Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
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著者は、役に立つ議論のため・ ハサウェイとジンの研究所のメンバーに感謝したいと思います。著者も原稿の彼らの重要な読書のダン クロナとイアン ・ マクドナルドに感謝します。この作品は一部 (N.A.H.); に米国国立保健研究所から助成金 R01GM118653 によって支えられました。助成金 R01GM122749、R01CA218600 と R01HD088626 米国国立から衛生研究所 (JJ) に。この作品も、層によって支えられた UNC Eshelman イノベーション研究所からの 3 および学生を与える (N.A.H し A.M.C、それぞれ)。(A.M.C) に T-32 GM007092 から追加の資金は、この仕事を支えた。フローサイトメトリーは、UNC 施設に P30 CA016086 がんセンター コア助成金によって資金を供給された UNC 流れ Cytometry 中核施設でデータが得られました。

1) レンチを製造ライン培養
<ol><li>成長低通路 (通路 30 未満) では、新鮮な高グルコース ダルベッコ人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞のイーグル、変更された培地 (DMEM) 基本メディア添加 10% 牛胎児血清 (FBS) 10 mM HEPES、非本質的なアミノ酸 (NEAA) ペン × 1/連鎖球菌、2-5% CO2と 37 ° C の定温器で mercaptoenthanol。すべての 3-5 d セルを分割および > 95% の合流になる前に。</li>
	<li>18 × 106</su...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

ここでは、用量依存的遺伝子発現と特定の遺伝子のクロマチン環境を規制する適用される最近開発された CEM システムについて述べる。我々 は特定の内因性クロマチン制御調節タンパク質の選択的採用活動によって遺伝子発現の調節に関与するダイナミクスを研究する正確な方法を提供します。これは適用することができます非常にモジュール技術蛋白質-クロマチン修飾の異なる方法を調査...

クロマチンは、DNA は、ヌクレオソーム粒子を形成するヒストン八量体タンパク質を包んだので構成されます。クロマチンの凝縮の規制は、適切な DNA 修復、レプリケーション、および式1,2,の3重要な仕組みです。細胞が圧縮のレベルを制御する方法の 1 つはまた、さまざまな翻訳後修飾ヒストンの尾の除去です。このような 2 つの変更には、遺伝子の活性化に最もよく関連付けられる (1) リジンのアセチル化と遺伝子の活性化や抑制、アミノ酸コンテキストに応じて関連付けることができます (2) リジンのメチル化が含まれます。アセチル化とメチル化マークの追加により触媒されるヒストン コリンアセチルトランスフェラーゼ (帽子) およびヒストンのメチル基転移酵素 (HMTs)、それぞれがマークの除去はヒストン脱アセチル化酵素 (Hdac) とヒストン脱メチル化酵素 (焦点によって行われます)、それぞれ4,5。これらの蛋白質の存在が知られていた何十年も、多くのメカニズムを定義するどのクロマチン修飾機械の遺伝子発現を適切に規制する作品が残っています。クロマチン規制プロセスは多くの人間の病気の調節不全なので新しい力学的洞察の将来の治療への応用に 。
アッセイ体内クロマチン (CiA) は、特定の軌跡6機械募集のクロマチン修飾を制御する近接 (CIP) の化学誘導を使用して最近説明手法です。この技術は、タンパク質のヒストン修飾、クロマチンの remodelers トランスクリプション要因6,7,8,9などのクロマチン動態の拡大のリストを勉強する使用されています。Cip 法に基づいたクロマチンが外に表現された蛋白質のテザリングもによって拡張されている過去の非変更された遺伝子座を調節する CiA 非アクティブ クラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す CRISPR 関連タンパク質 (dCas9) で使用10,11. Oct4遺伝子座、mESC ゲノムの高発現と厳しく規制された地域で GFP レポーター遺伝子を表現する CiA システムの mESCs が変更されました。外に表明したヘテロクロマチン蛋白質 1 (HP1)、H3K9me3 を結合し、抑圧的な印 (例えばH3K9me3) を伝達酵素の用量依存的かつ可逆的な募集を記述するこのシステムが適用された以前は、DNA とメチル化6。このタイプの募集戦略を達成するために、mESCs は GFP レポーターの上流 Gal4 結合配列に結合する DNA タンパク質アンカーの Gal4 にリンク FK506 結合タンパク質 (FKBP) を表現するプラスミッドに感染しています。セルは HP1 に接続 FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB) にも感染しています。MESCs は、CIP の低ナノモル濃度にさらされれば、ラパマイシン、FRB と FKBP、ターゲット遺伝子座で一緒に取り込まれます。ラパマイシン標的治療の日、ターゲット遺伝子の発現が抑制され、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーによって証明されるよう、ヒストンのアセチル化を減少すると、チップと重亜硫酸塩の配列によって示されています。開発とこのアプローチの妥当性クロマチン研究と規制の分野で重要な進歩をされている、1 つの欠点はクロマチン修飾の外因性表現が求められる機械。
内因性の生理学的に関連した酵素のみの募集に基づく技術よりモジュラー システムの設計し、CEMs (図 1)12と呼ばれる塩基分子の特徴します。CEMs の 1 つのコンポーネントが含まれますラパマイシンのようしっかりと具体的にバインド FK506 には FKBP に。したがって、CEMs は CiA mESCs Oct4遺伝子座には募集まだ。CEMs の他のコンポーネントは、内因性クロマチン修飾機械を結合する部位です。パイロット研究では、CEMs HDAC の抑制剤が含まれているをテストしました。Hdacs をしたを募集する阻害剤を使用してのコンセプトは直感に反するようだ、阻害物質は興味の遺伝子に HDAC 活動を募集することができるそれにもかかわらず。これは、(1)、酵素を解放エリアに位置し、座 (2) 維持する HDAC 阻害 hdacs を非抑制したの密度を増加させ、バインド hdacs を抑制した抑圧的な複合体を採用、軌跡へ、HDAC のリダイレクトで(3)、または両方の組み合わせ。以前の研究では、CEMs が正常に用量と時間依存の方法でだけでなく、急速に可逆的であった方法で GFP レポーターを抑制できたことを示しました (すなわち、24 時間以内)12。蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、および機能を使用して、チップ qPCR6を使用してクロマチン環境を制御する遺伝子の発現を制御する紹介 CEM 技術の能力を特徴とします。ここを使用して、クロマチン生物学に関連する質問に答えるこの制度の適応を容易にする CEMs を特徴付けるのための方法について述べる.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

クロマチンの凝縮の規制は、高等真核生物における遺伝子発現を制御する重要なプロセスです。クロマチンの凝縮と遺伝子発現制御は通常、多くの病気で中断されたが研究し、アクションのこれらのメカニズムを制御する特定の軌跡、内因性、および可逆メソッドを欠いてきた。この問題に対処するため開発し、遺伝子調節塩基分子の特徴します。二官能性の分子の 1 つのコンポーネントは、対立遺伝子特定の遺伝子座に採用されるので、DNA タンパク質アンカーにバインドします。その他のコンポーネントは、内因性細胞クロマチン修飾機械装置、興味の遺伝子にこれらの蛋白質を募集を行っています。化学のエピジェネティックな修飾剤 (CEMs) と呼ばれるこれらの小さい分子は用量依存的かつ可逆的に遺伝子発現とクロマチン環境を制御することが可能です。ここでは、我々 は CEM アプローチと遺伝子の発現とマウス胚性幹細胞 (mESCs) のOct4遺伝子座にある緑色蛍光タンパク質 (GFP) 記者でヒストンの尾のアセチル化を減少への応用を詳しく説明します。我々 はリードを特徴付ける CEM (CEM23) 蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、クロマチン免疫沈降 (チップ) を使用して量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 続きます。概念的には、 Oct4遺伝子座でこのシステムの力を発揮しながら、CEM 技術はモジュール化され他の細胞型、他のゲノムの遺伝子座に適用できます。

最近、CEMs を開発し、用量依存的かつ可逆的に遺伝子発現とレポーター遺伝子座でクロマチン環境を規制するこの技術を適用できることを示した。図 1に、鉛のモデル CEM、CEM23 が表示されます。HDAC 機械記者軌跡に HDAC 阻害剤である、この場合、 Oct4遺伝子座で挿入される GFP レポーターによって募集しています。
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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

この方法は、遺伝子調節のメカニズムや異なるクロマチン調節要素間の因旨と結果関係などのエピジェネティクス分野の主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、初めて生理学的に関連する内因性酵素を有するクロマチン遺伝子座をモジュール化することができる点である。一般的に、この方法に新しい個人は、マウスのESL培養は、この技術の訓練を受けていない人にとって本質的に困難であるため、苦労します。この方法のさらなるデモンストレーションは、細胞ウイルス感染ステップが学習することが困難であるため、重要である。研究者は、細胞培養の2つの別々のラインを時間を計る必要があり、これらのステップ中に安全を警戒して監視する必要があります。プロトコルを開始するために、50センチメートルプレートあたり293T HEK細胞の1800万個を通過させる。古い培地を吸引し、1つのXリン酸緩衝生理食塩水、またはPBSの10ミリリットルを加える。PBSを吸引し、0.05%トリプシンの3ミリリットルを追加します。トリプシン中の細胞を摂氏37度で8分間インキュベートする。ロックし、インキュベーションの途中で細胞をタップします。翌日、細胞が60〜80%の合流率に達した時、ポリエチレニミン、またはPEI、トランスフェクションを行う。次に、DNA、PEI、トランスフェクション媒体を15ミリリットル円錐形チューブにそっと混ぜます。室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を15センチメートルプレートに滴下して添加します。次いで、5%の二酸化炭素を用いて摂氏37度インキュベーターで16時間サンプルをインキュベートする。翌日、メディアを吸引し、15センチメートルのプレートに事前に温まった新鮮な293 HEKメディアにそっと交換します。培地交換後、5%の二酸化炭素を37°Cインキュベーターで48時間培養します。ヘモサイトメーターで細胞を数えます。パッセージは、以前にmESCを12ウェルプレートフォーマットに調製し、感染の前日に1日あたり100,000細胞を有する。10センチメートルの形式で成長した細胞の場合は、古い培地を吸引し、1つのX PBSを5ミリリットル加え、PBSを吸引し、0.25%トリプシンの1ミリリットルを加える。トリプシン中の細胞を摂氏37度で8分間インキュベートし、インキュベーションの途中で細胞をタップします。メディア交換の48時間後、293T HEK細胞の上清を50ミリリットル円錐形チューブに移します。遠心分離物は、細胞の破片をペレット化するために5分間Gの300倍の上清を。次に、上清を0.45ミクロンの膜を通して濾過する。SW32ローターで超遠心分離機を介してウイルスを濃縮し、摂氏4度で2時間半、72,000倍Gでサンプルを回転させます。ウイルスは超遠心分離の下で集中するが、ポリブレンのミリリットル当たり5マイクログラムを含む新鮮な胚性茎またはES培地で12ウェルプレートのCIA mESCを治療する。ウイルス濃度が終了したら、上清を慎重に吸引し、過剰な気泡を避けるために100マイクロリットルの100マイクロリットルでウイルスペレットを慎重に懸濁させる。ウイルスと1つのX PBSを1.5ミリリットルマイクロフュージチューブに加えます。ウイルスを完全に中断するために最も低い設定でチューブを渦。気泡を取り除くために5〜10秒間ミニ卓上遠心分離機でチューブを回転させます。12ウェルプレートの各ウェルにウイルスの30マイクロリットルを追加します。プレートを旋回し、サンプルをGの1000倍に20分間遠心します。12ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩戻します。翌朝、新鮮なESメディアとメディアを交換し、感染を48時間行います。48時間の感染後、適切な抗生物質を添加してウイルスプラスミドを統合した細胞を選択する。メディアを毎日変更します。選択培地を細胞上に72〜96時間保持し、摂氏37度のインキュベーターで5%の二酸化炭素を使用します。化学エピジェネティック修飾剤、またはCEM、粉末CEMおよびジメチルスルホキシド、またはDMSOを1ミリモルのストック濃度および100マイクロモルの作業濃度に懸濁させて治療を継続する。セルが72〜96時間選択された後、mESCを12ウェル形式に分割し、ウェルあたり100,000個のセルを使用します。24時間5%の二酸化炭素を用いて37°Cインキュベーターで細胞をインキュベートする。インキュベーション後、ES培地で100ナノモルCEMの培地溶液を調製する。メディアを使用して、CIA mESCに1ミリリットルの井戸を供給します。コントロールとして機能する CEM を追加せずにセルのウェルを維持します。.次に、古いメディアを吸引し、実験期間中24時間ごとに、調製した新しいCEMまたはCEMフリーES培地を1回1ミリリットルずつ添加してメディアを交換する。48時間のCEM処理後、蛍光顕微鏡を用いて100ナノモルCEMで処理した細胞内でCEM処理を行わずに細胞を画像化します。位相または明視野を使用して代表的な画像を撮り、10〜40倍の倍率でmESC形態を記録します。細胞は、いくつかの分化された細胞を持つコロニーの周りに形成されているはずです。FITC蛍光チャネルの下で、両方の細胞状態を画像化する。次に、培地を吸引し、1つのX PBSで細胞を洗浄し、PBSを1ミリリットルで洗浄し、0.25ミリリットルの0.25%トリプシンをEDTAで8〜10分間添加することによって、フローサイトメトリー用のコントロールおよびCEM処理細胞を分離する。20倍の倍率を使用して顕微鏡を通して細胞が大きな塊に束ねられなくなったことを確認します。細胞が単一の細胞懸濁液にないように見える場合は、P1000ピペットで上下にピペットを軽くピペットし、細胞を完全にトリプシン化します。新鮮な培地の1ミリリットルでトリプシンをクエンチし、細胞が単一の細胞懸濁液になるまで血清学的ピペットで高速で細胞を再懸濁する。その後、室温で5分間Gの300倍の細胞を回転させます。上清を吸引し、1つのXPBSで細胞を洗浄し、細胞を遠心分離する。PBS上清を吸引し、FACSバッファーの200マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。約50,000個以上の細胞に対して浮遊細胞量計を行い、毎秒約5,000細胞のシース速度でサンプルを実行します。最後に、データをエクスポートしてさらに分析します。10月4日の遺伝子座およびCIA mESCのCEMシステムの位相画像は、CEM23の100ナノモルまたは未治療細胞で48時間の治療後に画像化され、特定のGFP抑制を示す。蛍光画像は、コントロール細胞における明るいGFP発現と、CEM23で処理されたmESCでのGFP発現の低下を示す。フローサイトメトリーは、一貫して48時間のCEM23の100ナノモルで処理されたCIA mESCのGFP発現の30%以上の減少を明らかにした。クロマチン免疫沈降、またはCHIPは、CEM23の100ナノモルでの治療の48時間が対照細胞と比較して標的座でH3K27acのレベルを減少させたことを明らかにした。この手順を試みる間、マウス胚性幹細胞に注意することが重要です。プロトコル中に区別する場合、結果は無効になります。その開発後、この技術は、合成生物学の分野の研究者が哺乳類ゲノムの生体内メカニズムを探求する道を開いた。

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Transcription: DNA to RNA

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

光熱角度光散乱ラピッド・化学・フリーヘモグロビンアッセイ

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...