Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer aos membros dos laboratórios Hathaway e Jin para suas discussões úteis. Os autores também agradecer Dan Crona e Ian MacDonald por sua leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por Grant R01GM118653 de os E.U. National Institutes of Health (para N.A.H.); e por subsídios R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 de o E.U. National institutos de saúde (JJ). Este trabalho também foi apoiado por um nível 3 e um estudante concedem da UNC Eshelman Instituto de inovação (N.A.H e A.M.C, respectivamente). Financiamento adicional de um GM007092 de T-32 (a A.M.C) com suporte a este trabalho. Obteve-se dados de citometria de fluxo na UNC Flow Cytometry Core instalação financiado por um P30 CA016086 Cancer Center núcleo apoio Grant para o UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

1) cultura de linha celular para a produção de Lentivirus
<ol><li>Crescer fresco, passagem baixa (inferior a passagem 30) células de rim humano embrionário (HEK) 293T em alta-glicose Dulbecco modificada do águia é a mídia de base médio (DMEM) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 10 mM HEPES, 1 x não aminoácidos essenciais (timina), caneta / Estreptococo, 2-mercaptoenthanol em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2. Dividir as células a cada 3-5 d... e antes que se tornem > 95% de Conflue...

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	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Aqui, descrevemos o recentemente desenvolvido sistema CEM sendo aplicado para regular a expressão de gene e ambiente de cromatina em um gene específico de forma dose-dependente. Nós fornecemos um método preciso para estudar a dinâmica envolvida na regulação da expressão gênica através do recrutamento seletivo das proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta é uma tecnologia altamente modular que pode ser aplicada para investigar como diferente proteínas e cromatina-modificação de complexos ...

Cromatina consiste de DNA enrolado ao redor de proteínas octamer de histona que formam a partícula nucleosome do núcleo. Regulamento de compactação da cromatina é um mecanismo essencial para a adequada DNA expressão, replicação e reparo1,2,3. Uma maneira em que as células controlam o nível de compactação é através da adição ou remoção de várias modificações de cauda de histona borne-translational. Dois tais modificações incluem acetilação de lisina (1), que é mais comumente associada com a ativação do gene, e metilação de lisina (2), que pode ser associada com ativação do gene ou repressão, dependendo do contexto de aminoácido. A adição das marcas de acetilação e metilação é catalisada por histona acetiltransferases (chapéus) e histona metiltransferases (HMTs), respectivamente, Considerando que a remoção da marca é feita por histona deacetilases (HDACs) e demethylases de histona (HDMs ), respectivamente,4,5. Embora a existência destas proteínas tem sido conhecida há décadas, muitos mecanismos de máquinas como cromatina-modificando obras devidamente regular expressão do gene continuam a ser definido. Uma vez que processos regulatórios de cromatina são prejudicado em muitas doenças humanas, novos insights mecanicistas podem levar a futuras aplicações terapêuticas.
O cromatina na vivo ensaio (CiA) é uma técnica recentemente descrita que usa um indutor químico de proximidade (CIP) para controlar a cromatina-modificando o recrutamento de maquinaria para um locus específico6. Esta tecnologia tem sido costumava estudar uma lista em expansão da dinâmica de cromatina, incluindo proteínas histonas-modificando, empresas de reestruturação da cromatina e transcrição fatores6,7,8,9. CIP-baseado da cromatina tethering de proteínas expressas exogenamente também foi estendido passado CiA para modular loci genéticos não modificado pela utilização com uma proteína associada agrupados regularmente intercaladas curta palíndromo repete CRISPR desativada (dCas9) 10 , 11. no sistema da CiA, mESCs foram modificados para expressar um gene repórter GFP no locus de Oct4 , uma área estritamente regulamentado e altamente expressa do genoma mESC. Anteriormente, este sistema tem sido aplicado para descrever o recrutamento dose-dependente e reversível da proteína de heterocromatina exogenamente expressa 1 (HP1), uma enzima que vincula o H3K9me3 e propaga marcas repressivas (por exemplo, H3K9me3) e DNA metilação de6. Para realizar este tipo de estratégia de recrutamento, os mESCs estão infectados com um plasmídeo que expressa uma proteína de ligação FK506 (FKBP) ligada a um Gal4, que é uma âncora de ADN-proteína que se liga a uma matriz de ligação Gal4 montante do repórter GFP. As células são infectadas também com um domínio de ligação-FKBP-rapamicina (FRB) conectado ao HP1. Quando os mESCs são expostos a concentrações baixas nanomolar do PIC, rapamicina, ambos FRB e FKBP, estão reunidos no locus de alvo. Dentro de dias de tratamento de rapamicina, expressão do gene do alvo é reprimido, como evidenciado por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência e acetilação da histona é diminuída, mostrado pelo ChIP e sequenciamento de bissulfito. Enquanto o desenvolvimento e a validação desta abordagem foram significativos avanços no campo da pesquisa de cromatina e regulação, uma desvantagem é a necessária expressão exógena de cromatina-modificando máquinas.
Para tornar a tecnologia baseada no recrutamento de enzimas fisiologicamente relevantes apenas endógenas e fazer um sistema mais modular, projetamos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais, denominadas CEMs (Figura 1)12. Um componente das CEMs inclui FK506 que, semelhante a rapamicina, liga-se firmemente e especificamente para FKBP. Assim, os CEMs ainda serão recrutados para o locus de Oct4 em mESCs da CiA. O outro componente das CEMs é um agrupamento que vincula a maquinaria de cromatina-modificando endógena. Em um estudo piloto, testamos CEMs que contêm inibidores HDAC. Enquanto o conceito de usando um inibidor para recrutar HDACs parece contra-intuitivo, o inibidor, no entanto, é capaz de recrutar atividade HDAC para o gene de interesse. Isso é realizado por (1) redirecionando o HDAC para o locus, liberando a enzima e aumento da densidade das HDACs un-inibidas na área e inibição de HDAC (2) manutenção no locus, mas recrutar complexos repressivos que ligam para as HDACs inibidas, ou (3) uma combinação de ambos. No estudo anterior, mostramos que o CEMs foram capazes de reprimir com sucesso a repórter GFP de forma dose - e tempo-dependente, bem como de uma maneira que era rapidamente reversível (ou seja, dentro de 24 horas)12. Nós caracteriza a capacidade da tecnologia CEM apresentada aqui a expressão de gene de controle usando microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e a capacidade para controlar o ambiente de cromatina usando ChIP-qPCR6. Aqui, descrevemos um método para usar e caracterizando os CEMs, que facilitarão a adaptação deste sistema para responder perguntas adicionais relacionadas à biologia da cromatina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Regulamento de compactação da cromatina é um processo importante que regula a expressão gênica em eucariontes superiores. Embora a compactação da cromatina e regulação da expressão gênica são comumente interrompidos em muitas doenças, tem faltado um locus específico, endógeno e reversível método para estudar e controlar esses mecanismos de ação. Para resolver este problema, desenvolvemos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais gene-regulação. Um componente da molécula bifuncional vincula uma âncora de ADN-proteína assim será recrutado para um locus alelo-específico. O outro componente envolve endógena cromatina-modificando maquinaria celular, recrutamento destas proteínas para um gene de interesse. Estas pequenas moléculas, chamadas químicas epigenéticas modificadores (CEMs), são capazes de controlar a expressão do gene e o ambiente de cromatina de forma dose-dependente e reversível. Aqui, detalhamos uma abordagem CEM e sua aplicação para diminuir a expressão dos genes e acetilação de cauda em um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) localizado no locus de Oct4 em células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Podemos caracterizar o chumbo CEM (CEM23) usando microscopia fluorescente, citometria de fluxo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP), seguido de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Enquanto o poder deste sistema é demonstrado no locus a Oct4 , conceitualmente, a tecnologia CEM é modular e pode ser aplicada em outros tipos de células e em outros loci genômicos.

Recentemente desenvolvemos CEMs e demonstrou que esta tecnologia pode ser aplicada para regular a expressão dos genes e o ambiente de cromatina em um locus de repórter de forma dose-dependente e reversível. Na Figura 1, é mostrado um modelo de liderança, CEM, CEM23. Máquinas HDAC é recrutada para o locus de repórter por que, neste caso, é o repórter GFP inserido no locus de Oct4 inibidor HDAC.
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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da epigenética, como os mecanismos de regulação genética e relações de causa e efeito entre diferentes elementos regulatórios da cromatina. A principal vantagem dessa técnica é que pela primeira vez é possível módulo de um loci de cromatina com enzimas endógenas fisiologicamente relevantes. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque a cultura de ESL do rato é inerentemente difícil para aqueles que não foram treinados na técnica.Uma demonstração adicional desse método é fundamental, pois as etapas de infecção viral celular são difíceis de aprender. O pesquisador deve cronometrar duas linhas separadas da cultura celular e é necessário monitorar vigilantemente a segurança durante essas etapas. Para iniciar o protocolo, a passagem de 18 milhões de células HEK 293T por placa de 50 centímetros.Aspire a mídia antiga e adicione 10 mililitros de um soro fisiológico tamponado x, ou PBS. Aspire o PBS e adicione três mililitros de 0,05% de trippsina. Incubar as células em trippsina por oito minutos a 37 graus Celsius.Balance e toque nas células no meio da incubação. No dia seguinte, quando as células atingiram 60 a 80% de confluência, realizam uma polietilenimina, ou PEI, transfecção. Em seguida, misture suavemente o DNA, PEI e a mídia de transfecção em um tubo cônico de 15 mililitros.Incubar a amostra em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, adicione a solução dropwise à placa de 15 centímetros. Em seguida, incubar a amostra por 16 horas em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, aspire a mídia e substitua-a suavemente por mídia HEK pré-armada e fresca de 293 para as placas de 15 centímetros. Após a troca de mídia, incubar as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Conte as células com um hemócito.Passagem previamente preparado mESC em um formato de placa de 12 poços com 100.000 células por poço um dia antes da infecção. Para células cultivadas em formato de 10 centímetros, aspire a mídia antiga, adicione cinco mililitros de um X PBS, aspire o PBS e adicione um mililitro de 0,25% de trippsina. Incubar as células em trippsina por oito minutos a 37 graus Celsius e balançar e tocar as células no meio da incubação.48 horas após a troca de mídia, remova e transfira o supernatante das células HEK 293T para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o supernante a 300 vezes G por cinco minutos para pelotar os detritos celulares. Em seguida, filtrar o supernascer através de uma membrana de 0,45 míces.Concentre o vírus através de ultracentrifuge com um rotor SW32 e gire a amostra a 72.000 vezes G por duas horas e meia a quatro graus Celsius. Enquanto o vírus se concentra sob ultracentrifugação, trate os mESC's da CIA na placa de 12 poços com haste embrionária fresca ou mídia ES contendo cinco microgramas por mililitro de Polibrene. Quando a concentração do vírus terminar, aspire cuidadosamente o supernascer e suspenda cuidadosamente a pelota do vírus em 100 microliters de um X PBS para evitar bolhas em excesso.Adicione o vírus e um X PBS a um tubo microfuçado de 1,5 mililitro. Vórtice o tubo na configuração mais baixa para suspender totalmente o vírus. Gire o tubo em uma mini centrífuga de mesa por cinco a 10 segundos para remover bolhas.Adicione 30 microliters do vírus a cada poço de uma placa de 12 poços. Gire a placa e, em seguida, centrifugar as amostras a 1000 vezes G por 20 minutos. Coloque a placa de 12 poços de volta na incubadora Celsius de 37 graus durante a noite.Na manhã seguinte, troque a mídia com a mídia ES fresca e permita que a infecção ocorra por 48 horas. Após 48 horas de infecção, selecione para células que integraram o plasmídeo viral adicionando o antibiótico apropriado. Mude a mídia diariamente.Mantenha a mídia de seleção nas células por 72 a 96 horas em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono. Continue com modificador epigenético químico, ou CEM, preparação e tratamento suspendendo o CEM em pó e o sulfoxida de dimetila, ou DMSO, a uma concentração de estoque de um mililitro e uma concentração de trabalho de 100 micromolar. Após as células terem sido seleção por 72 a 96 horas, divida os mESC's em um formato de 12 bem com 100.000 células por poço.Incubar as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, prepare uma solução de mídia de 100 nanomolar CEM com mídia ES. Use a mídia para alimentar o mESC da CIA com um mililitro bem.Mantenha um poço de células sem nenhum CEM adicionado para servir como controle. Em seguida, mude a mídia aspirando a mídia antiga e adicionando um mililitro por poço fora cem recém-preparado contendo ou cem mídia ES livre a cada 24 horas durante a duração do experimento. Após 48 horas de tratamento cem, imagem as células sem tratamento CEM nas células tratadas com 100 cem nanomolar usando um microscópio de fluorescência.Faça imagens representativas usando fase ou campo brilhante para registrar a morfologia mESC em 10 a 40 vezes a ampliação. As células deveriam ter se formado ao redor de colônias com algumas células diferenciadas. Sob o canal de fluorescência FITC, imagem ambas as condições celulares.Em seguida, isole o controle e as células tratadas cem para citometria de fluxo aspirando a mídia, lavando as células com um mililitro de um X PBS, aspirando o PBS e adicionando 0,25 mililitros de 0,25% trypsin com EDTA por oito a 10 minutos. Confirme que as células não estão mais agrupadas em grandes aglomerados através do microscópio usando 20 vezes a ampliação. Se as células não parecem estar em uma única suspensão celular, pipeta-as suavemente para cima e para baixo com uma pipeta P1000 para tentar totalmente as células.Sacie a trippsina com um mililitro de mídia fresca e resuspense as células em alta velocidade com uma pipeta sorológica até que as células estejam em uma única suspensão celular. Em seguida, gire as células a 300 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o supernasce, lave as células com um X PBS, e centrifugar as células.Aspire o supernatante PBS e resuspenja a pelota celular em 200 microliters de tampão FACS. Realize a citometria de fluxo em aproximadamente 50.000 células com as células suspensas e execute as amostras a uma velocidade de baia de cerca de 5.000 células por segundo. Por fim, exporte os dados para análise suplementar.As imagens de fase do sistema CEM no lócus oct4 e no CIA mESC são imagens após 48 horas de tratamento com 100 nanomolar de CEM23 ou com células não tratadas indicam repressão específica do GFP. Imagens fluorescentes mostram uma expressão GFP brilhante nas células de controle e uma expressão de GFP reduzida no mESC tratado com CEM23. A citometria de fluxo revelou consistentemente uma redução maior do que 30% na expressão de GFP no tratamento do CIA mESC com 100 nanomolar de CEM23 por 48 horas.A imunoprecipitação de cromatina, ou CHIP, revelou que 48 horas de tratamento com 100 nanomolar de CEM23 diminuíram o nível de H3K27ac no lócus alvo quando comparado com as células de controle. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado com as células-tronco embrionárias do rato. Se eles se diferenciarem durante o protocolo, os resultados serão anulados.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia sintética explorarem os mecanismos in vivo no genoma dos mamíferos.

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Bioengenharia

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