Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить членов Hathaway и Цзинь лабораторий за их полезные дискуссии. Авторы также поблагодарить Dan Crona и Иэн Макдональд за их критического чтения рукописи. Эта работа частично поддержали R01GM118653 грант от национальных институтов здравоохранения США (до N.A.H.); и на гранты R01GM122749, R01CA218600 и R01HD088626 от США национального институтов здравоохранения (для J.J.). Эта работа была также поддержана уровня 3 и студент грант от КООН Эшелман Институт инноваций (N.A.H и Мехико, соответственно). Дополнительное финансирование из T-32 GM007092 (в Мехико) поддерживает эту работу. Проточная цитометрия, полученные данные на КООН потока цитометрии Core объекте финансируется P30 CA016086 рака центр основной поддержки Грант на КООН Lineberger всеобъемлющем онкологический центр.

1) клеточной культуры линия для производства Лентивирусы
<ol><li>Растут свежие, низкий проход (меньше, чем прохождение 30) 293T человеческих эмбриональных почек (ГЭС) клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная орел базы СМИ среднего (DMEM) дополнены с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), ...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Здесь мы описали недавно разработанная система CEM применяются для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в конкретных генов в зависимости от дозы. Мы предоставляем точный метод для изучения динамики участвует в регуляции экспрессии генов путем выборочного набор?...

Хроматин состоит из ДНК, обернутые вокруг гистона octamer белков, которые формируют ядро нуклеосома частиц. Регулирование хроматина уплотнения является важнейшим механизмом для надлежащего ДНК ремонт, репликации и выражение1,2,3. Один из способов, в котором клетки контролировать уровень уплотнения является добавление или удаление различных модификаций хвост столб-поступательные гистонов. Две такие изменения включают ацетилирования (1) Лизин, которая чаще всего ассоциируется с активацией генов, и (2) Лизин метилирования, который может быть связан с активации генов или репрессий, в зависимости от контекста аминокислоты. Добавление ацетилирования и метилирования марок катализировано гистона acetyltransferases (шляпы) и гистона methyltransferases (HMTs), соответственно, в то время как удаление знака осуществляется гистона комплексы (ГДА) и demethylases (HDMs гистона ), соответственно4,5. Хотя существование этих белков было известно на протяжении десятилетий, многие механизмы как chromatin изменения механизма работы должным образом регулировать экспрессию генов еще предстоит определить. С хроматином регуляторные процессы являются dysregulated в многих заболеваний человека, новые идеи механистического может привести к будущим терапевтического применения.
В естественных условиях chromatin assay (ЦРУ) является недавно описан метод, который использует химическое индуктором близости (CIP) для управления chromatin изменения механизма набора конкретных Локус6. Эта технология использовалась для изучения расширяющийся список динамики хроматина, включая изменения гистона белки, ремонтом хроматина и транскрипции факторов6,,78,9. На основе CIP хроматина привязывая экзогенно выраженной белков также продлевался мимо ЦРУ для модуляции немодифицированных генетических локусов использования с деактивированной кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет ТРИФОСФАТЫ связанные белком (dCas9) 10 , 11. в системе ЦРУ, были изменены mESCs выразить репортер гена GFP в Oct4 локусе, сильно выраженный и строго регламентируются области генома mESC. Ранее, эта система применялась для описания дозозависимый и обратимым вербовки экзогенно выраженной гетерохроматин протеин 1 (HP1), фермент, который связывает H3K9me3 и распространяет репрессивных знаки (например, H3K9me3) и ДНК Метилирование6. Чтобы выполнить этот тип стратегии набора персонала, mESCs заражены плазмида, выражающий FK506-связывающий белок (FKBP), связанные с Gal4, который является ДНК белковых привязку, которая связывает массив Gal4-привязки GFP репортер вверх по течению. Клетки также инфицированы FKBP-rapamycin связывающий домен (FRB), подключенных к HP1. Когда mESCs подвергаются воздействию низких наномолярных концентрациях CIP, rapamycin, FRB и FKBP, сводятся воедино в локусе целевого объекта. В течение дней rapamycin лечения экспрессия гена целевой подавляется, что подтверждается флуоресцентной микроскопии и потока цитометрии и ацетилирование гистона уменьшается, чип и бисульфит последовательности. Хотя разработка и проверка этого подхода были значительные успехи в области исследований хроматина и регулирования, один недостаток — необходимые экзогенных выражение chromatin изменения механизма.
Чтобы сделать технологии, основанные на наборе только эндогенных физиологически соответствующих ферментов и сделать более модульной системы, мы разработан и характеризуется Роман бифункциональных молекул, называемых CEMs (рис. 1)12. Одним из компонентов CEMs включает FK506, который похож на rapamycin, связывает плотно и специально для FKBP. Таким образом CEMs по-прежнему будут набраны к Oct4 локус в ЦРУ mESCs. Другой компонент ПОВ является остаток, который связывает эндогенного chromatin изменения механизма. В экспериментальном исследовании мы протестировали пов, содержащие ингибиторы ГДАЦ. Хотя концепция использования ингибитора набирать гда кажется нелогичным, ингибитор, тем не менее возможность набирать HDAC активность гена интереса. Это достигается путем (1) перенаправление HDAC в локусе, выпуская энзим и увеличение плотности ООН препятствует гда в этом районе и (2) поддержание HDAC ингибирование в локусе, но найма репрессивных комплексы, которые связывают к тормозится гда, (3) или комбинация обоих. В предыдущем исследовании, мы показали, что CEMs смогли успешно подавить GFP-репортер в зависимости от дозы и времени, а также в духе, который был быстро обратимых (т.е., в течение 24 часов)12. Мы были характерны способность CEM технологий, представленные здесь для контроля экспрессии генов с помощью микроскопии флуоресцирования, проточной цитометрии и способности для управления средой хроматина, используя чип ПЦР6. Здесь мы описываем метод для использования и характеризующие пов, которые будут способствовать адаптации этой системы для ответа на дополнительные вопросы, относящиеся к биологии хроматина.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Регулирование хроматина уплотнения является важным процессом, который регулирует экспрессию генов у высших эукариот. Хотя во многих заболеваний обычно разрушаются хроматина уплотнения и регулирование выражение гена, локус конкретных, эндогенного и реверсивные метод для изучения и контроля этих механизмов действий отсутствует. Для решения этой проблемы, мы разработали и характеризуется романа Джин регулируя бифункциональных молекул. Одним из компонентов бифункциональных молекулы связывается с ДНК белковых якорь так, что он будет набираться для Аллел Специфически Локус. Другой компонент занимается эндогенного chromatin изменения клеточными, рекрутинг эти белки для нокдауна определенного гена. Эти малые молекулы, называется химической эпигеномные модификаторы (CEMs), способны контролировать экспрессии генов и окружающей среды хроматина в зависимости от дозы и обратимым образом. Здесь мы подробно CEM подход и его применение к снижению экспрессии генов и ацетилирование гистона хвост на репортера Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП), расположенный в локусе Oct4 в мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). Мы характеризуют ведущим CEM (CEM23) с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммунопреципитации chromatin (обломока), а затем количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). В то время как мощности этой системы проявляется в локусе Oct4 , концептуально, CEM технологии является модульной и может быть применен в других типах клеток и в других геномной локусов.

Мы недавно разработали пов и продемонстрировал, что эта технология может применяться для регулирования экспрессии генов и окружающей среды хроматина в локусе репортер в зависимости от дозы и обратимым образом. На рисунке 1показана модель ведущего CEM, C...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Регулирование окружающей среды хроматина является важным процессом для надлежащего ген выражение. Здесь мы описываем метод для контроля экспрессии генов путем набора chromatin изменения механизма ген специфического и обратимым образом.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как механизмы регуляции генов и причины и следствия отношения между различными элементами регулирования хроматина. Основным преимуществом этой методики является то, что впервые можно модулить хроматиновые локусы с физиологически релевантными эндогенными ферментами. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что мышь ESL культуры по своей сути трудно для тех, кто не был обучен технике.Дальнейшая демонстрация этого метода имеет решающее значение, как клеточная вирусная инфекция шаги трудно узнать. Исследователь должен приутомить две отдельные линии клеточной культуры и необходимо внимательно следить за безопасностью во время этих шагов. Для начала протокола, прохождение 18 миллионов 293T HEK клеток на 50 сантиметров пластины.Аспирировать старые средства массовой информации и добавить 10 миллилитров одного X фосфат буфера солевого раствора, или PBS. Аспирировать PBS и добавить три миллилитров 0,05%трипсина. Инкубировать клетки в трипсине в течение восьми минут при 37 градусах по Цельсию.Рок и нажмите клетки на полпути через инкубацию. На следующий день, когда клетки достигли 60 до 80% слияния, выполнить полиэтиленимин, или PEI, трансфекции. Затем аккуратно смешайте ДНК, PEI и трансфекцию в 15 миллилитровой конической трубке.Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации добавьте раствор в 15-сантиметровую пластину. Затем инкубировать образец в течение 16 часов в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа.На следующий день, аспирировать средства массовой информации и аккуратно заменить его на довоенные, свежие 293 HEK средств массовой информации на 15 сантиметров пластин. После обмена средствами массовой информации, инкубировать клетки в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа в течение 48 часов. Подсчитайте клетки с гемоцитометром.Прохождение ранее подготовленных mESC в 12 хорошо пластины формата с 100000 клеток на колодец за день до заражения. Для клеток, выращенных в формате 10 сантиметров, аспирировать старые средства массовой информации, добавить пять миллилитров одного X PBS, аспирировать PBS, и добавить один миллилитр 0,25% трипсина. Инкубировать клетки в трипсине в течение восьми минут при 37 градусах по Цельсию и рок и нажмите клетки на полпути через инкубацию.Через 48 часов после обмена средствами массовой информации удалите и перенесите супернатант клеток 293T HEK в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга супернатант на 300 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать клеточный мусор. Затем фильтруй супернатант через мембрану 0,45 микрона.Сосредоточьте вирус с помощью ультрацентрифуга с ротором SW32 и вращай образец на 72 000 раз G в течение двух с половиной часов при четырех градусах Цельсия. В то время как вирус концентрируется под ультрацентрифугации, лечить ЦРУ mESC в 12 хорошо пластины со свежим эмбриональным стеблем или ES средств массовой информации, содержащие пять микрограммов на миллилитр полибрена. Когда концентрация вируса закончилась, тщательно аспирировать супернатант и тщательно приостановить вирус гранулы в 100 микролитров одного X PBS, чтобы избежать лишних пузырьков.Добавьте вирус и один X PBS в 1,5 миллилитровую трубку Microfuge. Vortex трубки в самой низкой настройке, чтобы полностью приостановить вирус. Спин вниз трубку в мини столешнице центрифуги в течение пяти до 10 секунд, чтобы удалить пузырьки.Добавьте 30 микролитров вируса к каждому колодец из 12 пластин хорошо. Закружить пластину, а затем центрифугу образцов на 1000 раз G в течение 20 минут. Поместите 12 хорошо пластины обратно в 37 градусов по Цельсию инкубатор на ночь.На следующее утро, обмен средствами массовой информации со свежими средствами массовой информации ES и позволяют инфекции иметь место в течение 48 часов. После 48 часов инфекции, выберите для клеток, которые интегрированы вирусной плазмиды, добавив соответствующий антибиотик. Изменение средств массовой информации ежедневно.Держите средства отбора на клетках в течение 72 до 96 часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5%углекислым газом. Продолжить с химическим эпигенетическим модификатором, или CEM, подготовка и лечение, приостановив порошкообразных CEM и диметил сульфоксид, или DMSO, до концентрации запасов одного миллимолара и рабочей концентрации 100 микромолей. После того, как клетки прошли отбор в течение 72 до 96 часов, разделить mESC в 12 хорошо формат с 100000 клеток на колодец.Инкубировать клетки в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%углекислого газа в течение 24 часов. После инкубации приготовьте медиа-решение из 100 наномолярных CEM с помощью ES-медиа. Используйте средства массовой информации, чтобы накормить ЦРУ mESC с одним миллилитров хорошо.Держите колодец клеток без каких-либо добавленных CEM, чтобы служить в качестве контроля. Затем измените средства массовой информации, аспирируя старые средства массовой информации и добавляя один миллилитр на хорошо подготовленный CEM, содержащий или CEM бесплатные средства массовой информации ES каждые 24 часа в течение всего эксперимента. После 48 часов лечения CEM, изображение клеток без лечения CEM в клетках, обработанных 100 наномолярных CEM с помощью флуоресцентного микроскопа.Возьмите репрезентативные изображения с помощью фазы или яркого поля для записи морфологии mESC при увеличении в 10-40 раз. Клетки должны были образоваться вокруг колоний с несколькими дифференцированными клетками. Под каналом fitC флуоресценции, изображение обеих условий клетки.Далее, изолировать контроль и CEM лечение клеток для цитометрии потока путем аспирации средств массовой информации, мыть клетки с одним миллилитром одного X PBS, аспирации PBS и добавить 0,25 миллилитров 0,25%трипсина с ЭДТА в течение восьми до 10 минут. Подтвердите, что клетки больше не сгруппированы в большие сгустки через микроскоп, используя 20 раз увеличение. Если клетки, как представляется, не в одной клеточной подвески, осторожно пипетки их вверх и вниз с P1000 пипетки полностью trypsinize клеток.Утолить трипсин с одним миллилитром свежих средств массовой информации и повторного перерасхода клеток на высокой скорости с серологической пипетки, пока клетки находятся в одной клеточной подвески. Затем, спина вниз клетки в 300 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант, мыть клетки с одним X PBS, и центрифуга клеток.Аспирировать супернатант PBS и повторно поместью клеточной гранулы в 200 микролитров буфера FACS. Выполняем цитометрию потока примерно на 50 000 клеток с подвешенными клетками и запускаем образцы со скоростью оболочки около 5000 клеток в секунду. Наконец, экспортировать данные для дальнейшего анализа.Фазовые изображения системы CEM в локусе Oct4 и mESC ЦРУ изображены после 48 часов лечения 100 наномолярами CEM23 или с необработанными клетками указывают на конкретные репрессии GFP. Флуоресцентные изображения показывают яркое выражение GFP в контрольных ячейках и уменьшенное выражение GFP в MESC, обработанном CEM23. Цитометрия потока постоянно выявила более чем 30%-ное снижение экспрессии GFP в MESC ЦРУ, обработанном 100 наномоляром CEM23 в течение 48 часов.Хроматин иммунопреципиентации, или CHIP, упивался, что 48 часов лечения с 100 наномоляр ceM23 снизил уровень H3K27ac на целевой локус по сравнению с контрольными клетками. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы быть осторожным с мышью эмбриональных стволовых клеток. Если они различаются во время протокола, результаты будут аннулированы.После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области синтетической биологии, чтобы исследовать механизмы in vivo в геноме млекопитающих.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Сбор мышей альвеолярных макрофагов и оценка активации клеток индуцированные Polyanhydride наночастиц

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Выделение сотовых липидные капли: Два Методы очистки Начиная с дрожжевых клеток и правам плаценты

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Инкапсуляция Бесклеточные транскрипции и трансляции в машинный Пузырьки, для построения клеточных Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

<em&gt; In Vitro</em&gt; Ферментативный анализ для измерения транскрипции ингибирование галлия (III) и H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-трис (пентафторфенил) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Быстрой и Бесхимический Гемоглобин Анализ с фототермического углового рассеяния света

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Поверхности функционализации наночастиц вирус гепатита Е, используя методы химической спряжение

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Изготовление мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения массива

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...