik område såsom mekanismerne i genregulering og årsag og virkning relationer mellem forskellige kromatin regulerende elementer. Den største fordel ved denne teknik er, at det for første gang er muligt at module en kromatin loci med fysiologisk relevante endogene enzymer. Generelt enkeltpersoner nye til denne metode vil kæmpe, fordi musen ESL kultur er i sagens natur svært for dem, der ikke er blevet uddannet i teknikken.Yderligere demonstration af denne metode er kritisk som celle virusinfektion skridt er vanskelige at lære. Forskeren skal tid to separate linjer af cellekultur, og det er nødvendigt at overvåge sikkerheden i disse trin. Til at begynde protokollen, passage 18 millioner af 293T HEK celler pr 50 centimeter plade.Aspirere de gamle medier og tilsæt 10 milliliter en X fosfat bufferet saltvand, eller PBS. Aspirere PBS og tilsæt tre milliliter 0,05% trypsin. Inkuber cellerne i trypsin i otte minutter ved 37 grader Celsius.Rock og tryk cellerne halvvejs gennem inkubationen. Den følgende dag, når cellerne har nået 60 til 80%sammenløbet, udføre en polyethylenimin, eller PEI, transinfektion. Derefter blandes forsigtigt DNA, PEI og transfektionsmedier i et 15 milliliter konisk rør.Prøven inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter inkubation tilsættes opløsningen dråbevis til 15 centimeter pladen. Derefter inkuberes prøven i 16 timer i en 37 grader Celsius inkubator med 5% kuldioxid.Den næste dag, aspirere medierne og forsigtigt erstatte det med prewarmed, friske 293 HEK medier til de 15 centimeter plader. Efter medieudvekslingen inkuberes cellerne i en 37 grader Celsius-inkubator med 5 % kuldioxid i 48 timer. Tæl cellerne med et hæmocytometer.Passage tidligere forberedt mESC i en 12 godt plade format med 100, 000 celler pr brønd en dag før infektion. For celler, der dyrkes i et 10 centimeter format, aspirere de gamle medier, tilsæt fem milliliter en X PBS, aspirere PBS, og tilsæt en milliliter 0,25% trypsin. Inkuber cellerne i trypsin i otte minutter ved 37 grader Celsius og rock og tryk cellerne halvvejs gennem inkubationen.48 timer efter medieudvekslingen fjernes og overføres supernatanten af 293T HEK-cellerne til et konisk rør på 50 milliliter. Centrifuge supernatant ved 300 gange G i fem minutter til pellet celle snavs. Derefter filtreres supernatanten gennem en 0,45 mikron membran.Koncentrat virus via ultracentrifuge med en SW32 rotor og drej prøven på 72, 000 gange G i to og en halv time ved fire grader Celsius. Mens viruskoncentrater under ultracentrifugering, behandle CIA mESC's i 12 godt plade med frisk embryonale stilk eller ES medier, der indeholder fem mikrogram pr. milliliter polybren. Når viruskoncentrationen er færdig, skal du forsigtigt aspirere supernatanten og forsigtigt suspendere viruspilpellen i 100 mikroliter af en X PBS for at undgå overskydende bobler.Tilsæt virus og en X PBS til en 1,5 milliliter Microfuge rør. Vortex røret på den laveste indstilling til fuldt ud at suspendere virus. Drej røret ned i en mini bordplade centrifuge i fem til 10 sekunder for at fjerne bobler.Tilføj 30 mikroliter af virus til hver brønd af en 12 brønd plade. Hvirvles pladen og derefter centrifuge prøverne ved 1000 gange G i 20 minutter. Placer de 12 godt plade tilbage i 37 grader Celsius inkubator natten over.Den følgende morgen, udveksle medierne med friske ES medier og tillade infektion at finde sted i 48 timer. Efter 48 timers infektion, vælge for celler, der integrerede den virale plasmid ved at tilføje passende antibiotika. Skift dagligt mediet.Hold udvælgelsesmediet på cellerne i 72 til 96 timer i en 37 grader Celsius-inkubator med 5 % kuldioxid. Fortsætte med kemisk epigenetisk modifikator eller CEM, forberedelse og behandling ved at suspendere den pulveriserede CEM og dimethylsulfoxid, eller DMSO, til en bestand koncentration på en millimolar og en fungerende koncentration på 100 mikromolar. Efter at cellerne har gennemgået udvælgelse i 72 til 96 timer, opdele mESC's i en 12 brøndformat med 100, 000 celler pr brønd.Inkuber cellerne i en 37 grader Celsius inkubator med 5% kuldioxid i 24 timer. Efter inkubation, forberede en medieopløsning på 100 nanomolar CEM med ES medier. Brug medierne til at fodre CIA mESC med en milliliter godt.Hold en brønd af celler uden nogen tilføjet CEM's til at tjene som en kontrol. Dernæst ændre medierne ved at aspirere de gamle medier og tilføje en milliliter pr godt ud frisklavet CEM indeholder eller CEM gratis ES medier hver 24 timer for varigheden af forsøget. Efter 48 timers CEM-behandling afbildes cellerne uden CEM-behandling i de celler, der blev behandlet med 100 nanomolar CEM ved hjælp af et fluorescensmikroskop.Tag repræsentative billeder ved hjælp af fase- eller lysfelt for at registrere mESC-morfologien ved 10 til 40 gange forstørrelse. Cellerne skulle have dannet omkring kolonier med et par differentierede celler. Under FITC fluorescens kanal, billede begge cellebetingelser.Dernæst isolere kontrol og CEM behandlede celler for flow cytometri ved at aspirere medierne, vaske cellerne med en milliliter en X PBS, aspirere PBS og tilføje 0,25 milliliter 0,25% trypsin med EDTA i otte til 10 minutter. Bekræft, at cellerne ikke længere er bundtet i store klumper gennem mikroskopet ved hjælp af 20 gange forstørrelse. Hvis cellerne ikke ser ud til at være i en enkelt celle suspension, forsigtigt pipette dem op og ned med en P1000 pipette til fuldt trypsinize cellerne.Sluk trypsin med en milliliter friske medier og resuspenderede cellerne ved høj hastighed med en serologisk pipette, indtil cellerne er i en enkelt celle suspension. Derefter dreje ned cellerne ved 300 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Inspirer supernatanten, vask cellerne med en X PBS, og centrifuge cellerne.Inspirer PBS supernatant og resuspend cell pellet i 200 mikroliter af FACS buffer. Udfør flowcytometri på ca. mere end 50.000 celler med de suspenderede celler og kør prøverne med en kappehastighed på ca. 5.000 celler pr. sekund. Endelig eksporteres dataene til yderligere analyse.Fase billeder af CEM-systemet på Oct4 locus og CIA mESC's er afbildet efter 48 timers behandling med 100 nanomolar CEM23 eller med ubehandlede celler indikerer specifikke GFP undertrykkelse. Fluorescerende billeder viser et lyst GFP-udtryk i kontrolcellerne og et reduceret GFP-udtryk i mESC's behandlet med CEM23. Flow cytometri konsekvent afsløret en større end 30% fald i GFP udtryk i CIA mESC's behandlet med 100 nanomolar CEM23 i 48 timer.Kromatin immunoprecipation, eller CHIP, svælgede, at 48 timers behandling med 100 nanomolar CEM23 faldt niveauet af H3K27ac på målet locus sammenlignet med kontrolceller. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at være forsigtig med musen embryonale stamceller. Hvis de differentierer i løbet af protokollen, vil resultaterne blive annulleret.Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for syntetisk biologi til at udforske in vivo mekanismer i pattedyr genom.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Høst Muse alveolære makrofager og evaluering Cellular aktivering induceret af polyanhydridet Nanopartikler

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolering af Cellular lipiddråber: To oprensningsteknikker start fra gærceller og menneskelige moderkager

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In vitro</em&gt; Enzymatisk assay til måling Transskription Inhibering af gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Design mikrofluidenheder for at studere cellulære reaktioner under ét eller samtidig eksisterende Chemical / El / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

En hurtig og kemiske-fri Hæmoglobin Assay med Photothermal Kantet lysspredning

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Overflade Functionalization af Hepatitis E Virus nanopartikler ved hjælp af kemiske konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabrikation af en multiplex kunstige cellulære mikromiljø Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...