Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

De auteurs bedank de leden van de Hathaway en Jin laboratoria voor hun nuttige discussies. De auteurs worden Dan Crona en Ian MacDonald ook bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Grant R01GM118653 van de Amerikaanse National Institutes of Health (aan N.A.H.); en door subsidies R01GM122749, R01CA218600, en R01HD088626 van de Amerikaanse nationale instituten voor gezondheid (bij J.J.). Dit werk werd ook ondersteund door een tier 3 en een student van het UNC-Eshelman Instituut voor innovatie verlenen (N.A.H en A.M.C, respectievelijk). Extra financiering van een T-32 GM007092 (A.M.C) ondersteund dit werk. Stroom cytometry gegevens is verkregen op de UNC-Stroom Cytometry Core faciliteit gefinancierd door een P30 CA016086 Cancer Center Core ondersteuning subsidie aan de UNC-Lineberger uitgebreide Cancer Center.

1) lijn celkweek voor het produceren van Lentivirus
<ol><li>Groeien vers, lage-passage (minder dan een passage 30) 293T menselijke embryonale nier (HEK) cellen in hoge-glucose Dulbecco Eagle gewijzigd van het medium (DMEM) base media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x van niet-essentiële aminozuren (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol in een incubator 37 ° C met 5% CO2. De cellen splitsen elke 3-5 d en voordat ze > 95% heuvels.</li>
	<li>Passage 293T HEK cellen met 18 x 10-<su...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

We beschreven hier, de onlangs ontwikkelde CEM systeem wordt toegepast voor het regelen van genexpressie en chromatine omgeving op een specifiek gen op een dosis-afhankelijke manier. Wij bieden een nauwkeurige methode om te studeren van de dynamiek die betrokken zijn bij het reguleren van de genexpressie door de selectieve aanwerving van specifieke endogene chromatine regelgevende eiwitten. Dit is een zeer modulair technologie die kan worden toegepast om te onderzoeken hoe de verschillende eiwit - en chromatine-aanpassen...

Chromatine bestaat van DNA, histone octamer eiwitten die de kern nucleosoom particle vormen gewikkeld. Regulering van de chromatine verdichting is een essentieel mechanisme voor goede DNA reparatie, replicatie en expressie1,2,3. Unidirectioneel in die cellen het toegangsniveau verdichting is door de toevoeging of verwijdering van verschillende posttranslationele Histon staart wijzigingen. Twee dergelijke wijzigingen omvatten lysine (1) acetylation, die wordt meestal geassocieerd met gene activering, en (2) lysine methylering, die kan worden gekoppeld aan gene activering of onderdrukking, afhankelijk van de context van het aminozuur. De toevoeging van de acetylation en methylation merken wordt gekatalyseerd door Histon acetyltransferases (hoeden) en Histon methyltransferases (HMTs), respectievelijk, overwegende dat de opheffing van het merk wordt gedaan door Histon deacetylases (HDACs) en Histon demethylases (HDMs ), respectievelijk4,5. Hoewel het bestaan van deze eiwitten is gekend voor decennia, veel mechanismen van hoe chromatine-aanpassen machines blijven werken voor het goed regelen van genexpressie vast te stellen. Aangezien chromatine regelgevingsprocessen dysregulated in vele ziekten bij de mens, kunnen nieuwe mechanistische inzichten leiden tot toekomstige therapeutische toepassingen.
De chromatine in vivo test (CiA) is een recent beschreven techniek die een chemische inductor van nabijheid (CIP gebruikt) om controle van machines werving chromatine-aanpassen aan een specifieke locus6. Deze technologie is gebruikt om te bestuderen van een groeiende lijst van chromatine dynamiek, waaronder eiwitten Histon-aanpassen, chromatine remodelers en transcriptie factoren6,7,8,9. CIP gebaseerde chromatine binden van exogenously uitgedrukt eiwitten is ook uitgebreid verleden CiA te moduleren van niet-gemodificeerde genetische loci door gebruik met een gedeactiveerde geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische wordt herhaald CRISPR-geassocieerde proteïne (dCas9) 10 , 11. in het systeem van de CiA, mESCs zijn gewijzigd om een verslaggever GFP-gen op de locus van Oct4 , een zeer uitgesproken en strikt gereguleerde gebied van het genoom mESC express. Eerder, dit systeem is toegepast om te beschrijven de dosisafhankelijk en omkeerbare aanwerving van exogenously uitgesproken heterochromatin eiwit 1 (ML1), een enzym dat bindt H3K9me3 en repressieve merken (bvH3K9me3) wordt doorgegeven en DNA Methylation van6. Om te bereiken dit soort rekruteringsstrategie, zijn de mESCs besmet met een plasmide die een FK506-bindend-proteïne (FKBP), gekoppeld aan een Gal4, die een DNA-proteïne-anker dat zich aan een scala van Gal4-bindende stroomopwaarts van het GFP-verslaggever bindt uitdrukt. De cellen zijn ook besmet met een FKBP-rapamycin-bindend domein (FRB) verbonden met HP1. Wanneer de mESCs worden blootgesteld aan lage nanomolar concentraties van het CIP, rapamycin, zowel FRB en FKBP, zijn samengebracht op de locus van het doel. Binnen enkele dagen van rapamycin behandeling, expressie van het target-gen wordt onderdrukt, zoals blijkt uit de fluorescentie microscopie en stroom cytometry en Histon acetylation daalt, aangetoond door ChIP en bisulfiet sequentiebepaling. Terwijl de ontwikkelings- en valideringsfase van deze aanpak aanzienlijke vooruitgang op het gebied van chromatine onderzoek en regelgeving zijn, een nadeel is de vereiste exogene uitdrukking van chromatine-aanpassen machines.
Te maken van de technologie op basis van werving van alleen endogene fysiologisch relevante enzymen en maken een meer modulair systeem, we ontworpen en gekenmerkt roman bifunctionele moleculen, systemen voor continue emissiemeting (Figuur 1)12genoemd. Een onderdeel van het CEMs bevat FK506 die, vergelijkbaar met rapamycin, strak en specifiek bindt aan FKBP. De CEMs zullen dus nog steeds worden aangeworven om de locus Oct4 in de mESCs van de CiA. De andere component van het CEMs is een groep die endogene chromatine-aanpassen machines bindt. In een pilot-studie, we getest CEMs die HDAC remmers bevatten. Hoewel het concept van het gebruik van een inhibitor van de omwenteling te werven HDACs contra-intuïtief lijkt, is de Inhibitor van de omwenteling toch kunnen aanwerven HDAC activiteit naar het gen van belang. Dit wordt bereikt door (1) het omleiden van de HDAC naar de locus, het vrijgeven van het enzym, en het verhogen van de dichtheid van niet-geremde HDACs in het gebied en (2) handhaving HDAC inhibition op de locus, maar het werven repressieve complexen die zich aan de geremde HDACs binden, of (3) een combinatie van beide. In een eerdere studie, we toonden dat het CEMs kundig voor met succes het onderdrukken van het GFP-verslaggever op een dosis - en tijd-afhankelijke manier, alsmede op een wijze die was snel omkeerbaar (dat wil zeggen, binnen 24 uur)12. We het vermogen van de technologie van de CEM hier gepresenteerd aan controle genexpressie met behulp van fluorescentie microscopie, cytometry van de stroom en de mogelijkheid om te controleren de chromatine-omgeving met behulp van de ChIP-qPCR6gekenmerkt. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik en karakteriseren van het CEMs, die de aanpassing van dit systeem vergemakkelijken zal te beantwoorden van aanvullende vragen met betrekking tot de chromatine biologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Regulering van de chromatine verdichting is een belangrijk proces dat genexpressie in hogere eukaryoten regelt. Hoewel chromatine verdichting en genregulatie expressie zijn vaak verstoord in veel ziekten, heeft een locus-specifieke, endogene en omkeerbare methode te bestuderen en deze controlemechanismen van actie ontbroken. Om aan te pakken dit probleem, hebben wij ontwikkeld en nieuwe gen-regulering bifunctionele moleculen gekenmerkt. Een onderdeel van het bifunctionele molecule bindt aan een DNA-proteïne-anker zodat het naar een allele-specifieke locus zullen worden aangeworven. De andere component bezighoudt endogene cellulaire chromatine-aanpassen machines, werven van deze eiwitten aan een gen van belang. Deze kleine moleculen, chemische epigenetische modifiers (CEMs), genaamd zijn geschikt voor het beheren van genexpressie en de chromatine milieu dosisafhankelijk en omkeerbare wijze. Hier, detail wij een CEM-aanpak en de toepassing ervan om genuitdrukking en Histon staart acetylation op een verslaggever van de groen fluorescente proteïne (GFP) gelegen op het Oct4 locus in muis embryonale stamcellen (mESCs) te verlagen. We karakteriseren de leiding CEM (CEM23) met behulp van fluorescentie microscopie en stroom cytometry chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door een kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR). Terwijl de kracht van dit systeem is gedemonstreerd op de locus Oct4 , conceptueel, de technologie van CEM is modulair en kan worden toegepast in andere celtypes, en op andere genomic loci.

We onlangs ontwikkelde systemen voor continue emissiemeting en aangetoond dat deze technologie voor het regelen van genexpressie en de chromatine milieu op een verslaggever locus dosisafhankelijk en omkeerbare wijze kan worden toegepast. In Figuur 1wordt een model van het lood CEM, CEM23, weergegeven. HDAC machines is aangeworven om de verslaggever locus door de HDAC-inhibitor, die in dit geval de GFP-verslaggever aan de locus Oct4 ingevoegd.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenetica, zoals de mechanismen van genreregulering en oorzaak-en-gevolgrelaties tussen verschillende chromatine-regulerende elementen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het voor het eerst mogelijk is om een chromatine loci te moduleren met fysiologisch relevante endogene enzymen. Over het algemeen individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat muis ESL cultuur is inherent moeilijk voor degenen die niet zijn opgeleid in de techniek.Verdere demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als cel virale infectie stappen zijn moeilijk te leren. De onderzoeker moet tijd twee afzonderlijke lijnen van de celcultuur en het is noodzakelijk om waakzaam toezicht op de veiligheid tijdens deze stappen. Om te beginnen met het protocol, passage 18 miljoen van 293T HEK cellen per 50 centimeter plaat.Aspirate de oude media en voeg 10 milliliter van een X fosfaat gebufferde zoutoplossing, of PBS. Aspirate de PBS en voeg drie milliliter van 0,05% trypsine. Incubeer de cellen in trypsine gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius.Rock en tik op de cellen halverwege de incubatie. De volgende dag, wanneer de cellen 60 tot 80% samenvloeiing hebben bereikt, voert u een polyethyleen, of PEI, transfectie uit. Meng vervolgens voorzichtig het DNA, PEI en transfectiemedia in een 15 milliliter conische buis.Incubeer het monster 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg na incubatie de oplossing dropwise toe aan de 15 centimeter plaat. Vervolgens, incubeer het monster voor 16 uur in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide.De volgende dag, aspirate de media en voorzichtig vervangen door voorverwarmde, verse 293 HEK media aan de 15 centimeter platen. Na de media-uitwisseling, incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide voor 48 uur. Tel de cellen met een hemocytometer.Passage eerder bereid mESC in een 12 goed plaat formaat met 100,000 cellen per put een dag voorafgaand aan infectie. Voor cellen geteeld in een 10 centimeter formaat, aspirate de oude media, voeg vijf milliliter van een X PBS, aspirate de PBS, en voeg een milliliter van 0,25% trypsine. Incubeer de cellen in trypsine gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius en rock en tik de cellen halverwege de incubatie.48 uur na de media-uitwisseling, verwijderen en overdragen van de supernatant van de 293T HEK cellen naar een 50 milliliter conische buis. Centrifuge de supernatant op 300 keer G gedurende vijf minuten om de cel puin pellet. Vervolgens filtert u de supernatant door een membraan van 0,45 micron.Concentreer het virus via ultracentrifuge met een SW32-rotor en draai het monster twee en een half uur op 72.000 keer G bij vier graden Celsius. Terwijl het virus zich concentreert onder ultracentrifugatie, behandel de CIA mESC's in de 12 put plaat met verse embryonale stam of ES media met vijf microgram per milliliter polybrene. Wanneer de virusconcentratie is voltooid, zorgvuldig aanzuigen de supernatant en zorgvuldig opschorten het virus pellet in 100 microliter van een X PBS om overtollige bellen te voorkomen.Voeg het virus en een X PBS toe aan een 1,5 milliliter Microfuge buis. Vortex de buis op de laagste stand om het virus volledig op te schorten. Draai de buis in een mini tafelblad centrifuge gedurende vijf tot 10 seconden om bubbels te verwijderen.Voeg 30 microliter van het virus toe aan elke put van een 12 putplaat. Draai de plaat en centrifugeren de monsters op 1000 keer G gedurende 20 minuten. Plaats de 12 put plaat terug in de 37 graden Celsius incubator 's nachts.De volgende ochtend, de media uit te wisselen met verse ES-media en laat infectie plaatsvinden voor 48 uur. Na 48 uur infectie, selecteer voor cellen die de virale plasmid geïntegreerd door het toevoegen van de juiste antibioticum. Verander de media dagelijks.Houd de selectiemedia 72 tot 96 uur op de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide. Ga verder met chemische epigenetische modifier, of CEM, voorbereiding en behandeling door de CEM en dimethylsulfoxide, of DMSO, op te schorten tot een voorraadconcentratie van één millimolar en een werkconcentratie van 100 micromolar. Nadat de cellen selectie hebben ondergaan gedurende 72 tot 96 uur, splits de mESC's in een 12 put formaat met 100.000 cellen per put.Incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide gedurende 24 uur. Bereid na incubatie een mediaoplossing van 100 nanomolar CEM met ES-media voor. Gebruik de media om de CIA mESC te voeden met een milliliter goed.Houd een put van cellen zonder toegevoegde CEM's om te dienen als een controle. Vervolgens verander de media door het aspirating van de oude media en het toevoegen van een milliliter per goed off vers bereide CEM met of CEM gratis ES-media om de 24 uur voor de duur van het experiment. Na 48 uur behandeling cem, beeld de cellen zonder CEM behandeling in de cellen behandeld met 100 nanomolar CEM met behulp van een fluorescentie microscoop.Neem representatieve afbeeldingen met behulp van fase of helder veld om de mESC morfologie op te nemen bij 10 tot 40 keer vergroting. De cellen zouden zich rond kolonies met een paar onderscheiden cellen moeten gevormd hebben. Onder het FITC-fluorescentiekanaal geven beide celaandoeningen beeld.Vervolgens isoleer de controle en CEM behandelde cellen voor stroomcytometrie door de media te aspireren, de cellen te wassen met één milliliter van één X PBS, de PBS te aspireren en 0,25 milliliter van 0,25% trypsine toe te voegen met EDTA gedurende acht tot 10 minuten. Bevestig dat de cellen niet langer worden gebundeld in grote klonten door de microscoop met behulp van 20 keer vergroting. Als de cellen niet lijken te zijn in een enkele cel suspensie, voorzichtig pipette ze op en neer met een P1000 pipet om volledig trypsinize de cellen.Blus de trypsine met een milliliter verse media en resuspend de cellen op hoge snelheid met een serologische pipet totdat de cellen in een enkele cel suspensie. Draai vervolgens vijf minuten lang de cellen op 300 keer G bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant, was de cellen met een X PBS, en centrifugeren de cellen.Aspirate de PBS supernatant en resuspend de cel pellet in 200 microliters van FACS buffer. Voer stroomcytometrie uit op ongeveer 50.000 cellen met de zwevende cellen en voer de monsters uit met een schedesnelheid van ongeveer 5.000 cellen per seconde. Ten slotte exporteren van de gegevens voor verdere analyse.Fasebeelden van het CEM-systeem op de Oct4-locus en CIA mESC's worden afgebeeld na 48 uur behandeling met 100 nanomolar CEM23 of met onbehandelde cellen wijzen op specifieke GFP-onderdrukking. Fluorescerende beelden tonen een heldere GFP-expressie in de controlecellen en een verminderde GFP-expressie in mESC's behandeld met CEM23. Flow cytometrie toonde consequent een meer dan 30% afname van de GFP-expressie in de CIA mESC's behandeld met 100 nanomolar van CEM23 gedurende 48 uur.Chromatine immunoprecipitatie, of CHIP, zwelg dat 48 uur behandeling met 100 nanomolar van CEM23 het niveau van H3K27ac op de doel locus verminderde in vergelijking met controlecellen. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig te zijn met de muis embryonale stamcellen. Als ze tijdens het protocol differentiëren, worden de resultaten tenietgedaan.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van synthetische biologie om de in vivo mechanismen in het zoogdiergenoom te verkennen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Een snelle en chemische-vrij hemoglobine Assay met Fotothermisch Angular Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...