Name: an oligonucleotide-based tandem rna isolation procedure to recover eukaryotic mrna-protein complexes
Uploaded: 2018-08-18T15:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes at JoVE.com

نحن ممتنون للدكتور جوناثان هول وماورو زيمرمان (ETH زيوريخ) لتركيب PFK2 و المجلس الانتخابي المؤقت-1 منظمات خدمات الإيدز، الدكتور صدر ووترز لتصميم منظمات خدمات الإيدز p27/CDKN1B، والدكتور رافال سيوسك (فريدريك ميسشر معهد "البحوث الطبية الحيوية"، بازل) للأجسام المضادة-شعبة الشؤون القانونية العامة-1. هذا العمل كان تدعمها التكنولوجيا الحيوية ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BB/K009303/1) والملكية المجتمع وولفسون البحوث جائزة الجدارة (WM170036) إلى A.P.G.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

رحلة يسمح تحليل البروتينات منضمة إلى مرناس محددة في فيفو بالوسائل البيوكيماوية. في حين أننا استخدمنا الأسلوب للتحقق من صحة التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية خاصة مع أهداف مرناً من الكائنات الحية/خلايا مختلفة، رحلة يمكن أن ينطبق أيضا على دراسة أنواع أخرى من poly(A) الكشف، مثل نكرناس طويلة هيولى. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق تحليل منهجي للبروتينات منضم و/أو الكشف مع تسلسل الحمض النووي الريبي أو مرض التصلب العصبي المتعدد بزيادة من هذا الإجراء. وفي هذا الصدد، لدينا البيانات الأولية تشير إلى أن 1 لتر من الخميرة الثقافات ومالا يقل عن 100 مليون من الخلايا HEK293 البشرية يمكن أن توفر مواد انطلاق كافية للحصول على بيانات موثوقة من مرض التصلب العصبي المتعدد مرناس أعرب جيدا (غير منشورة النتائج).
يشمل البروتوكول رحلة وصف تشعيع الخلايا مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر للتفاعلات التشعب الجيش الملكي النيبالي بالبروتين. وهذا يتيح تنفيذ الشروط الصارمة أغسل أثناء تنقية. ومع ذلك، على الرغم من عدم وضوح اختبارها، نود أن نشير أن crosslinking اختيارية ويمكن أيضا استرداد رنبس النشطة مع المخازن المؤقتة الفسيولوجية. ومع ذلك، ينبغي إعادة ترتيب المحتملة من البروتينات واو الكشف عن هدف الجيش الملكي النيبالي في ليساتيس في هذه الحالة، في الاعتبار. على العكس من ذلك، إذا كانت الأشعة فوق البنفسجية أو غيرها من الإجراءات كروسلينكينج التطبيقية (مثلاً، والفورمالديهايد)، ينبغي تقييم سلامة الجيش الملكي النيبالي تدهور الجيش الملكي النيبالي يمكن أن يؤدي إلى تناقص استرداد مرنبس. بالإضافة إلى ذلك، كروسلينكينج الأشعة فوق البنفسجية عدم كفاءة بدلاً من ذلك (~ 5 ٪) وحتى أقل من ذلك للبروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، التي يمكن أن تستحدث التحيز للكشف عن فئات معينة من الممارسات التجارية التقييدية12. وأخيراً، يمكن أيضا حمل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية كروسلينكس البروتين-بروتين والبروتين-الحمض النووي التي ينبغي النظر في البيانات الشفوية45،46. ولذلك، يمكن أيضا إجراءات crosslinking البديلة، على سبيل المثال مع فورمالدهايد، أهمية خاصة لالتقاط أكبر تجميعات البروتين في مرناس.
هو إحدى السمات الرئيسية لرحلة خطوتين الداخلي القائم على أسو تنقية لاسترداد الكشف خاصة، مما يزيد من الانتقائية وتقليل احتمال المشاركة تنقية الملوثات. على سبيل المثال، القلق واحدة تتعلق بإضافة منظمات خدمات الإيدز بيوتينيلاتيد مباشرة إلى مقتطفات الخلية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تنقية المشارك من البروتينات البيوتين-ملزمة. وهذا هو التحايل في رحلة بتنفيذ جولة أولى من تنقية للكشف poly(A) باستخدام oligo-(dT) تساهمي إلى جانب25 المغناطيسي الخرز، مما يسمح لتنقية صرامة شروط كما فعلت لالتقاط إينتيراكتومي الجيش الملكي النيبالي بالبروتين. علاوة على ذلك، poly(A) الحمض النووي الريبي اختيار يزيل نكرناس وفرة عالية، مثل الكشف الريباسي وترناس، وذلك يقلل من تعقيد بعينه والمصادر المحتملة للصليب-التهجين والتلوث. في الخطوة الثانية، يتم استردادها مع بيوتينيلاتيد مرناس خاصة وتعديل لمنظمات خدمات الإيدز أن يصلب مع المناطق على أهداف مرناً. بدلاً من ذلك، تعديل منظمات خدمات الإيدز يمكن أن تكون مباشرة تساهمي تعلق أيضا على الخرز المغناطيسي عن طريق أمين-رابط، الحد من الميل إلى التقاط البيوتين ملزم البروتينات. ومع ذلك، في تجربتنا، حضانة كسر الجيش الملكي النيبالي poly(A) مع منظمات خدمات الإيدز قبل إضافة الخرز streptavidin تعافي مرنبس أكثر كفاءة من المباشرة إضافة إلى جانب أسو الخرز. ربما، هي كينيتيكالي يفضل أوليجوس الحرة مع وصول أفضل إلى تسلسل في الجيش الملكي النيبالي تنظيماً بالمقارنة مع أوليجوس المعطل تداولها. ومن ثم، اقتران التساهمية لمنظمات خدمات الإيدز لحبات قبل الاحتضان مع العينة يمكن أن تكون ضارة لانتعاش هدف الجيش الملكي النيبالي ويمكن اختباره تجريبيا.
عيب واحد مع أساليب أسو على أساس عدم كفاءة استرداد بعض مرناس المستهدفة. ولذلك نوصي بتقييم عدة منظمات خدمات الإيدز أن يصلب إلى مناطق مختلفة من النسخة. على وجه التحديد، فإننا نقترح تصميم منظمات خدمات الإيدز 2-3 أن يصلب مع تسلسل في 3 '-UTR أو الأقراص المضغوطة من مرناً للفائدة. كل أسو قد يحمل من كفاءة مختلفة لاسترداد الهدف مرناً كل منها، وينبغي أن يكون تجريبيا اختبار (الشكل 2 أ، ب، المعطيات غير معروضة). في النهاية، وجدنا أن منظمات خدمات الإيدز الصلب لتحيلها 3 ' أداء أفضل بالمقارنة مع تلك الصلب إلى أقراص مدمجة. يمكن أن يكون هذا بسبب زيادة إمكانية الوصول إلى مواقع في تحيلها الربط بسبب عدم وجود ترجمة ريبوسوم، بينما ريبوسوم قد يعرقل التهجين كفاءة داخل الاسطوانات. شهدنا أيضا أن الجمع بين عدة منظمات خدمات الإيدز يمكن أن يؤدي إلى زيادة التلوث من وفرة غير المستهدفة مرناس وانخفاض كفاءة المنسدلة. على أي حال، يمكن التحكم بانتقائية أوليجوس المختار بالتجارب المنافسة (على سبيل المثال-، إضافة أوليجوس المتنافسة).
أخرى القلق يتصل بالتهجين عبر المحتملة مع الكشف غير ذات صلة، كما لاحظنا أن التهجين حتى ولو جزئية مع مرناس الأخرى يمكن أن يؤدي إلى استرداد تلك مرناً (الشكل 2). لتقييم مدى ملاءمة منظمات خدمات الإيدز مصممة، ولذلك نوصي أداء الأولية في المختبر التجارب مع الكشف التام تركيزات الملح ودرجة حرارة الغسيل من المخازن المؤقتة على النحو الأمثل. في أيدينا، غسالة من ستريبتافيدين-إلى جانب الخرز المغناطيسية في المخازن المؤقتة التي تحتوي على 150 مم كلوريد الصوديوم في 55 درجة مئوية أداء أفضل، ولكن نوصي باختبارات مستقلة من الشروط لكل أسو مصممة. الجدير بالذكر، وجدنا أن جميع منظمات خدمات الإيدز المحدد من تجارب في المختبر (الشكل 2D) كانت مناسبة لالتقاط الهدف مرناً كل منهما من مقتطفات الخلية كروسلينكيد (الشكل 3)، كذلك تثبت صحة في المختبر الاختبار. وإلى جانب تصميم منظمات خدمات الإيدز مناسبة لالتقاط مرناً، يمكن أن تؤثر عوامل إضافية على الانتقائية. ولذلك، يمكن منع إجراءات حظر شامل مع جيش صرب البوسنة و/أو الحمض الريبي النووي النقال وفقا لمواصفات نوع حبة ملزمة غير محدد الخرز. لزيادة خفض الاستيعاب غير محدد من البروتينات، نوصي أيضا باستخدام لو-ربط الأنابيب، خاصة عند العمل مع كميات قليلة من العينات.
وبصفة عامة، يمكن أن تكمل الرحلة النهوج المتبعة سابقا لالتقاط الكشف مع منظمات خدمات الإيدز. على سبيل المثال، كان الجيش الملكي النيبالي غير الترميز زيست معزولة مع البروتينات منضم من مقتطفات النووية المستمدة من 200 مليون من الخلايا كروسلينكيد الأشعة فوق البنفسجية باستخدام صفيف من الطويل (90-مير) بيوتينيلاتيد الحمض النووي النوكليوتيد التي غطت نص كامل 34،35. ومع ذلك، يمكن أن يصبح النهج المختار تبليط إشكالية في ضوء إمكانات كبيرة للصليب-التهجين مع الكشف لا علاقة لها، ولا يمكن استخدامه لتحديد نسخة محددة، على سبيل المثال-، وبدلاً من ذلك تقسم أشكال. في الآونة الأخيرة، مصممة خصيصا مؤمن الحمض النووي (LNA) أو ميكسميرس "أسو الحمض النووي" تم إرفاقه تساهمي راتنج مغناطيسي لاسترداد نسخة في المختبر أو الغاية المعلنة الريباسي الكشف من مقتطفات الخلية الحرة؛ ومع ذلك، لم تم اختباره لاسترداد في فيفو شكلت مرناً بالبروتين المجمعات36. في ضوء زيادة الاعتراف بالجينات بوستترانسكريبشونال مراقبة الممارسات التجارية التقييدية ونكرنا، نعتقد أن الرحلة وسيلة مفيدة للتحقيق في تكوينها وديناميات مجمعات رنب داخل الخلايا عند الإشارات داخل الخلايا والبيئية وتأثيرها في الصحة والمرض.

هو الدافع وراء تنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال من خلال التفاعلات بين الكشف (نكرناس) ومرناس الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية)، غير الترميز، الذي المباشر التجهيز والتعريب والترجمة والانحلال من كل نسخة داخل الخلايا1 , 2-تحديد الممارسات التجارية التقييدية ونكرنا التفاعل مع مرناس خاصة، إنشاء ما يعرف باسم ريبونوكليوبروتين مجمعات/الجسيمات (رنبس)، ولذلك هو المفتاح لفهم مصير تحكم تعبير مرناس والجينات. تقوم نهج تكميلية لتوصيف البيوكيميائية رنب مجمعات3،4: بينما يستند النهج "البروتين التي تركز على" تنقية محددة الممارسات التجارية التقييدية، ينطوي "الجيش الملكي النيبالي" النهج المرتكز عزل الفئات السكانية الفرعية أو الكشف الفردي والتحليل اللاحق للبروتينات المتفاعلة أو الكشف. في الآونة الأخيرة، نهج المرتكز على الحمض النووي الريبي للتعرف على الممارسات التجارية التقييدية مرجع التفاعل مع بوليادينيلاتيد (poly(A)) الكشف5 أصبحت شعبية متزايدة بإدراج خطوة crosslinking ضوء (الأشعة فوق البنفسجية) الأشعة فوق البنفسجية على استقرار البروتين-الجيش الملكي النيبالي التفاعلات السابقة عزلة مرناس، الذي مدد كبير الكتالوج الخاص بالممارسات التجارية التقييدية في الخلايا البشرية6،،من78،،من910،11، ايليجانس كاينورهابديتيس 12،13،12، saccharomyces cerevisiae14، وسائر الكائنات الحية15،16،،من1718، ،من 1920. ومع ذلك، رسم خرائط للبروتينات و/أو نكرناس تجميعها على وقائع معينة لا يزال تحديا كبيرا. وتحقيقا لهذه الغاية، تستخدم حاليا نهجين رئيسيين: من ناحية، تنصهر فيها الجيش الملكي النيبالي ابتمر العلامات للجيش الملكي النيبالي الفائدة لتمكين انجذاب تطهير. وبالتالي، ربط الابتامرات الجيش الملكي النيبالي مع تقارب عالية للمضادات الحيوية امينوغليكوزيد بما في ذلك توبراميسين وستربتوميسين21،22،،من2324، أو للبروتينات، مثل البروتين معطف من R17/MS2 عاثية أو الجرثومي ستريبتافيدين S125،،من2627،،من2829. على الرغم من أن هذا النهج كان سيظهر أن تكون قوية ومرنة نسبيا، فإنه يتطلب استنساخ لتصميم الجيش الملكي النيبالي قيد التحقيق، وبالتالي لا يمكن استخدامها لالتقاط مرناس الطبيعية. من ناحية أخرى، النوكليوتيد العقاقير (منظمات خدمات الإيدز) استخدمت في وقت مبكر للانتعاش وتوصيف للغاية وأعرب عن30،رنبس الأصلية31 والفيروسية الكشف32. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق منظمات خدمات الإيدز لالتقاط الترميز غير طويلة الكشف33،،من3435 و في المختبر شكلت مرنبس36. هو أحد العوامل المقيدة الرئيسية مع كافة النهج التي تركز على الحمض النووي الريبي عدد نسخ الحمض النووي الريبي للفائدة، مما يجعل استعادة مرناس منخفضة-وأعرب عن أكثر إشكالية. ويمكن التغلب على هذا القيد برفع مستوى رد فعل؛ ومع ذلك، هذا يمكن أن يحتمل أن يؤدي إلى زيادة الخلفية.
وهنا، يمكننا وصف لدينا وضعت مؤخرا على أساس أسو جنبا إلى جنب الجيش الملكي النيبالي العزل الداخلي (رحلة) لعزل مجمعات البروتين مرناً الأصلية بانتقائية عالية37 (الشكل 1). البروتوكول يتطلب خطوتين تنقية المستندة إلى أسو متسلسلة، وهي عزلة مرناس poly(A) مع oligo(dT) المتاحة تجارياً إلى جانب الخرز تليها أسر مرناس محددة تستخدم على وجه التحديد المصممة بيوتينيلاتيد قصيرة 2-ميثوكس الجيش الملكي النيبالي منظمات خدمات الإيدز. يساعد على القضاء على البروتينات تلويث هذا الإجراء المكون من مرحلتين ويضيف فرص للتعديل والتحسين. في هذه الحالة، رحلة كان يطبق على مرناس مختارة من الخميرة، الديدان الخيطية، وشكلت الخلايا البشرية لتأكيد في فيفو مرناً-البروتين المجمعات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE5000-8CE</td>
			<td>Floor shaker to grow yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBD 6220</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator to grow human cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Soniprep150</td>
			<td>MSE</td>
			<td>MSS150.CX4.5</td>
			<td>Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td>Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>RETSCH MM200</td>
			<td>Device to mechanically disrupt yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge to spin down cells, lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator, Thriller</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Thermoshaker for 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads 0.5mm</td>
			<td>Stratech Scientific Limited</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Lysis of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter, 0.41 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NY4104700</td>
			<td>Collection of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HA Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHA02510</td>
			<td>Filter to clear nematode lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22431081</td>
			<td>Minimise protein loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microfuge tube</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12425</td>
			<td>Yeast extract preparation and other applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>129A</td>
			<td>Collection of HEK293 cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>Collection C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Collection yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966</td>
			<td>Media for culturing HEK293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Used to supplement cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>DNAse I to degrade DNA from cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td>RNase inhibitor to avoid RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Oligo (dT)25</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61011</td>
			<td>Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td>Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109550001</td>
			<td>transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td>To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Act1</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>869100</td>
			<td>Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Act1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td>Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-HuR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5261</td>
			<td>Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti&#8211;CYC-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>456100</td>
			<td>Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase anti-peroxidase soluble complex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1291</td>
			<td>Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NXA931</td>
			<td>HRP-coupled secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an oligonucleotide-based tandem rna isolation procedure to recover eukaryotic mrna-protein complexes

الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) دوراً رئيسيا في التحكم في بوستترانسكريبشونال التعبير الجيني. ولذلك توصيف البيوكيميائية مجمعات مرناً بالبروتين ضروري لفهم التنظيم مرناً الاستدلال بالبروتينات المتفاعلة أو الكشف غير الترميز. وهنا، نحن تصف إجراء عزل الحمض النووي الريبي جنبا إلى جنب (رحلة) التي تمكن من تنقية البروتين مرناً اندوجينوسلي شكلت مجمعات من مقتطفات الخلوية. يشمل البروتوكول خطوتين عزلة بوليادينيلاتيد مرناس مع حبات العقاقير oligo(dT) وبعد ذلك القبض على مرناً للفائدة مع 3 '--بيوتينيلاتيد 2-س-ميثليته النوكليوتيد العقاقير الجيش الملكي النيبالي، الذي يمكن أن تكون معزولة ثم مع حبات ستريبتافيدين. واستخدمت الرحلة لاسترداد في فيفو كروسلينكيد مرناً-ريبونوكليوبروتين (مرنب) مجمعات من الخميرة والديدان الخيطية والخلايا البشرية لمزيد من التحليل الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات. وبالتالي، رحلة من اتباع نهج متعدد الاستخدامات التي يمكن تكييفها لجميع أنواع بوليادينيلاتيد الكشف عبر الكائنات الحية لدراسة دينامية إعادة ترتيب مرنبس تفرضها العظة داخل الخلايا أو البيئية.

Watch this Scientific Journal Video about An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes at JoVE.com

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

ويرد وصف إجراء عزل الحمض النووي الريبي جنبا إلى جنب (رحلة) لانتعاش مجمعات البروتين مرناً اندوجينوسلي المشكلة. على وجه التحديد، مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي كروسلينكيد في فيفو، الكشف بوليادينيلاتيد المعزولة من مقتطفات مع الخرز oligo(dT)، ويتم التقاطها مرناس خاصة مع تعديل الجيش الملكي النيبالي النوكليوتيد العقاقير. يتم الكشف عن البروتينات منضمة إلى مرناس بتحليل إيمونوبلوت.

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...