Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier les membres des laboratoires Hathaway et Jin pour leurs discussions utiles. Les auteurs remercient également Dan Crona et Ian MacDonald pour leur lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par Grant R01GM118653 de la U.S. National Institutes of Health (à N.A.H.) ; et de subventions R01GM122749, R01CA218600 et R01HD088626 de l’US National instituts de la santé (J.J.). Ce travail a été également soutenu par un tier 3 et étudiante au don de l’UNC Eshelman Institut pour l’Innovation (N.A.H et a.m.C, respectivement). Des fonds supplémentaires d’un GM007092 de T-32 (à a.m.C) pris en charge ce travail. Cytométrie en flux données ont été obtenues à l’UNC Flow Cytometry Core Facility financé par une subvention de soutien P30 CA016086 Cancer Center Core à l’UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) la Culture de cellules ligne de production de Lentivirus
<ol><li>Croissance fraîche, passage bas (moins de passage 30) cellules humaines embryonnaires de rein (HEK) 293 t en haut-glucose Dulbecco modifiée Eagle de médias de base moyen (DMEM) additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 10 mM HEPES, 1 x des acides aminés non essentiels (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2. Fractionner les cellules tous les 3-5 jours et avant qu’ils deviennent > 95 % ...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Ici, nous avons décrit le système développé récemment de SCE appliqué pour réguler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine à un gène spécifique de manière dose-dépendante. Nous fournissons une méthode précise pour étudier la dynamique impliquée dans la régulation de l’expression des gènes par le recrutement sélectif des protéines régulatrices spécifiques de chromatine endogène. Il s’agit d’une technologie hautement modulaire qui peut être appliquée pour étudier comm...

La chromatine est composée d’ADN enroulé autour des octamère d’histones qui forment la particule nucleosome de noyau. Régulation de la compaction de la chromatine est un mécanisme essentiel pour bon ADN réparation, réplication et expression1,2,3. Une façon dans lequel les cellules contrôlent le niveau de compactage est par le biais de l’ajout ou la suppression de diverses modifications de queue post-traductionnelles histone. Deux adaptations incluent l’acétylation lysine (1), qui est plus communément associée à l’activation de gènes, et la méthylation de la lysine (2), qui peut être associée à l’activation de gènes ou de répression, selon le contexte de l’acide aminé. L’ajout des marques acétylation et méthylation est catalysée par les histones acétyltransférases (chapeaux) et histone methyltransferases (HMTs), respectivement, alors que la suppression de la marque se faite par les histones désacétylases (HDAC) et histone déméthylases (HDMs ), respectivement de4,5. Bien que l’existence de ces protéines est connu depuis des décennies, bon nombre de mécanismes de machines modifiant la chromatine comment fonctionne à réguler correctement l’expression génique reste à définir. Étant donné que le processus de réglementation de la chromatine sont dysrégulation dans plusieurs maladies humaines, nouvelles perspicacités mécanistes pourraient conduire à des applications thérapeutiques futures.
La chromatine essai in vivo avec (CiA) est une technique récemment décrite qui utilise un inducteur chimique de proximité (CIP) pour contrôler le recrutement de machines modifiant la chromatine à un locus spécifique6. Cette technologie a été utilisée pour étudier une liste croissante de la dynamique de la chromatine, y compris la modification des histones des protéines, des rénovateurs de la chromatine et facteurs de transcription6,7,8,9. Axée sur le pic de la chromatine attacher des protéines exprimées de façon exogène a également été étendue au-delà de CiA pour moduler les loci génétiques non modifiés par usage avec une protéine associée à la cluster régulièrement entrecoupées court palindromique répète CRISPR-désactivée (dCas9) 10 , 11. dans le système de la CiA, les mESCs ont été modifiés pour exprimer un gène rapporteur GFP au locus Oct4 , une zone fortement exprimée et strictement réglementé du génome mESC. Auparavant, ce système a été appliqué pour décrire le recrutement réversible et dose-dépendante de protéine de l’hétérochromatine exogène expresse 1 (HP1), une enzyme qui lie H3K9me3 et propage répressifs marques (par exemple, H3K9me3) et l’ADN 6de méthylation. Pour accomplir ce type de stratégie de recrutement, les mESCs sont infectés par un plasmide qui exprime une protéine liant le FK506 (FKBP) liée à un Gal4, qui est un point d’ancrage d’ADN-protéine qui se lie à un tableau de Gal4-liaison en amont du reporter GFP. Les cellules sont également infectés par un domaine de liaison FKBP-rapamycine (FRB) connecté à HP1. Lorsque les mESCs sont exposés à des concentrations nanomolaires faible du pic, la rapamycine, FRB tant FKBP, sont réunis au locus de la cible. Quelques jours après traitement de la rapamycine, l’expression du gène cible est réprimée, comme en témoigne la fluorescence microscopie et écoulement cytometry et l’acétylation des histones est diminuée, ce qui témoigne de la puce et le séquençage de bisulfite. Le développement et la validation de cette approche ont eu des avancées significatives dans le domaine de la recherche de la chromatine et la réglementation, un inconvénient est l’expression exogène nécessaire modification de la chromatine machines.
Pour rendre la technologie basée sur le recrutement de seulement des enzymes endogènes physiologiquement pertinents et faire un système plus modulaire, nous avons conçu et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles, appelés CEMs (Figure 1)12. Une des composantes des CEMs comprennent FK506 qui, semblable à la rapamycine, lie étroitement et spécifiquement à FKBP. Ainsi, la SCE est encore recrutés au locus Oct4 dans les mESCs CiA. L’autre composante de la SCE est une fraction qui lie endogène machines modifiant la chromatine. Dans une étude pilote, nous avons testé les CEMs qui contiennent des inhibiteurs d’HDAC. Alors que le concept d’employer un inhibiteur pour recruter des HDACs semble contre-intuitif, l’inhibiteur est néanmoins capable de recruter activité HDAC pour le gène d’intérêt. Ceci est accompli en (1) redirigeant le HDAC au locus, libérant l’enzyme et augmentant la densité des HDACs non inhibés dans la région et l’inhibition d’HDAC (2) maintien au locus, mais recrutement complexes répressives qui se lient à l’HDAC inhibés, ou (3) une combinaison des deux. Dans une étude précédente, nous avons montré que la SCE était capables de réprimer avec succès le reporter GFP de façon dose - et dépendant du temps, ainsi que d’une manière qui a été rapidement réversible (c.-à-d., dans les 24 heures)12. Nous avons caractérisé la capacité de la technologie CEM présentée ici à l’expression de gène de contrôle à l’aide de la microscopie en fluorescence, cytométrie en flux et la capacité de contrôler l’environnement de la chromatine à l’aide de la puce-qPCR6. Nous décrivons ici une méthode pour l’utilisation et de caractériser les CEMs, qui faciliteront l’adaptation de ce système pour répondre à des questions liées à la biologie de la chromatine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Régulation de la compaction de la chromatine est un processus important qui régit l’expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. Bien que la compaction de la chromatine et la régulation de l’expression génique sont souvent perturbés dans de nombreuses maladies, une méthode spécifiques d’un locus, endogène et réversible pour étudier et contrôler ces mécanismes d’action a fait défaut. Pour résoudre ce problème, nous avons développé et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles régulation génique. Un composant de la molécule bifonctionnel se lie à un point d’ancrage de l’ADN-protéines afin qu’il sera recruté à un locus de l’allèle spécifique. L’autre composante engage les endogène machinerie modifiant la chromatine cellulaire, recrutement de ces protéines à un gène d’intérêt. Ces petites molécules, appelées modificateurs chimiques d’épigénétiques (CEMs), sont capables de contrôler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine de façon dose-dépendante et réversible. Nous détaillons ici, une approche CEM et sa demande visant à diminuer l’expression génique et l’acétylation des histones queue à un journaliste de la protéine fluorescente verte (GFP) situé sur le locus Oct4 dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Nous caractérisons les devants CEM (CEM23) à l’aide de la microscopie de fluorescence, cytométrie en flux et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), suivie d’une PCR quantitative (qPCR). Bien que la puissance de ce système est démontrée au locus Oct4 , sur le plan conceptuel, la technologie CEM est modulaire et peut être appliquée dans d’autres types cellulaires et autres locus génomiques.

Nous avons récemment développé CEMs et a démontré que cette technologie peut être appliquée pour réguler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine dans un locus de journaliste de manière dose-dépendante et réversible. Dans la Figure 1, un modèle du plomb CEM, CEM23, est montré. Machines d’HDAC est recruté au locus du journaliste par l’inhibiteur d’HDAC qui, dans ce cas, est le journaliste GFP inséré au locus Oct...

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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique telles que les mécanismes de régulation des gènes et les relations de cause à effet entre les différents éléments de régulation de la chromatine. Le principal avantage de cette technique est que pour la première fois il est possible de moduler un loci de chromatine avec des enzymes endogènes physiologiquement pertinentes. Généralement, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal parce que la culture de souris ESL est intrinsèquement difficile pour ceux qui n’ont pas été formés à la technique.Une autre démonstration de cette méthode est essentielle car les étapes de l’infection virale cellulaire sont difficiles à apprendre. Le chercheur doit mettre à temps deux lignées distinctes de culture cellulaire et il est nécessaire de surveiller avec vigilance la sécurité pendant ces étapes. Pour commencer le protocole, passage 18 millions de cellules HEK 293T par plaque de 50 centimètres.Aspirez les vieux supports et ajoutez 10 millilitres d’un salin tamponné au phosphate X, ou PBS. Aspirer le PBS et ajouter trois millilitres de trypsine de 0,05%. Incuber les cellules dans la trypsine pendant huit minutes à 37 degrés Celsius.Rocher et exploiter les cellules à mi-chemin de l’incubation. Le lendemain, lorsque les cellules ont atteint 60 à 80% de confluence, effectuer une polyéthyllènenimine, ou Î.-P.-É., transfection. Ensuite, mélangez doucement l’ADN, l’Î.-P.-É. et les médias transfection dans un tube conique de 15 millilitres.Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajouter la solution dropwise à la plaque de 15 centimètres. Ensuite, incuber l’échantillon pendant 16 heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain, aspirez les médias et remplacez-les doucement par des supports HEK frais et préchaautés aux plaques de 15 centimètres. Après l’échange de médias, incuber les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Comptez les cellules à l’amiomètre.Passage préalablement préparé mESC dans un format de 12 plaques de puits avec 100.000 cellules par puits un jour avant l’infection. Pour les cellules cultivées dans un format de 10 centimètres, aspirer l’ancien média, ajouter cinq millilitres d’un X PBS, aspirer le PBS, et ajouter un millilitre de 0,25% trypsine. Incuber les cellules dans la trypsine pendant huit minutes à 37 degrés Celsius et la roche et tapoter les cellules à mi-chemin de l’incubation.48 heures après l’échange de médias, enlever et transférer le supernatant des cellules HEK 293T dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le supernatant à 300 fois G pendant cinq minutes pour pelleter les débris cellulaires. Ensuite, filtrez le supernatant à travers une membrane de 0,45 micron.Concentrez le virus par ultracentrifugeuse avec un rotor SW32 et faites tourner l’échantillon à 72 000 fois G pendant deux heures et demie à quatre degrés Celsius. Alors que le virus se concentre sous ultracentrifugation, traiter le MESC CIA dans la plaque de 12 puits avec tige embryonnaire fraîche ou es médias contenant cinq microgrammes par millilitre de Polybrene. Lorsque la concentration du virus est terminée, aspirez soigneusement le supernatant et suspendez soigneusement la pastille virale dans 100 microlitres d’un X PBS pour éviter l’excès de bulles.Ajoutez le virus et un X PBS à un tube microfuge de 1,5 millilitre. Vortex le tube au réglage le plus bas pour suspendre complètement le virus. Faites tourner le tube dans une mini centrifugeuse de table pendant cinq à dix secondes pour enlever les bulles.Ajouter 30 microlitres du virus à chaque puits d’une plaque de puits de 12 puits. Faites tourbillonner la plaque, puis centrifugez les échantillons à 1000 fois G pendant 20 minutes. Remettre la plaque de 12 puits dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain matin, échangez les médias avec de nouveaux médias ES et autorisez l’infection pendant 48 heures. Après 48 heures d’infection, sélectionnez pour les cellules qui ont intégré le plasmide viral en ajoutant l’antibiotique approprié. Changez les médias tous les jours.Gardez le média de sélection sur les cellules pendant 72 à 96 heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Continuer avec le modificateur épigénétique chimique, ou CEM, la préparation et le traitement en suspendant le CEM en poudre et le sulphoxide diméthyle, ou DMSO, à une concentration de stock d’un millimolaire et une concentration de travail de 100 micromolaires. Une fois que les cellules ont subi une sélection de 72 à 96 heures, divisez les mESC en un format de 12 puits avec 100 000 cellules par puits.Incuber les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après incubation, préparez une solution média de 100 nanomolaires CEM avec des supports ES. Utilisez les médias pour alimenter le MESC de la CIA avec un millilitre de puits.Gardez un puits de cellules sans aucun CEM ajouté pour servir de contrôle. Ensuite, changez les médias en aspirant les anciens médias et en ajoutant un millilitre par CEM fraîchement préparé contenant ou cem médias ES gratuits toutes les 24 heures pour la durée de l’expérience. Après 48 heures de traitement de CEM, imagez les cellules sans traitement de CEM dans les cellules traitées avec le CEM de 100 nanomolar utilisant un microscope de fluorescence.Prenez des images représentatives à l’aide d’une phase ou d’un champ lumineux pour enregistrer la morphologie mESC à 10 à 40 fois le grossissement. Les cellules auraient dû se former autour de colonies avec quelques cellules différenciées. Sous le canal de fluorescence FITC, imagez les deux conditions cellulaires.Ensuite, isolez les cellules de contrôle et traitées par cem pour la cytométrie d’écoulement en aspirant le média, en lavant les cellules avec un millilitre d’un X PBS, en aspirant le PBS et en ajoutant 0,25 millilitres de trypsine de 0,25% avec EDTA pendant huit à 10 minutes. Confirmez que les cellules ne sont plus groupées en grosses touffes au microscope à l’aide d’un grossissement 20 fois. Si les cellules ne semblent pas être dans une suspension à cellule unique, les pipette doucement de haut en bas avec une pipette P1000 pour trypsiniser complètement les cellules.Étanchez la trypsine avec un millilitre de médias frais et resuspendez les cellules à grande vitesse avec une pipette sérologique jusqu’à ce que les cellules soient dans une suspension cellulaire unique. Ensuite, faites tourner les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant, laver les cellules avec un X PBS, et centrifuger les cellules.Aspirez le supernatant PBS et réutilisez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon FACS. Effectuez la cytométrie d’écoulement sur environ 50 000 cellules avec les cellules suspendues et exécutez les échantillons à une vitesse de gaine d’environ 5000 cellules par seconde. Enfin, exportez les données pour une analyse plus approfondie.Les images de phase du système CEM au locus oct4 et au mESC de la CIA sont photographiées après 48 heures de traitement avec 100 nanomolaires de CEM23 ou avec des cellules non traitées indiquent une répression spécifique du GFP. Les images fluorescentes montrent une expression lumineuse de GFP dans les cellules de commande et une expression réduite de GFP dans mESC’s traité avec CEM23. La cytométrie de flux a uniformément indiqué une diminution plus grande de 30% de l’expression de GFP dans le mESC de CIA traité avec 100 nanomolar de CEM23 pendant 48 heures.L’immunoprécipitation de chromatine, ou CHIP, s’est délecté que 48 heures de traitement avec 100 nanomolar de CEM23 ont diminué le niveau de H3K27ac au locus cible par rapport aux cellules de contrôle. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’être prudent avec les cellules souches embryonnaires de souris. S’ils se différencient pendant le protocole, les résultats seront annulés.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie synthétique pour explorer les mécanismes in vivo dans le génome des mammifères.

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Transcription: DNA to RNA

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

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