Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Hathaway og Jin laboratoriene for diskusjonene nyttig. Forfatterne takker også Dan Crona og Ian MacDonald for deres kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet var støttes delvis av Grant R01GM118653 fra det amerikanske National Institutes of Health (til N.A.H.); og av tilskudd R01GM122749, R01CA218600 og R01HD088626 fra det amerikanske nasjonalt institutter for helse (til JJ). Dette arbeidet ble også støttet av et nivå 3 og student grant fra UNC Eshelman Institutt for innovasjon (N.A.H og A.M.C, henholdsvis). Ytterligere midler fra en T-32 GM007092 (til A.M.C) støttet dette arbeidet. Flow cytometri data ble oppnådd ved UNC Flow cytometri Core anlegget finansiert av en P30 CA016086 Cancer Center Core støtte stipend for UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) cellen linje kultur for å produsere Lentivirus
<ol><li>Vokse friske, lav-passasjen (mindre enn passering 30) 293T menneskelige embryonale nyre (HEK) celler i høy-glukose Dulbecco modifiserte Eagle er middels (DMEM) base media supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), penn / Streptokokk, 2-mercaptoenthanol i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Dele cellene hver 3-5 d, og før de blir > 95% confluent.</li>
	<li>Passasjen 293T HEK celler med 18 x 10<sup...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Her beskrev vi nylig utviklet CEM systemet brukes for å regulere genuttrykk og chromatin miljø på et bestemt gen i en doseavhengig måte. Vi gir en nøyaktig metode for å studere dynamikken involvert i å regulere genuttrykk gjennom selektive rekrutteringen av bestemte endogene chromatin regulatoriske proteiner. Dette er en svært modulær teknologi som kan brukes til å undersøke hvordan forskjellige protein - og chromatin-modifisere komplekser jobber sammen å riktig regulere chromatin miljøet, samt for å studer...

Chromatin består av DNA pakket rundt histone octamer proteiner som danner kjernen nucleosome partikkel. Regulering av chromatin komprimering er en viktig mekanisme for riktig DNA reparasjon, replikering og uttrykk1,2,3. En måte som cellene kontrollere nivået av komprimering er gjennom tillegging eller fjerning av ulike post-translasjonell histone hale modifikasjoner. To slike endringer inkluderer (1) lysin acetylation, som er oftest assosiert med gene aktivisering, og (2) lysin metylering, som kan være assosiert med gene aktivisering eller undertrykkelse, avhengig av aminosyre konteksten. Tillegg av acetylation og metylering merkene er katalysert av histone acetyltransferases (luer) og histone methyltransferases (HMTs), henholdsvis, mens fjerning av merket gjøres ved histone deacetylases (HDACs) og histone demethylases (HDMs ), henholdsvis4,5. Selv om eksistensen av disse proteinene har vært kjent i flere tiår, mange mekanismer av hvordan chromatin-modifisere maskiner fungerer å riktig regulere genuttrykk gjenstår for å defineres. Siden chromatin lovgivende prosesser er dysregulated i mange menneskelige sykdommer, kan ny mekanistisk innsikt føre til fremtidige terapeutiske programmer.
Chromatin i vivo analysen (CiA) er en nylig beskrevet teknikk som bruker en kjemisk induser av nærhet (CIP) til å kontrollere chromatin-modifisere maskiner rekruttering til en bestemte locus6. Denne teknologien har blitt brukt til å studere et voksende liste av chromatin dynamikk, inkludert endring av histone proteiner, chromatin remodelers og transkripsjon faktorer6,7,8,9. CIP-baserte chromatin tethering exogenously uttrykt proteiner har også blitt utvidet tidligere CiA å modulere ingen-modifisert genetisk loci ved bruk med en deaktivert gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar CRISPR-assosiert protein (dCas9) 10 , 11. i CiA systemet, mESCs er endret for å uttrykke en GFP reporter genet på Oct4 locus, et svært uttrykt og strengt regulert område av mESC genomet. Tidligere dette systemet brukes for å beskrive doseavhengig og reversibel rekruttering exogenously uttrykt heterochromatin protein 1 (HP1), et enzym som binder H3K9me3 og overfører undertrykkende merker (f.eksH3K9me3) og DNA metylering6. For å oppnå denne typen rekrutteringsstrategi, er mESCs infisert med en plasmider som uttrykker en FK506-binding protein (FKBP) koblet til en Gal4, som er en DNA-protein som binder en Gal4-binding rekke oppstrøms GFP reporter. Cellene er likeledes infisert med et FKBP-rapamycin-bindende domene (FRB) koblet til HP1. Når mESCs er utsatt for lav nanomolar konsentrasjoner av CIP, samles rapamycin, både FRB og FKBP, på målet locus. Uttrykk for målet genet er undertrykt, som dokumentert av fluorescens mikroskopi og flyt cytometri dagers rapamycin behandling, og histone acetylation er redusert, vist av ChIP og bisulfite sekvensering. Mens utvikling og validering av denne tilnærmingen har vært betydelige fremskritt innen chromatin forskning og regulering, ettall ulempen er nødvendig ytre uttrykk for chromatin-modifisere maskiner.
Å få basert på rekruttering av bare endogene fysiologisk relevante enzymer og lage et mer modulsystem, vi designet og preget romanen bifunctional molekyler, kalt CEMs (figur 1)12. En del av CEMs inkluderer FK506 som ligner på rapamycin, binder tett og spesielt til FKBP. Dermed vil i CEMs fortsatt bli rekruttert til Oct4 locus i CiA mESCs. Den andre komponenten av CEMs er en moiety som binder endogene chromatin-modifisere maskiner. I en pilotstudie testet vi CEMs som inneholder HDAC hemmere. Selv om konseptet med å bruke en inhibitor for å rekruttere HDACs synes counter-intuitive, er inhibitor likevel kunne rekruttere HDAC aktiviteten til genet av interesse. Dette oppnås ved å (1) omdirigere HDAC til locus, slippe enzymet, og øker tettheten av un hemmet HDACs i området og (2) opprettholde HDAC hemming på locus, men rekruttere undertrykkende komplekser som binder seg til de hemmet HDACs, eller (3) en kombinasjon av begge. I en tidligere studie, vi viste at CEMs kunne med hell undertrykke GFP reporteren i en dose - og tidsavhengige måte og på en måte som var raskt reversibel (dvs., innen 24 timer)12. Vi preget evne til CEM teknologien presentert her for kontroll genuttrykk bruker fluorescens mikroskopi, flowcytometri og muligheten til å kontrollere chromatin miljøet bruker ChIP-qPCR6. Her beskriver vi en metode for å bruke og karakteriserer CEMs, som vil lette tilpasning av dette systemet for å svare på flere spørsmål knyttet til chromatin biologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Regulering av chromatin komprimering er en viktig prosess som styrer genuttrykk i høyere eukaryoter. Selv om chromatin komprimering og gene expression regulering er ofte forstyrret i mange sykdommer, har locus-spesifikke endogene og reversibel metode å studere og kontrollere disse virkningsmekanismer manglet. For å løse dette problemet, har vi utviklet og preget romanen gen-regulere bifunctional molekyler. Én komponent av bifunctional molekyl bindes til en DNA-protein anker slik at det vil bli rekruttert til en allel-bestemte locus. Den andre komponenten engasjerer endogene mobilnettet chromatin-modifisere maskiner, rekruttere disse proteinene til en genet av interesse. Disse små molekyler, som kalles kjemiske epigenetic modifikatorer (CEMs), er i stand til å kontrollere genuttrykk og chromatin miljø i en doseavhengig og reversibel måte. Her, detalj vi en CEM tilnærming og dens anvendelse å redusere genuttrykk og histone hale acetylation på grønn fluorescerende Protein (GFP) reporter på Oct4 locus i mus embryonale stamceller (mESCs). Vi karakteriserer ledelsen CEM (CEM23) med fluorescerende mikroskopi, flowcytometri og chromatin immunoprecipitation (ChIP), etterfulgt av en kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR). Mens kraften i dette systemet er demonstrert på Oct4 locus, konseptuelt, CEM teknologien er modulære og kan brukes i andre celletyper og andre genomisk loci.

Vi har nylig utviklet CEMs og viste at denne teknologien kan brukes for å regulere genuttrykk og chromatin miljø på en reporter locus i en doseavhengig og reversibel måte. CEM, CEM23, vises en modell av ledelsen i figur 1. HDAC maskiner er rekruttert til reporter locus av den HDAC inhibitor som i dette tilfellet er GFP reporteren inn ved Oct4 locus.
Vi søkte å karakterisere CEM system...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Regulering av chromatin miljøet er en viktig prosess kreves for riktig genuttrykk. Her vi beskriver en metode for å kontrollere genuttrykk gjennom rekrutteringen av chromatin-modifisere maskiner i en gen-spesifikke og reversibel måte.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i epigenetikkfeltet som mekanismene for genregulering og årsaks- og effektrelasjoner mellom ulike kromatinregulatoriske elementer. Den største fordelen med denne teknikken er at det for første gang er mulig å modulere en kromatinloci med fysiologisk relevante endogene enzymer. Generelt enkeltpersoner nye til denne metoden vil slite fordi musen ESL kultur er iboende vanskelig for de som ikke har blitt trent i teknikken.Videre demonstrasjon av denne metoden er kritisk som celle virusinfeksjon trinn er vanskelig å lære. Forskeren må tid to separate linjer med cellekultur, og det er nødvendig å årvåkent overvåke sikkerheten under disse trinnene. For å starte protokollen, passasje 18 millioner av 293T HEK celler per 50 centimeter plate.Aspirer det gamle mediet og tilsett 10 milliliter av en X fosfat bufret saltvann, eller PBS. Aspirer PBS og legg til tre milliliter på 0,05% trypsin. Inkuber cellene i trypsin i åtte minutter ved 37 grader Celsius.Rock og trykk cellene halvveis gjennom inkubasjonen. Neste dag, når cellene har nådd 60 til 80% samløpet, utføre en polyetylenimin, eller PEI, transfection. Bland deretter forsiktig DNA-, PEI- og transfection-mediet i et konisk rør på 15 milliliter.Inkuber prøven ved romtemperatur i 15 minutter. Etter inkubasjon, legg til løsningen dropwise til 15 centimeter plate. Deretter inkuber prøven i 16 timer i en 37 grader Celsius inkubator med 5% karbondioksid.Neste dag aspirerer du mediene og erstatter det forsiktig med forvarmede, friske 293 HEK-medier til de 15 centimeter lange platene. Etter medieutvekslingen inkuberer cellene i en 37 graders Celsius inkubator med 5% karbondioksid i 48 timer. Tell cellene med et hemocytometer.Passasje tidligere forberedt mESC i en 12 brønnplate format med 100,000 celler per brønn en dag før infeksjon. For celler dyrket i et 10 centimeter format, aspirer det gamle mediet, legg til fem milliliter av en X PBS, aspirer PBS, og legg til en milliliter 0,25% trypsin. Inkuber cellene i trypsin i åtte minutter ved 37 grader Celsius og stein og trykk cellene halvveis gjennom inkubasjonen.48 timer etter medieutvekslingen, fjern og overfør overnatanten til 293T HEK-cellene til et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuger supernatanten ved 300 ganger G i fem minutter for å pellet cellerester. Deretter filtrerer du supernatanten gjennom en 0,45 mikron membran.Konsentrer viruset via ultracentrifuge med en SW32 rotor og spinn prøven på 72 000 ganger G i to og en halv time ved fire grader Celsius. Mens viruset konsentrerer seg under ultracentrifugation, behandle CIA mESC er i 12 brønnplate med frisk embryonisk stamme eller ES media som inneholder fem mikrogram per milliliter polybryne. Når viruskonsentrasjonen er ferdig, aspirerer du forsiktig det overnaturante og forsiktig suspenderer viruspelleten i 100 mikroliter av en X PBS for å unngå overflødige bobler.Tilsett viruset og en X PBS til en 1,5 milliliter Microfuge tube. Vortex røret på den laveste innstillingen for å fullstendig suspendere viruset. Spinn ned røret i en mini bordplate sentrifuge i fem til 10 sekunder for å fjerne bobler.Tilsett 30 mikroliter av viruset til hver brønn av en 12 brønnplate. Virvle platen og sentrifuger prøvene ved 1000 ganger G i 20 minutter. Plasser 12 brønnplaten tilbake i 37 grader Celsius inkubator over natten.Neste morgen, utveksle media med friske ES media og tillate infeksjon å finne sted i 48 timer. Etter 48 timers infeksjon, velg for celler som integrert viral plasmid ved å legge til riktig antibiotika. Endre mediene daglig.Hold utvalgsmediet på cellene i 72 til 96 timer i en 37 graders Celsius inkubator med 5% karbondioksid. Fortsett med kjemisk epigenetisk modifikator, eller CEM, forberedelse og behandling ved å suspendere pulverisert CEM og dimetylsulfoksid, eller DMSO, til en lagerkonsentrasjon på en millimolar og en arbeidskonsentrasjon på 100 mikromos. Etter at cellene har gjennomgått valg i 72 til 96 timer, del mESC i et 12-brønnformat med 100 000 celler per brønn.Inkuber cellene i en 37 graders Celsius inkubator med 5% karbondioksid i 24 timer. Etter inkubasjon, lag en medieløsning på 100 nanomolar CEM med ES-medier. Bruk media til å mate CIA mESC med en milliliter godt.Hold en brønn av celler uten noen ekstra CEM er å tjene som en kontroll. Deretter endrer du media ved å aspirere de gamle mediene og legge til en milliliter per godt av nylaget CEM som inneholder eller CEM gratis ES-medier hver 24. Etter 48 timers CEM-behandling kan cellene uten CEM-behandling i cellene som behandles med 100 nanomolar CEM ved hjelp av et fluorescensmikroskop.Ta representative bilder ved hjelp av fase eller lyst felt for å registrere mESC morfologi på 10 til 40 ganger forstørrelse. Cellene skal ha dannet seg rundt kolonier med noen få differensierte celler. Under FITC fluorescenskanal, bilde begge celleforholdene.Deretter isolerer du kontroll- og CEM-behandlede celler for strømningscytometri ved å aspirere mediet, vaske cellene med en milliliter av en X PBS, aspirere PBS og legge til 0,25 milliliter på 0,25% trypsin med EDTA i åtte til 10 minutter. Bekreft at cellene ikke lenger er buntet i store klumper gjennom mikroskopet ved hjelp av 20 ganger forstørrelse. Hvis cellene ikke ser ut til å være i en enkelt celle suspensjon, forsiktig pipette dem opp og ned med en P1000 pipette å fullt trypsinize cellene.Slukke trypsin med en milliliter friske medier og resuspend cellene i høy hastighet med en serologisk pipette til cellene er i en enkelt celle suspensjon. Deretter spinner du ned cellene ved 300 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Aspirer overnatanten, vask cellene med en X PBS, og sentrifuger cellene.Aspirer PBS-supernatanten og gjenoppusst cellepelleten i 200 mikroliter FACS-buffer. Utfør strømningscytometri på ca. 50 000 celler med de suspenderte cellene og kjør prøvene med en skjedehastighet på rundt 5000 celler per sekund. Til slutt eksporterer du dataene for videre analyse.Fasebilder av CEM-systemet ved Oct4-locus og CIA mESCs er avbildet etter 48 timers behandling med 100 nanomolar CEM23 eller med ubehandlede celler indikerer spesifikk GFP-undertrykkelse. Fluorescerende bilder viser et lyst GFP-uttrykk i kontrollcellene og et redusert GFP-uttrykk i mESCs behandlet med CEM23. Flow cytometri konsekvent viste en større enn 30% reduksjon i GFP uttrykk i CIA mESC er behandlet med 100 nanomolar av CEM23 i 48 timer.Kromatinimmunoprecipitation, eller CHIP, fråtset at 48 timers behandling med 100 nanomær CEM23 reduserte nivået av H3K27ac ved mållocus sammenlignet med kontrollceller. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å være forsiktig med musen embryonale stamceller. Hvis de differensierer under protokollen, vil resultatene bli opphevet.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen syntetisk biologi for å utforske in vivo-mekanismene i pattedyrgenomet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Høsting murint alveolære makrofager og evaluere Cellular Aktivering indusert av Polyanhydride Nanopartikler

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolering av Cellular lipid dråper: To rensing teknikker Starter fra gjærceller og menneske Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk Assay å måle transkripsjon Hemming av Gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Designing mikrofluid Enheter for å studere cellulære responser Under Singel eller andre sykdoms Kjemisk / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

En rask og kjemisk fri Hemoglobin analysen med Photothermal Vinkel lysspredning

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Overflate Functionalization av hepatitt E Virus nanopartikler bruke kjemiske Bøyning

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabrikasjon av en multiplex kunstig mobilnettet MicroEnvironment matrise

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...