Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Hathaway e Jin per le loro discussioni utili. Gli autori ringraziano anche Dan Crona e Ian MacDonald per loro lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grant R01GM118653 da US National Institutes of Health (a N.A.H.); e di sovvenzioni R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 da l'US National istituti di salute (per J.J.). Questo lavoro è stato supportato anche da un tier 3 e uno studente concedere da UNC Eshelman Istituto per l'innovazione (per N.A.H e A.M.C, rispettivamente). Finanziamenti aggiuntivi da un GM007092 di T-32 (al A.M.C) sostenuto questo lavoro. Dati di citometria a flusso è stati ottenuti presso la UNC flusso Cytometry Core Facility finanziata da una sovvenzione di supporto P30 CA016086 Cancer Center Core a UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) coltura di linea delle cellule per la produzione di Lentivirus
<ol><li>Fresco, crescere basso-passaggio (meno di passaggio 30) cellule embrionali umane del rene (HEK) 293T in alto-glucosio Dulbecco s modified Eagle di base media medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 10 mM HEPES, 1x gli aminoacidi non essenziali (NEAA), penna / STREP, 2-mercaptoenthanol in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2. Dividere le celle ogni 3-5 p e prima che diventino > 95% confluenti.</li>
	<li>Passaggio di ce...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Qui, abbiamo descritto il sistema CEM recentemente sviluppato applicato per regolare l'espressione genica e ambiente di cromatina a un gene specifico in modo dose-dipendente. Forniamo un metodo accurato per studiare le dinamiche coinvolte nella regolazione dell'espressione genica attraverso il reclutamento selettivo di proteine regolatrici della cromatina endogeno specifico. Si tratta di una tecnologia altamente modulare che può essere applicata per studiare come le diverse proteine - e cromatina-modificando complessi f...

Cromatina è costituito da DNA avvolto intorno alle proteine istoniche istonico che formano la particella nucleosome core. Regolamento di compattazione della cromatina è un meccanismo essenziale per il corretto DNA riparazione, replica e l'espressione1,2,3. Un modo in cui le cellule controllano il livello di compattazione è attraverso l'aggiunta o la rimozione di varie modifiche di coda post-traduzionali degli istoni. Due tali modifiche includono l'acetilazione di lisina (1), che è più comunemente associato con l'attivazione del gene, e (2) lisina metilazione, che può essere associata con l'attivazione del gene o repressione, a seconda del contesto dell'amminoacido. L'aggiunta di segni di acetilazione e metilazione è catalizzata da utilizzando istone acetiltransferasi (Hat) e istone metiltransferasi (HMTs), rispettivamente, mentre la rimozione del marchio avviene istone deacetilasi (HDACs) e istone JmjC (HDMs ), rispettivamente di4,5. Anche se l'esistenza di queste proteine è stato conosciuto per decenni, molti meccanismi di macchinari come modificante la cromatina opere per regolare correttamente l'espressione genica rimangono da definire. Poiché i processi di regolazione della cromatina sono dysregulated in molte malattie umane, nuove comprensioni meccanicistiche potrebbero portare a future applicazioni terapeutiche.
La cromatina in vivo assay (CiA) è una tecnica recentemente descritta che utilizza un induttore chimico di prossimità (CIP) per controllare l'assunzione di macchinari modificante la cromatina a un locus specifico6. Questa tecnologia è stata usata per studiare una lista sempre di dinamica della cromatina, tra cui istone-modificando le proteine, remodelers della cromatina e trascrizione fattori6,7,8,9. CIP-basato della cromatina tethering delle proteine espresse esogenicamente è stato esteso anche passato CiA per modulare loci genetici non modificato da utilizzare con una disattivato cluster regolarmente intervallate breve palindromi ripete CRISPR-collegata della proteina (dCas9) 10 , 11. nel sistema di CiA, mESCs sono stati modificati per esprimere un gene reporter GFP presso il locus Oct4 , una zona altamente espresso e rigorosamente regolamentato del genoma mESC. In precedenza, questo sistema è stato applicato per descrivere il reclutamento dose-dipendente e reversibile della proteina di eterocromatina esogenicamente espresso 1 (HP1), un enzima che lega H3K9me3 e propaga repressivi marchi (ad esempio, H3K9me3) e DNA metilazione6. Per realizzare questo tipo di strategia di reclutamento, la mESCs sono infettati con un plasmide che esprime una proteina di FK506-legante (FKBP) collegata a un Gal4, che è un ancoraggio della DNA-proteina che si lega a una matrice di Gal4-associazione a Monte del reporter GFP. Le cellule inoltre sono infettate con un dominio FKBP-rapamicina-legante (FRB) collegato al HP1. Quando il mESCs sono esposti a concentrazioni nanomolari bassa del CIP, rapamicina, FRB sia FKBP, sono riuniti presso il luogo di destinazione. Nei giorni del trattamento rapamicina, espressione del gene dell'obiettivo è represso, come evidenziato da citometria a flusso e microscopia di fluorescenza e acetilazione dell'istone è diminuita, mostrato da ChIP e del bisolfuro. Mentre lo sviluppo e la convalida di questo approccio sono stati significativi progressi nel campo della ricerca della cromatina e regolamento, uno svantaggio è necessaria espressione esogena di modificante la cromatina macchinari.
Per rendere la tecnologia basata sul reclutamento degli enzimi fisiologicamente rilevanti solo endogeni ed effettuare un sistema più modulare, abbiamo progettato e caratterizzato nuove molecole bifunzionali, definiti CEMs (Figura 1)12. Uno dei componenti del CEMs comprende FK506 che, simile alla rapamicina, lega strettamente e specificamente a FKBP. Così, il CEMs ancora saranno reclutati al locus Oct4 in mESCs La CiA. L'altra componente del CEMs è una molecola che lega endogeno modificante la cromatina macchinari. In uno studio pilota, abbiamo testato CEMs che contengono inibitori HDAC. Mentre il concetto di usare un inibitore di reclutare HDACs sembra contro-intuitivo, l'inibitore è comunque in grado di reclutare attività di HDAC al gene di interesse. Questa operazione viene eseguita (1) reindirizzando le HDAC al locus, rilasciando l'enzima e aumentando la densità di ONU-inibito HDACs nella zona e inibizione di HDAC (2) mantenere a livello del locus, ma complessi repressivi che si legano a HDACs inibito, di reclutamento o (3) una combinazione di entrambi. In uno studio precedente, abbiamo mostrato che il CEMs erano in grado di reprimere con successo il reporter GFP in maniera dose - e tempo-dipendente, così come in un modo che era rapidamente reversibile (cioè, entro 24 ore)12. Abbiamo caratterizzato la capacità della tecnologia CEM presentata qui per controllare l'espressione genica mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e la capacità di controllare l'ambiente di cromatina utilizzando ChIP-qPCR6. Qui, descriviamo un metodo per l'utilizzo e che caratterizzano il CEMs, che faciliterà l'adattamento di questo sistema di rispondere a ulteriori domande legate alla biologia della cromatina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Regolamento di compattazione della cromatina è un importante processo che regola l'espressione genica negli eucarioti superiori. Anche se la compattazione della cromatina e regolazione dell'espressione genica sono interrotti comunemente in molte malattie, un metodo di luogo-specific, endogeno e reversibile per studiare e controllare questi meccanismi d'azione è stata carente. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato e caratterizzato molecole bifunzionali diregolamenti. Un componente della molecola bifunzionale associa a un ancoraggio della DNA-proteina in modo che che saranno assunti per un locus allele-specifico. L'altro componente si impegna endogeno macchinario cellulare modificante la cromatina, reclutamento di queste proteine ad un gene di interesse. Queste piccole molecole, chiamate modificatori epigenetici chimici (CEMs), sono in grado di controllare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in maniera dose-dipendente e reversibile. Qui, dettagliamo un approccio CEM e la sua applicazione per fare diminuire l'espressione genica e l'acetilazione dell'istone coda presso un reporter della proteina fluorescente verde (GFP) situato al luogo del Oct4 in cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Ci caratterizzano il piombo CEM (CEM23) utilizzo di microscopia fluorescente, citometria a flusso e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), seguita da una reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Mentre il potere di questo sistema è dimostrato a livello del locus Oct4 , concettualmente, la tecnologia CEM è modulare e può essere applicata in altri tipi cellulari e in altri loci genomici.

Abbiamo recentemente sviluppato CEMs ed abbiamo dimostrato che questa tecnologia può essere applicata per regolare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in un locus di reporter in modo dose-dipendente e reversibile. In Figura 1, un modello del piombo CEM, CEM23, si vede. Macchinari HDAC sono reclutato per il locus reporter dall'inibitore HDAC che, in questo caso, è il reporter GFP inserito a livello del locus Oct4 .
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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come i meccanismi di regolazione genica e le relazioni di causa ed effetto tra diversi elementi regolatori della cromatina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che per la prima volta è possibile modulee un loci di cromatina con enzimi endogeni fisiologicamente rilevanti. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché la cultura ESL del mouse è intrinsecamente difficile per coloro che non sono stati addestrati nella tecnica.Un'ulteriore dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di infezione virale cellulare sono difficili da imparare. Il ricercatore deve temporeggiare due linee separate di coltura cellulare ed è necessario monitorare attentamente la sicurezza durante queste fasi. Per iniziare il protocollo, passare 18 milioni di cellule HEK 293T per piastra di 50 centimetri.Aspirare il vecchio supporto e aggiungere 10 millilitri di una salina tamponata con fosfato X, o PBS. Aspirare il PBS e aggiungere tre millilitri dello 0,05% di trippsina. Incubare le cellule in tripsiderina per otto minuti a 37 gradi Celsius.Dondolare e toccare le cellule a metà dell'incubazione. Il giorno seguente, quando le cellule hanno raggiunto la confluenza dal 60 all'80%, eseguire una trasfezione di polietilenimina, o PEI. Successivamente, mescolare delicatamente il DNA, il PEI e i mezzi di trasfezione in un tubo conico da 15 millilitri.Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere la soluzione dropwise alla piastra di 15 centimetri. Quindi, incubare il campione per 16 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Il giorno successivo, aspirare il supporto e sostituirlo delicatamente con supporti HEK freschi e prebellici alle piastre da 15 centimetri. Dopo lo scambio di media, incubare le cellule in un incubatore Celsius di 37 gradi con 5% di anidride carbonica per 48 ore. Conta le cellule con un emocitometro.Passaggio precedentemente preparato mESC in un formato a piastra di 12 po porsi con 100.000 cellule per pozzo un giorno prima dell'infezione. Per le celle coltivate in un formato di 10 centimetri, aspirare il vecchio supporto, aggiungere cinque millilitri di un X PBS, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside. Incubare le cellule in tripsiderina per otto minuti a 37 gradi Celsius e dondolare e toccare le cellule a metà dell'incubazione.48 ore dopo lo scambio di supporti, rimuovere e trasferire il supernatante delle celle HEK 293T in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il supernatante a 300 volte G per cinque minuti per pellettare i detriti cellulari. Quindi, filtrare il supernatante attraverso una membrana da 0,45 micron.Concentrare il virus tramite ultracentrifugo con un rotore SW32 e ruotare il campione a 72.000 volte G per due ore e mezza a quattro gradi Celsius. Mentre il virus si concentra sotto ultracentrifugazione, trattare i CIA mESC nella piastra di 12 pozzi con gambo embrionale fresco o mezzi ES contenenti cinque microgrammi per millilitro di Polibrene. Al termine della concentrazione del virus, aspirare accuratamente il supernatante e sospendere attentamente il pellet del virus in 100 microlitri di un X PBS per evitare bolle in eccesso.Aggiungere il virus e un X PBS a un tubo di microfugo da 1,5 millilitri. Vortice il tubo all'impostazione più bassa per sospendere completamente il virus. Girare il tubo in una mini centrifuga da tavolo per cinque-10 secondi per rimuovere le bolle.Aggiungere 30 microlitri del virus ad ogni pozzo di una piastra da 12 porri. Ruotare la piastra e quindi centrifugare i campioni a 1000 volte G per 20 minuti. Posizionare la piastra di 12 pozzi nell'incubatore di 37 gradi Celsius durante la notte.La mattina seguente, scambiare i media con nuovi mezzi ES e consentire l'infezione per 48 ore. Dopo 48 ore di infezione, selezionare per le cellule che hanno integrato il plasmide virale aggiungendo l'antibiotico appropriato. Cambia i media ogni giorno.Conservare il supporto di selezione sulle celle per 72-96 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5%. Continuare con modificatore epigenetico chimico, o CEM, preparazione e trattamento sospendendo il CEM in polvere e il solfossido di dimetile, o DMSO, a una concentrazione di magazzino di un millimolare e una concentrazione di lavoro di 100 micromolare. Dopo che le celle sono state sottoposte a selezione per 72-96 ore, dividere le mESC in un formato a 12 pozzi con 100.000 celle per pozzo.Incubare le cellule in un incubatore celsius di 37 gradi con 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo l'incubazione, preparare una soluzione media di CEM nanomolare 100 con mezzi ES. Usa i supporti per alimentare il CIA mESC con un pozzo millilitro.Mantenere un pozzo di celle senza alcun CEM aggiunto per fungere da controllo. Successivamente, cambiare i supporti aspirando i vecchi supporti e aggiungendo un millilitro per pozzo CEM appena preparato contenente o supporti ES senza CEM ogni 24 ore per tutta la durata dell'esperimento. Dopo 48 ore di trattamento CEM, immagini le cellule senza trattamento CEM nelle cellule trattate con CEM nanomolare 100 utilizzando un microscopio a fluorescenza.Scatta immagini rappresentative usando la fase o il campo luminoso per registrare la morfologia mESC con un ingrandimento da 10 a 40 volte. Le cellule avrebbero dovuto formare attorno a colonie con alcune cellule differenziate. Sotto il canale di fluorescenza FITC, immagini entrambe le condizioni cellulari.Successivamente, isolare le cellule di controllo e trattate con CEM per la citometria del flusso aspirando il mezzo, lavando le celle con un millilitro di un X PBS, aspirando il PBS e aggiungendo 0,25 millilitri dello 0,25% di tripside con EDTA per otto-10 minuti. Verificare che le cellule non siano più raggruppate in grandi grumi attraverso il microscopio utilizzando l'ingrandimento 20 volte superiore. Se le celle non sembrano essere in una singola sospensione cellulare, pipettarle delicatamente su e giù con una pipetta P1000 per tripinare completamente le cellule.Dissetare la tripina con un millilitro di mezzi freschi e rimorsiva le cellule ad alta velocità con una pipetta sierologica fino a quando le cellule non sono in una singola sospensione cellulare. Quindi, far girare le cellule a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lavare le cellule con un X PBS e centrifugare le cellule.Aspirare il supernatante PBS e rimescolare il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone FACS. Eseguire la citometria a flusso su circa 50.000 cellule con le cellule sospese ed eseguire i campioni a una velocità di sheath di circa 5.000 cellule al secondo. Infine, esportare i dati per ulteriori analisi.Le immagini di fase del sistema CEM presso il locus Oct4 e il CIA mESC sono immagini dopo 48 ore di trattamento con 100 nanomolari di CEM23 o con cellule non trattate indicano una specifica repressione della GFP. Le immagini fluorescenti mostrano un'espressione GFP brillante nelle celle di controllo e un'espressione GFP ridotta in mESC trattata con CEM23. La citometria del flusso ha costantemente rivelato una diminuzione superiore al 30% dell'espressione della GFP negli mESC della CIA trattati con 100 nanomolari di CEM23 per 48 ore.L'immunoprecipitazione della cromatina, o CHIP, ha rivelato che 48 ore di trattamento con 100 nanomolari di CEM23 hanno diminuito il livello di H3K27ac al locus bersaglio rispetto alle cellule di controllo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di stare attenti con le cellule staminali embrionali del topo. Se si differenziano durante il protocollo, i risultati verranno annullati.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia sintetica per esplorare i meccanismi in vivo nel genoma dei mammiferi.

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Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

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Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

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