Name: repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Yazarlar Hathaway ve Jin laboratuarlar için onların yararlı tartışmalar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar da Dan Crona ve Ian MacDonald el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür. Bu eser kısmen Grant R01GM118653 üzerinden ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (için N.A.H.); tarafından desteklenen ve R01CA218600 ve R01HD088626 gelen ABD Ulusal hibe R01GM122749 tarafından Enstitüleri sağlık (JJ için). Bu eser de bir katmanı tarafından desteklenen 3 ve bir öğrenci vermek yenilik için UNC Eshelman Enstitüsünden (N.A.H ve A.M.C, sırasıyla). Ek T-32 GM007092 (A.M.C) finansman bu çalışmaları destekledi. Akış Sitometresi veri UNC akış sitometresi çekirdek bir P30 CA016086 Kanser Merkezi çekirdek destek hibe için UNC Lineberger kapsamlı Kanser Merkezi tarafından finanse edilen tesisinde elde edildi.

1) Lentivirus üretimi için hücre satırı kültürü
<ol><li>Taze, düşük-geçiş (geçit 30 daha az) büyümek 293T insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinde yüksek glikoz Dulbecco kartal modifiye'nın orta (DMEM) temel medya % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 10 mM HEPES, 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), kalem takıma'nın / Strep, 2-mercaptoenthanol 37 ° C kuluçka %5 CO2. Her 3-5 d hücreleri bölme ve > %95 birleşmesi önce olurlar.</li>
	<li>Geçit 293T HEK hücreleri ile 18 x 1...

<ol>
	<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance.">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li><li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+exchange,+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription.">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Gr&#228;ff, J., Tsai, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+molecular+mnemonics+on+the+chromatin.">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells.">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li><li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes.">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li><li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin.">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li><li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance.">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li><li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System.">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li><li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators.">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).</li><li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity.">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li><li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath.">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).</li><li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications.">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators.">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li></ol>

Burada, biz gen ekspresyonu ve kromatin çevre belirli bir gen, bir doz bağımlı şekilde düzenleyen uygulanan son zamanlarda geliştirilen CEM sistem nitelendirdi. Biz dinamikleri dahil belirli endojen kromatin düzenleyici proteinler seçici alımı yoluyla Gen ifadesinin düzenlenmesine çalışmak için bir yöntem sağlar. Bu uygulanabilir son derece modüler bir teknolojidir ne kadar farklı protein - ve kromatin-modifiye araştırmak için düzgün dysregulated, bu işlemler ile nasıl gidiyor çalışma olarak...

Kromatin DNA buna sarılarak çekirdek nucleosome parçacık histon octamer proteinleri oluşur. Kromatin sıkıştırma düzenlenmesi için uygun DNA tamir, çoğaltma ve ifade1,2,3temel bir mekanizmadır. Hücreleri sıkıştırma düzeyini kontrol bir ek veya çeşitli post-translational histon kuyruk değişiklikler kaldırılması yoludur. İki tür değişiklikler en çok gen harekete geçirmek ile ilişkilidir, (1) lizin asetilasyon ve gen harekete geçirmek ya da baskı, amino asit bağlama ile ilişkili olabilir (2) lizin metilasyonu içerir. Kaldırma işareti histon uyku (HDACs) ve histon demethylases (HDMs yapılır ise asetilasyon ve metilasyonu işaretleri ilavesi histon acetyltransferases (şapka) ve histon methyltransferases (HMTs), sırasıyla, katalizlenir ), sırasıyla4,5. Bu proteinler varlığını nasıl kromatin değiştirme makine işleri düzgün Gen ifadesinin düzenlenmesi için tanımlanması gereken kalır yıllardır, çeşitli mekanizmalar bilinmektedir rağmen. Kromatin düzenleyici işlemler dysregulated birçok insan hastalıkları içinde olduğundan, yeni mekanik anlayışlar gelecekteki tedavi uygulamaları için neden olabilir.
Kromatin vivo içinde tahlil (CIA) yakınlık (CIP) kimyasal bir uyarıcı kromatin değiştirme makine işe alım denetlemek için belirli locus6kullanan son zamanlarda açıklanan bir tekniktir. Bu teknoloji kromatin dinamikleri histon-modifiye proteinleri, kromatin remodelers ve transkripsiyon faktörleri6,7,8,9dahil olmak üzere, genişleyen bir listesini incelemek için kullanılmaktadır. CIP tabanlı kromatin exogenously ifade proteinlerin hayvan zinciri de CIA sigara değiştiren genetik loci modüle tarafından devre dışı bırakılmış kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yinelenen denetim CRISPR ilişkili protein (dCas9) ile kullanmak uzatıldı 10 , 11. CIA sisteminde mESCs GFP muhabir gen Oct4 odağı, son derece ifade ve kesinlikle düzenlenmiş alan mESC genom kopyası, hızlı şekilde değiştirilmiştir. Daha önce bu sistem exogenously ifade heterochromatin protein 1 (HP1), H3K9me3 bağlar ve baskıcı işaretleri (Örneğin, H3K9me3) yayar bir enzim doz bağımlı ve tersinir alımı açıklamak için uygulanan ve DNA metilasyon6. İşe alım stratejisi bu tür yapmak için mESCs bir Gal4 bağlama dizi GFP muhabir için akıntıya karşı bağlar bir DNA-protein çapa bir Gal4 bağlı bir FK506-bağlayıcı protein (FKBP) ifade eder bir plazmid ile bulaşmış. Hücreleri de HP1 için bağlı bir FKBP-rapamycin-bağlayıcı etki (FRB) ile bulaşmış. MESCs CIP konsantrasyonları düşük nanomolar maruz kaldığında, rapamycin, FRB ve FKBP, bir araya getirdi hedef odağı. Gün rapamycin tedavisi içinde ifade hedef Gen tarafından floresans mikroskobu ve akış sitometresi kanıtladığı gibi bastırılmış ve çip ve bisülfit sıralamanın tarafından gösterilen histon asetilasyon azalır. Geliştirme ve doğrulama Bu yaklaşımın kromatin araştırma ve düzenleme alanında önemli gelişmeler olmuştur iken, bir dezavantajı gerekli eksojen kromatin değiştirme ifadesidir makine.
Sadece endojen fizyolojik ilgili enzimler işe üzerinde esaslı teknoloji yapmak ve bir daha modüler sistem yapmak için tasarlanmış ve CEMs (Şekil 1)12olarak adlandırdığı yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. CEMs bir bileşeni içerir hangi, rapamycin için benzer sıkı ve özellikle bağlar FK506 FKBP için. Böylece, CEMs hala CIA mESCs Oct4 odağı için alınacaktır. Diğer CEMs endojen kromatin değiştirme makine bağlar bir yan bileşenidir. Bir pilot çalışmada, HDAC inhibitörleri içeren CEMs test ettik. HDACs işe almak için bir inhibitörü kullanarak kavramı karşı sezgisel görünüyor olsa da, engelleyici yine de HDAC etkinliği ilgi gen için recruit yapabiliyor. Bu (1) HDAC odağı, enzim, serbest ve alan ve (2) bakımı HDAC inhibisyon odağı, un Inhibe HDACs yoğunluğu artan ama Inhibe HDACs bağlamak baskıcı kompleksleri işe yönlendirme tarafından gerçekleştirilir, veya (3) her ikisinin bir birleşimi. Bir önceki çalışmada, biz CEMs başarıyla GFP muhabir bir doz ve zaman bağımlı şekilde, hem de hızla geri dönüşümlü bir şekilde bastırmak mümkün olduğunu gösterdi (yani, 24 saat içinde)12. Biz burada ChIP-qPCR6kullanarak kromatin ortamını denetlemek için floresans mikroskobu, akış sitometresi ve yetenek kullanarak denetim gen ekspresyonu için sunulan CEM teknoloji yeteneği ile karakterizedir. Burada, biz kullanarak ve kromatin Biyoloji ile ilgili ek sorularınız cevaplamak için bu sistem adaptasyonu kolaylaştıracaktır CEMs karakterize bir yöntem açıklanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:697px;" width="698">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013CV</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">NEAA</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">HEPES (for tissue culture)</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">BME (2-Mercaptoethanol)</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">FBS</td>
			<td>Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Individual lots tested for quality</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris tubes</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-632R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Covaris caps</td>
			<td style="width:164px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">C4008-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">PEI (polyethylenimine)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Transfection media (Opti-mem)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus centrifuge tubes</td>
			<td style="width:164px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Virus filter membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC134220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.25 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">0.05 % Trypsin</td>
			<td style="width:164px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25400-054</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Puromycin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:164px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">H3K27ac antibody</td>
			<td style="width:164px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td>
			<td style="width:164px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Sonicator</td>
			<td style="width:164px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">E110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:164px;">Optima</td>
			<td style="width:119px;">XPN-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">14U4354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SW-32 Ti centrifuge buckets</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">130.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LentiX 293 Human Embryonic Kidney</td>
			<td style="width:164px;">Clontech</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">PBS</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">BSA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EGTA</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tris</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">NP40</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11754599001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton</td>
			<td style="width:164px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">807426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Glycine</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">TE buffer</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2474-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES (for ChIP)</td>
			<td style="width:164px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Gelatin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Flow cytometer, Attune NxT</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">FKBP-Gal4 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">44245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">psPAX2 plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pMD2.G plasmid</td>
			<td style="width:164px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Nanodroplets</td>
			<td style="width:164px;">MegaShear</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">DNA Nanodrop</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Leupeptin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Chymostatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">230790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Protease Inhibitors (Pepstatin)</td>
			<td style="width:164px;">Calbiochem/EMD</td>
			<td style="width:119px;">516481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:232px;">CiA:Oct4 mESC</td>
			<td style="width:164px;">The kind gift of G. Crabtree</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:232px;">Lif-1C-alpha - producing Cos cells</td>
			<td>The kind gift of J. Wysocka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

repressing gene transcription by redirecting cellular machinery with chemical epigenetic modifiers

Düzenleme, kromatin sıkıştırma daha yüksek ökaryotlarda gen ekspresyonu yöneten önemli bir süreçtir. Kromatin sıkıştırma ve gen ifade düzenlemesi yaygın birçok hastalıklarda kesintiye rağmen çalışma ve mekanizmaların eylem kontrol odağı özgü, endojen ve tersinir bir yöntem eksik edilmiştir. Bu sorunu gidermek için biz geliştirdik ve gen düzenleyen yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. Böylece bir formda özel locus alınacaktır bifonksiyonel molekülünün bir bileşeni bir DNA-protein çapa bağlar. Başka bir bileşen bu proteinler bir gen ilgi için işe endojen hücresel kromatin değiştirme, iş makineleri yürütmektedir. Bu küçük moleküllerin kimyasal epigenetik değiştiriciler (CEMs) denilen, gen ekspresyonu ve kromatin çevre doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde kontrol yeteneğine sahiptirler. Burada, CEM yaklaşım ve gen ekspresyonu ve histon kuyruk asetilasyon Oct4 locus fare embriyonik kök hücreler (mESCs) içinde yer alan yeşil flüoresan Protein (GFP) gazeteci, azaltmak için uygulama ayrıntılı. Biz kurşun karakterize floresan mikroskopisi, akış sitometresi ve kromatin immunoprecipitation (ChIP), CEM (CEM23) takip nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından. Bu sistemin gücü Oct4 odağı kavramsal olarak gösterilmiştir, CEM teknoloji modüler ve diğer hücre tipleri ve diğer genomik loci uygulanabilir.

Biz son zamanlarda CEMs geliştirdi ve bu teknoloji gen ekspresyonu ve kromatin çevrenin bir muhabir odağı, doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde düzenlemek için uygulanabilir olduğunu gösterdi. Şekil 1' de, CEM, CEM23, manken müşteri adayının gösterilir. HDAC makine muhabir odağı olan, bu durumda, Oct4 odağı eklenen GFP muhabir HDAC inhibitörü tarafından oluşturulmuştur.
<p class="jove_content" fo:keep-together...

Watch this Scientific Journal Video about Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers at JoVE.com

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Bu yöntem, gen düzenleme mekanizmaları ve farklı kromatin düzenleyici unsurlar arasındaki neden-sonuç ilişkileri gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtalmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilk kez fizyolojik olarak ilgili endojen enzimlerle bir kromatin loci modülünün mümkün olmasıdır. Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler mücadele edecek, çünkü fare ESL kültürü teknikte eğitilemeyenler için doğal olarak zordur.Hücre viral enfeksiyon adımları öğrenmek zor olduğu gibi bu yöntemin daha fazla gösteri önemlidir. Araştırmacı hücre kültürünün iki ayrı satır zaman gerekir ve bu adımlar sırasında güvenlik dikkatle izlemek için gereklidir. Protokolü başlatmak için, 50 santimetre plaka başına 293T HEK hücrelerinin 18 milyon geçiş.Aspire eski medya ve bir X fosfat tamponlu salin veya PBS 10 mililitre ekleyin. PBS aspire ve 0.05% tripsin üç mililitre ekleyin. Hücreleri tripsin içinde 8 dakika 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Hücreyi küçmeden yarıyolda sallayıp dokunun. Ertesi gün, hücreler %60-80 biraraya geldiğinde, bir polietilenin veya PEI transfeksiyonu gerçekleştirin. Daha sonra, DNA, PEI ve transfeksiyon ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpte hafifçe karıştırın.Numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra çözeltiyi 15 santimetrelik plakaya damlacık ekleyin. Daha sonra, numuneyi %5 karbondioksitle 37 derece lik bir kantinde 16 saat kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, medya aspire ve yavaşça önceden ısıtılmış ile değiştirin, taze 293 HEK medya 15 santimetre plakaları. Medya değişiminden sonra hücreleri 37 derece lik bir kantinde 48 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Hücreleri hemositometreile say.Passage daha önce 12 iyi plaka formatında 12 iyi plaka formatında 100, 000 hücre başına iyi bir gün önce enfeksiyon. 10 santimetre formatında yetişen hücreler için, eski ortama aspire edin, bir X PBS beş mililitre ekleyin, PBS aspire, ve 0.25% tripsin bir mililitre ekleyin. Hücreleri 8 dakika boyunca tripsin'de 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve kuluçkanın yarısına kadar hücrelere dokunun.Medya değişiminden 48 saat sonra, 293T HEK hücrelerinin süpernatantını çıkarın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre enkazını peletlemek için süpernatant'ı 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Daha sonra, 0,45 mikron membran üzerinden supernatant filtre.Bir SW32 rotor ile ultracentrifuge ile virüs konsantre ve dört santigrat derece iki buçuk saat için 72, 000 kez G örnek spin. Virüs ultracentrifugation altında yoğunlaşırken, 12 iyi plaka taze embriyonik kök veya ES media Polybrene mililitre başına beş mikrogram içeren CIA mESC tedavi. Virüs konsantrasyonu bittiğinde, dikkatle supernatant aspire ve dikkatle aşırı kabarcıklar önlemek için bir X PBS 100 mikrolitre virüs pelet askıya.1.5 mililitrelik Microfuge tüpüne virüs ve bir X PBS ekleyin. Virüsü tamamen askıya almak için tüpü en düşük ayarda girdap. Kabarcıkları kaldırmak için beş ila 10 saniye boyunca bir mini masa üstü santrifüj tüp aşağı spin.12 kuyu plakaher kuyuya virüs 30 mikrolitre ekleyin. Plakayı döndürün ve örnekleri 1000 kez G'de 20 dakika santrifüj edin. 12 kuyu plakasını bir gecede 37 derece lik kantine geri yerleştirin.Ertesi sabah, taze ES medya ile medya alışverişi ve enfeksiyon 48 saat boyunca gerçekleşmesine izin. Enfeksiyon 48 saat sonra, uygun antibiyotik ekleyerek viral plazmid entegre hücreleri için seçin. Medyayı her gün değiştirin.Seçim ortamını hücrelerde %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir kantinde 72 ila 96 saat boyunca saklayın. Toz CEM ve dimetil sülfatoksit veya DMSO'yu bir milimolar stok konsantrasyonuna ve 100 mikromolar çalışma konsantrasyonuna askıya alarak kimyasal epigenetik değiştirici veya CEM ile devam edin. Hücreler 72 ila 96 saat seçim yapıldıktan sonra, mmC's 12 iyi formatında 100, kuyu başına hücreleri ile bölün.Hücreleri 37 derece lik bir kuluçka makinesinde 24 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra ES media ile 100 nanomolar CEM'lik bir ortam çözümü hazırlayın. CIA mESC'yi bir mililitre kuyuyla beslemek için medyayı kullanın.Herhangi bir cem olmadan hücrelerin bir kuyu tutun bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Daha sonra, eski medyayı azarlayarak ve deney süresince her 24 saatte bir yeni hazırlanmış CEM içeren cem veya CEM içermeyen ES medyasından her bir mililitre ekleyerek ortamı değiştirin. 48 saatlik CEM tedavisinden sonra, 100 nanomolar CEM ile tedavi edilen hücrelerde CEM tedavisi olmayan hücreleri floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin.mESC morfolojisini 10 ila 40 kat büyütme de kaydetmek için faz veya parlak alan kullanarak temsili görüntüler alın. Hücreler birkaç farklılaşmış hücre ile koloniler etrafında oluşmuş olmalıdır. FITC floresan kanalı altında, her iki hücre koşullarını görüntüleyin.Daha sonra, kontrol ve CEM gaz hücreleri akış sitometri sitometri için medya aspirating tarafından izole, bir X PBS bir mililitre ile hücreleri yıkama, PBS aspirating ve edta ile 0.25% 0.25 tripsin ekleyerek sekiz ila 10 dakika. Hücrelerin artık mikroskop aracılığıyla 20 kat büyütme kullanarak büyük kümeler halinde demetlenmediğini doğrulayın. Hücreler tek bir hücre süspansiyonunda görünmüyorsa, hücreleri tam olarak denemek için p1000 pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Bir mililitre taze ortamla tripsini söndürün ve hücreler tek hücreli süspansiyona gelene kadar serolojik pipetle hücreleri yüksek hızda yeniden askıya alın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri 300 kez G'de aşağı doğru çevirin. Süpernatant aspire, bir X PBS ile hücreleri yıkayın ve hücreleri santrifüj.PBS supernatant aspire ve FACS tampon 200 mikrolitre hücre pelet resuspend. Askıda hücrelerle yaklaşık 50.000'den fazla hücre üzerinde akış sitometrisi yapın ve örnekleri saniyede yaklaşık 5.000 hücrelik bir kılıf hızında çalıştırın. Son olarak, daha fazla analiz için veri dışa aktarın.Oct4 locus ve CIA mESC'deki CEM sisteminin faz görüntüleri, 100 nanomolar CEM23 veya işlenmemiş hücrelerle 48 saatlik tedaviden sonra görüntülenir ve spesifik GFP baskısına işaret eder. Floresan görüntüler, kontrol hücrelerinde parlak bir GFP ifadesi ve MESC'nin CEM23 ile tedavi edilen gfp ifadesinde azaltılmış bir Ifade gösterir. Akış sitometrisi, CIA mESC'nin 48 saat boyunca 100 nanomolar CEM23 ile tedavi edilen GFP ekspresyonunda %30'dan fazla bir azalma olduğunu gösterdi.Kromatin immünopresipite, veya CHIP, cem23 100 nanomolar ile tedavi 48 saat kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında hedef lokus h3K27ac düzeyini azalttı reveled. Bu işlemi denerken, fare embriyonik kök hücreleri ile dikkatli olmak hatırlamak önemlidir. Protokol sırasında farklılaşırlarsa, sonuçlar geçersiz kılınur.Bu teknik, geliştirildikten sonra sentetik biyoloji alanındaki araştırmacıların memeli genomundaki in vivo mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Fototermal Eğik ışık saçılımı ile hızlı ve Kimyasal içermeyen Hemoglobin Deneyi

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...