Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i Hathaway och Jin laboratorierna för deras bra diskussioner. Författarna också tacka Dan Crona och Ian MacDonald för deras kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds delvis av Grant R01GM118653 från amerikanska National Institutes of Health (till N.A.H.); och av bidrag R01GM122749, R01CA218600 och R01HD088626 från den amerikanska nationellt institut för hälsa (till J.J.). Detta arbete var också stöds av en tier 3 och en student bevilja från UNC Eshelman Institutet för Innovation (N.A.H och A.M.C, respektive). Ytterligare finansiering från en T-32 GM007092 (till A.M.C) stött detta arbete. Flödescytometri data erhölls vid UNC-Flow flödescytometri Core anläggningen finansieras av ett P30 CA016086 Cancer Center Core stöd bidrag till UNC Lineberger omfattande Cancer Center.

(1) cell linje kultur för att producera Lentivirus
<ol><li>Odla färska, låg-passagen (mindre än passage 30) 293T mänskliga embryonala njurar (HEK) celler i hög-glukos Dulbecco ändrade Eagle är medium (DMEM) base media kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x icke-essentiella aminosyror (NEAA), penna / STREP, 2-mercaptoenthanol i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Dela celler varje 3-5 d och innan de blivit > 95% konfluenta.</li>
	<li>Passagen 293T HEK celler med 18 x 106</s...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Här beskrev vi den nyligen utvecklat CEM system tillämpas som reglerar genuttryck och kromatin miljö på en specifik gen på ett dosberoende sätt. Vi tillhandahåller en noggrann metod för att studera dynamiken som är involverade i reglering av genuttryck genom selektiv rekrytering av specifika endogena kromatin reglerande proteiner. Detta är ett mycket modulärt teknik som kan användas för att undersöka hur olika protein - och kromatin-ändra komplex arbeta i samförstånd att ordentligt reglera kromatin milj?...

Kromatin består av DNA lindad runt Histon octamer proteiner som bildar kärna nukleosomens partikeln. Reglering av kromatin packning är en mycket viktig mekanism för korrekt DNA reparation, replikering och uttryck1,2,3. Ett sätt där celler styr nivån på kompaktering är genom tillägg eller borttagning av olika post-translationella Histon svans modifikationer. Två sådana ändringar omfattar (1) lysin acetylering, som oftast förknippas med gen aktivering, och (2) lysin metylering, som kan förknippas med antingen gen aktivering eller förtryck, beroende på kontexten aminosyra. Tillägg av markeringarna acetylering och metylering är katalyseras av Histon acetyltransferaser (hattar) och Histon metyltransferaser (HMTs), respektive, medan avlägsnandet av märket görs genom Histon deacetylases (HDAC) och Histon demethylases (HDMs ), respektive4,5. Även om förekomsten av dessa proteiner har varit känt i årtionden, många mekanismer av hur kromatin-ändra maskiner fungerar att ordentligt reglera genuttrycket återstår för att definieras. Eftersom kromatin tillsynsprocesser dysreglerad i många sjukdomar, kan nya mekanistiska insikter leda till framtida terapeutiska tillämpningar.
Kromatin i vivo analysen (CiA) är en nyligen beskriven teknik som använder en kemisk inducerare av närhet (CIP) för att styra kromatin-modifiera maskiner rekrytering till en viss locus6. Denna teknik har använts för att studera en växande lista av kromatin dynamik, inklusive Histon-ändra proteiner, kromatin remodelers och transkription faktorer6,7,8,9. CIP-baserade kromatin tjudra av exogent uttryckta proteiner har också förlängts förbi CiA att modulera icke-modifierade genetiska loci genom användning med en inaktiverad klustrade regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepar CRISPR-associerade protein (dCas9) 10 , 11. i CiA-systemet mESCs har ändrats för att uttrycka en god Jordbrukarsed reporter gen på det Oct4 locus, ett starkt uttryckt och strikt reglerade område av mESC genomet. Tidigare, detta system har använts för att beskriva dosberoende och reversibel rekrytering av exogent uttryckt Heterokromatin protein 1 (HP1), ett enzym som binder H3K9me3 och propagerar repressiva märken (t.ex., H3K9me3) och DNA metylering6. För att åstadkomma denna typ av rekryteringsstrategin, är mESCs infekterad med en plasmid som uttrycker en FK506-bindande protein (FKBP) kopplad till en Gal4, vilket är ett DNA-protein-ankare som binder till en Gal4-bindande uppsättning uppströms GFP reportern. Cellerna är också smittade med en FKBP-rapamycin-bindande domän (FRB) ansluten till HP1. När mESCs utsätts för låga nanomolar koncentrationer av CIP, rapamycin, både FRB och FKBP, sammanförs på det mål locus. Inom dagar rapamycin behandling, uttryck av målgenen är förträngt, vilket framgår av fluorescence mikroskopi och flöde flödescytometri och Histon acetylering minskas, visas av ChIP och bisulfite sekvensering. Medan utveckling och validering av detta tillvägagångssätt har varit stora framsteg inom området kromatin forskning och förordning, en nackdel är krävs exogena uttrycket av kromatin-modifiera maskiner.
För att göra tekniken baserat på rekrytering av endast endogena fysiologiskt relevanta enzymer och göra en mer modulära system, vi utformade och karakteriseras romanen bifunktionell molekyler, så kallade CEMs (figur 1)12. En komponent i CEMs inkluderar FK506, som liknar rapamycin, binder tätt och specifikt till FKBP. CEMs kommer således fortfarande att rekryteras till det Oct4 locus i den CiA-mESCs. Den andra komponenten i CEMs är en del som binder endogena kromatin-modifiera maskiner. I en pilotstudie testade vi CEMs som innehåller HDAC-hämmare. Medan begreppet med en hämmare för att rekrytera HDAC verkar kontraproduktivt intuitivt, är hämmaren ändå kunna rekrytera HDAC aktiviteter till genen av intresse. Detta åstadkoms genom att (1) omdirigera HDAC till det locus, släppa enzymet, och öka tätheten av un-hämmade HDAC i området och (2) upprätthålla HDAC hämning vid locus, men rekrytera repressiva komplex som binder till de hämmade HDAC, eller (3) en kombination av båda. I en tidigare studie visade vi att CEMs kunde framgångsrikt förtränga GFP reporter i ett dos - och tidsberoende sätt, liksom på ett sätt som var snabbt reversibel (dvs.inom 24 timmar)12. Vi kännetecknas förmågan av CEM teknik presenteras här till kontroll genuttryck med fluorescensmikroskopi, flödescytometri och förmågan för att styra kromatin miljön använder ChIP-qPCR6. Här, beskriver vi en metod för att använda och karaktärisera de CEMs, vilket kommer att underlätta anpassningen av detta system att besvara ytterligare frågor relaterade till kromatin biologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Reglering av kromatin packning är en viktig process som reglerar genuttryck i högre Eukaryoter. Även om kromatin kompaktering och uttryck genreglering störs ofta i många sjukdomar, har en locus-specifika, endogena och reversibel metod att studera och styra dessa verkningsmekanismer saknats. För att åtgärda det här problemet har vi utvecklat och karakteriseras romanen gen-reglerande bifunktionell molekyler. En komponent av bifunktionell molekylen binder till en DNA-protein ankare så att det kommer att rekryteras till en allel-specifika locus. Den andra komponenten engagerar endogena cellulära kromatin-modifiera maskiner, rekrytera dessa proteiner till en gen av intresse. Dessa små molekyler, som kallas kemisk epigenetiska modifierare (CEMs), klarar av att kontrollera genuttryck och kromatin miljön på ett dosberoende och reversibel sätt. Här, detalj vi ett CEM tillvägagångssätt och dess tillämpning på minska genuttryck och Histon svans acetylering på grönt fluorescerande Protein (GFP) reporter ligger på det Oct4 locus i mus embryonala stamceller (mESCs). Vi präglar ledningen CEM (CEM23) med hjälp av fluorescerande mikroskopi och flödescytometri kromatin immunoprecipitation (ChIP), följt av en kvantitativ polymeras-kedjereaktion (qPCR). Medan kraften i detta system demonstreras på det Oct4 locus, begreppsmässigt, CEM tekniken är modulära och kan appliceras i andra celltyper och på andra genetiska loci.

Vi har nyligen utvecklat CEMs och visat att denna teknik kan användas för att reglera genuttryck och kromatin miljön på en reporter locus i en dosberoende och reversibel sätt. I figur 1visas en modell av bly CEM, CEM23. HDAC maskiner rekryteras till det reporter locus av den HDAC-hämmare som i detta fall är god Jordbrukarsed reportern infogas vid det Oct4 locus.
Vi försökte karakt?...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Reglering av kromatin miljön är en viktig process som krävs för korrekt genuttryck. Här, vi beskriver en metod för att kontrollera genuttryck genom rekrytering av kromatin-modifiera maskiner på ett sätt som gen-specifika och reversibla.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i epigenetikfältet såsom mekanismerna för genreglering och orsaks- och verkanssamband mellan olika kromatinreglerande element. Den största fördelen med denna teknik är att det för första gången är möjligt att modulera en kromatin loci med fysiologiskt relevanta endogena enzymer. Generellt individer nya till denna metod kommer att kämpa eftersom mus ESL kultur är i sig svårt för dem som inte har utbildats i tekniken.Ytterligare demonstration av denna metod är kritisk som cellen virusinfektion steg är svåra att lära. Forskaren måste tid två separata rader av cellkultur och det är nödvändigt att vaksamt övervaka säkerheten under dessa steg. För att börja protokollet, passage 18 miljoner 293T HEK celler per 50 centimeter plattan.Aspirera de gamla medierna och tillsätt 10 milliliter av en X fosfat buffrad saltlösning, eller PBS. Aspirera PBS och tillsätt tre milliliter på 0,05%trypsin. Inkubera cellerna i trypsin i åtta minuter vid 37 grader Celsius.Rocka och knacka på cellerna halvvägs genom inkubationen. Följande dag, när cellerna har nått 60 till 80%konfluency, utföra en polyetylenimin, eller PEI, transfektion. Blanda sedan försiktigt DNA, PEI och transfection media i en 15 milliliter koniska rör.Inkubera provet i rumstemperatur i 15 minuter. Efter inkubation, tillsätt lösningen dropwise till 15 centimeter plattan. Sedan, inkubera provet i 16 timmar i en 37 grader Celsius inkubator med 5%koldioxid.Nästa dag, aspirera media och försiktigt ersätta den med förkrigade, färska 293 HEK media till 15 centimeter plattor. Efter medieutbytet, inkubera cellerna i en 37 grader Celsius inkubator med 5%koldioxid i 48 timmar. Räkna cellerna med en hemocytometer.Passage tidigare beredd mESC i en 12 väl plattan format med 100, 000 celler per brunn en dag före infektion. För celler som odlas i ett 10 centimeters format aspirera de gamla medierna, tillsätt fem milliliter av en X PBS, aspirera PBS och lägg till en milliliter på 0,25%trypsin. Inkubera cellerna i trypsin i åtta minuter vid 37 grader Celsius och rocka och knacka på cellerna halvvägs genom inkubationen.48 timmar efter medieutbytet, avlägsna och för över supernatanten för de 293T HEK-cellerna till ett koniskt rör på 50 milliliter. Centrifugera supernatanten vid 300 gånger G i fem minuter för att pelleta cellskräpetet. Därefter filtrera supernatanten genom ett 0,45 mikronmembran.Koncentrera viruset via ultracentrifug med en SW32 rotor och snurra provet på 72, 000 gånger G i två och en halv timme vid fyra grader Celsius. Medan viruset koncentrerar sig under ultracentrifugling, behandla CIA mESC: s i 12 brunnsplattan med färsk embryonal stam eller ES-media som innehåller fem mikrogram per milliliter polybrene. När viruskoncentrationen är klar aspirerar du noggrant supernatanten och upphäver försiktigt viruspelletsen i 100 mikroliter av en X PBS för att undvika överskott av bubblor.Tillsätt viruset och en X PBS till ett 1,5 milliliter Microfuge-rör. Vortexa röret på den lägsta inställningen för att helt upphäva viruset. Snurra ner röret i en mini bordsskiva centrifug i fem till 10 sekunder för att ta bort bubblor.Tillsätt 30 mikroliter av viruset till varje brunn av en 12 väl platta. Snurra plattan och sedan centrifugera proverna vid 1000 gånger G i 20 minuter. Placera 12 brunnsplattan tillbaka i 37 grader Celsius inkubator över natten.Följande morgon, utbyta media med färska ES-medier och tillåta infektion att äga rum i 48 timmar. Efter 48 timmars infektion, välj för celler som integrerade viral plasmid genom att lägga till lämplig antibiotika. Byt media dagligen.Håll urvalsmedia på cellerna i 72 till 96 timmar i en 37 grader Celsius inkubator med 5%koldioxid. Fortsätt med kemisk epigenetisk modifierare, eller CEM, beredning och behandling genom att avbryta den pulveriserade CEM och dimetylsulfaoxid, eller DMSO, till en lagerkoncentration på en millimolar och en arbetskoncentration på 100 mikromolar. Efter att cellerna har genomgått urval i 72 till 96 timmar, dela mESC: s i en 12 väl format med 100, 000 celler per brunn.Inkubera cellerna i en 37 grader Celsius inkubator med 5%koldioxid i 24 timmar. Efter inkubation, förbereda en medialösning på 100 nanomolar CEM med ES-media. Använd media för att mata CIA mESC med en milliliter brunn.Håll en brunn av celler utan någon tillagd CEM: s att fungera som en kontroll. Därefter ändrar media genom att aspirera de gamla medierna och lägga till en milliliter per välbeställda CEM som innehåller eller CEM fria ES-media var 24 timmar under hela experimentet. Efter 48 timmars CEM-behandling, avbilda cellerna utan CEM-behandling i cellerna som behandlats med 100 nanomolar CEM med hjälp av ett fluorescensmikroskop.Ta representativa bilder med hjälp av fas eller bright-field för att spela in mESC morfologi vid 10 till 40 gånger förstoring. Cellerna borde ha bildats runt kolonier med några få differentierade celler. Under KANALEN FITC fluorescens avbildar du båda cellförhållandena.Därefter isolera kontroll och CEM behandlade celler för flödescytometri genom att aspirera media, tvätta cellerna med en milliliter av en X PBS, aspirera PBS och lägga till 0,25 milliliter av 0,25%trypsin med EDTA i åtta till 10 minuter. Bekräfta att cellerna inte längre är hopbuntade i stora klumpar genom mikroskopet med 20 gånger förstoring. Om cellerna inte verkar vara i en enda cell suspension, försiktigt pipettera dem upp och ner med en P1000 pipetter för att helt trypsinize cellerna.Släck trypsin med en milliliter färska medier och resuspend cellerna i hög hastighet med en serologisk pipett tills cellerna är i en enda cell suspension. Snurra sedan ner cellerna i 300 gånger G i fem minuter i rumstemperatur. Aspirera supernatanten, tvätta cellerna med en X PBS, och centrifugcellerna.Aspirera PBS supernatant och resuspend cell pelleten i 200 mikroliter av FACS buffert. Utför flödescytometri på ungefär mer än 50, 000 celler med de upphängda cellerna och kör proverna med en lyshastighet på runt 5, 000 celler per sekund. Slutligen exportera uppgifterna för ytterligare analys.Fasbilder av CEM-systemet vid Oct4 locus och CIA mESC: s avbildas efter 48 timmars behandling med 100 nanomolar av CEM23 eller med obehandlade celler indikerar specifika GFP förtryck. Fluorescerande bilder visar ett ljust GFP-uttryck i kontrollcellerna och ett reducerat GFP-uttryck i mESC:s behandlade med CEM23. Flow cytometry visade konsekvent en större än 30%minskning av GFP uttryck i CIA mESC: s behandlas med 100 nanomolar av CEM23 i 48 timmar.Chromatin immunprecipitation, eller CHIP, vördade att 48 timmars behandling med 100 nanomolar av CEM23 minskade nivån av H3K27ac vid målet locus jämfört med kontrollceller. Medan du försöker detta förfarande, det är viktigt att komma ihåg att vara försiktig med musen embryonala stamceller. Om de skiljer under protokollet kommer resultaten att upphävas.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom syntetisk biologi att utforska in vivo-mekanismerna i däggdjursgenomet.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Skörd Murina alveolära makrofager och utvärdera cellulär aktivering inducerad av polyanhydrid Nanopartiklar

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolering av Cellular Lipid Droppar: Två reningstekniker Betyg från jästceller och mänskliga moderkakor

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk analys för att mäta transkription Hämning av gallium (III) och H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Utforma mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svaren Under Singel eller samexisterande Chemical / Elektrisk / Shear stresstimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

En snabb och kemisk-fritt hemoglobin-analys med fototermisk Vinkel Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Tillverkning av en multiplexade konstgjorda cellulära mikromiljö Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...