Name: an oligonucleotide-based tandem rna isolation procedure to recover eukaryotic mrna-protein complexes
Uploaded: 2018-08-18T15:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes at JoVE.com

हम आभारी हैं डॉ जोनाथन हॉल और Mauro Zimmermann (ETH ज्यूरिख) के संश्लेषण के लिए PFK2 और वयक-1 ASOs, डॉ Maikel वाउटर के डिजाइन के लिए p27/CDKN1B ASOs, और डॉ रफाल Ciosk (फ्रेडरिक Miescher इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल रिसर्च, बेसल) एंटी-GLD-1 एंटीबॉडी के लिए । यह काम जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद् द्वारा समर्थित किया गया था (BB/K009303/1) और एक रॉयल सोसाइटी Wolfson रिसर्च मेरिट अवार्ड (WM170036) को A.P.G.

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यात्रा जैव रासायनिक साधन के साथ vivo में विशिष्ट mRNAs के लिए बाध्य प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति देता है । जबकि हमने विभिन्न जीवों/कोशिकाओं से mRNA लक्ष्य के साथ विशेष RBPs की बातचीत को मान्य करने के लिए विधि का उपयोग किया है, यात्रा भी पाली के अन्य प्रकार के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है (एक) RNAs, जैसे cytoplasmic लंबे ncRNAs. इसके अलावा, सीमित प्रोटीन का व्यवस्थित विश्लेषण और/या RNAs एमएस या आरएनए अनुक्रमण के साथ प्रक्रिया की एक अप-स्केलिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इस संबंध में, हमारे प्रारंभिक डेटा इंगित करता है कि 1 खमीर संस्कृतियों के एल और मानव HEK293 कोशिकाओं के कम से १००,०००,००० पर्याप्त शुरू करने के लिए अच्छी तरह से व्यक्त mRNAs (अप्रकाशित परिणाम) के लिए विश्वसनीय एमएस डेटा प्राप्त सामग्री प्रदान कर सकता है ।
वर्णित यात्रा प्रोटोकॉल crosslink आरएनए-प्रोटीन बातचीत करने के लिए २५४ एनएम पर यूवी प्रकाश के साथ कोशिकाओं के विकिरण भी शामिल है । यह शुद्धि के दौरान कड़े धोने शर्तों के कार्यांवयन में सक्षम बनाता है । फिर भी, हालांकि स्पष्ट रूप से परीक्षण नहीं, हम ध्यान दें कि crosslinking वैकल्पिक है और सक्रिय RNPs शारीरिक बफ़र्स के साथ पुनर्प्राप्त किया जा सकता है चाहते हैं । हालांकि, इस मामले में, lysates में लक्ष्य आरएनए पर प्रोटीन और या RNAs की संभावित पुनः व्यवस्था को ध्यान में रखा जाना चाहिए । इसके विपरीत, यदि यूवी या अंय crosslinking प्रक्रियाओं (जैसे, formaldehyde) लागू कर रहे हैं, आरएनए की अखंडता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए के रूप में आरएनए गिरावट mRNPs की कम वसूली के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यूवी crosslinking बजाय अक्षम है (~ 5%) और भी कम प्रोटीन के लिए तो डबल असहाय आरएनए के साथ बातचीत, जो12RBPs के कुछ वर्गों का पता लगाने के लिए पूर्वाग्रह का परिचय सकता है । अंत में, यूवी विकिरण भी प्रोटीन प्रोटीन और प्रोटीन-डीएनए crosslinks कि डेटा व्याख्या४५,४६के लिए विचार किया जाना चाहिए प्रेरित कर सकते हैं । इसलिए, वैकल्पिक crosslinking प्रक्रियाओं, formaldehyde के साथ उदाहरण के लिए, भी विशेष रुचि के mRNAs पर बड़ा प्रोटीन असेंबलियों पर कब्जा हो सकता है ।
यात्रा की एक प्रमुख विशेषता है दो कदम ASO-आधारित शुद्धि प्रक्रिया विशेष RNAs को ठीक करने के लिए, जिससे selectivity बढ़ाने और सह-शुद्धि पदार्थों की संभाव्यता कम हो रही है । उदाहरण के लिए, एक चिंता biotinylated ASOs सीधे जोड़ने के लिए सेल निष्कर्षों है, जो सह करने के लिए नेतृत्व कर सकता से संबंधित है बायोटिन-बाध्यकारी प्रोटीन की शुद्धि । इस यात्रा में पाली के शुद्धिकरण के पहले दौर (क) RNAs covalently युग्मित oligo-(डीटी)25 चुंबकीय मोती है, जो आरएनए-प्रोटीन interactome कब्जा के लिए किया के रूप में कड़े शोधन शर्तों के लिए अनुमति देता है का उपयोग करके दरकिनार है । इसके अलावा, पाली (क) आरएनए चयन अत्यधिक प्रचुर ncRNAs को निकालता है, जैसे राइबोसोमल RNAs और tRNAs, और इसलिए क्रॉस-संकरण और संदूषण के लिए नमूना और संभावित स्रोतों की जटिलता को कम करता है । दूसरे चरण में, विशेष mRNAs biotinylated और संशोधित ASOs है कि mRNA लक्ष्यों पर क्षेत्रों के साथ ऐनी के साथ बरामद कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, संशोधित ASOs भी सीधे एक अमीन-linker के द्वारा चुंबकीय मोतियों से जुड़ी covalently सकता है, प्रवृत्ति को कम करने के लिए बायोटिन बाध्यकारी प्रोटीन पर कब्जा । हालांकि, हमारे अनुभव में, पाली की मशीन (एक) streptavidin मोतियों के अलावा से पहले ASOs के साथ आरएनए अंश ASO-युग्मित मोतियों के प्रत्यक्ष अलावा से अधिक कुशलता से mRNPs बरामद किया । संभवतः, मुक्त ओलिगोस्पर्मिया के रूप में मैटीरियल ओलिगोस्पर्मिया की तुलना में संरचित आरएनए में दृश्यों के लिए बेहतर पहुँच के साथ-साथ इष्ट हैं । इसलिए, ASOs के आबंध युग्मन नमूने के साथ मशीन से पहले मोतियों को आरएनए लक्ष्य की वसूली के लिए हानिकारक हो सकता है और empirically का परीक्षण किया जाना है ।
ASO आधारित विधियों के साथ एक खामी कुछ लक्ष्य mRNAs की अकुशल वसूली है । इसलिए हम कई ASOs के मूल्यांकन की सिफारिश है कि प्रतिलिपि के विभिंन क्षेत्रों के लिए ऐनी । विशेष रूप से, हम 2-3 ASOs के डिजाइन कि 3 ' में अनुक्रम के साथ ऐनी-UTR या ब्याज की mRNA की सीडी सुझाव है । प्रत्येक ASO संबंधित mRNA लक्ष्य की वसूली के लिए एक अलग दक्षता प्रदर्शन कर सकते हैं और empirically परीक्षण किया जाना चाहिए (चित्रा 2a, बी, डेटा नहीं दिखाया गया है). अंत में, हमने पाया है कि 3 ' UTRs के लिए ASOs एनीलिंग बेहतर लोगों को सीडी के लिए एनीलिंग की तुलना में प्रदर्शन किया । यह ribosomes अनुवाद के अभाव के कारण UTRs में बाध्यकारी साइटों की वृद्धि की पहुंच के कारण हो सकता है, जबकि ribosomes सीडी के भीतर कुशल संकरण बाधा हो सकता है । हम यह भी अनुभव है कि कई ASOs के संयोजन प्रचुर मात्रा में गैर लक्ष्य mRNAs और कम खींचने से संदूषण वृद्धि के लिए नेतृत्व कर सकता है दक्षता नीचे । किसी भी स्थिति में, चुने हुए ओलिगोस्पर्मिया के selectivity प्रतियोगिता प्रयोगों (जैसे, प्रतिस्पर्धा ओलिगोस्पर्मिया के अलावा) द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है ।
एक और चिंता असंबद्ध RNAs के साथ संभावित पार संकरण से संबंधित है, जैसा कि हमने देखा कि अंय mRNAs के साथ भी आंशिक संकरण कि mRNA (चित्रा 2c) की वसूली के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । डिजाइन ASOs की उपयुक्तता का मूल्यांकन करने के लिए, हम इसलिए में प्रारंभिक प्रदर्शन करने की सिफारिश कुल RNAs के साथ परीक्षण करने के लिए नमक सांद्रता और बफ़र्स की धुलाई तापमान का अनुकूलन । हमारे हाथों में, streptavidin की धुलाई-५५ ° c पर १५० mM NaCl युक्त बफ़र्स में चुंबकीय मोती युग्मित सबसे अच्छा प्रदर्शन किया, लेकिन हम प्रत्येक डिजाइन ASO के लिए शर्तों के स्वतंत्र परीक्षणों की सलाह देते हैं । उल्लेखनीय है, हमने पाया है कि सभी ASOs इन विट्रो प्रयोगों (चित्रा 2d) से चयनित crosslinked सेल निष्कर्षों (चित्रा 3) से संबंधित mRNA लक्ष्य पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त थे, आगे की वैधता substantiating में इन विट्रो भन्ने । mRNA कैप्चर के लिए उपयुक्त ASOs डिजाइन करने के अलावा, selectivity पर अतिरिक्त कारकों का प्रभाव पड़ सकता है । इसलिए, व्यापक BSA और/या मनका प्रकार विनिर्देशों के अनुसार tRNA के साथ प्रक्रियाओं को रोकने के मोती के लिए विशिष्ट बाध्यकारी रोक सकते हैं । आगे प्रोटीन की विशिष्ट अवशोषण को कम करने के लिए, हम भी लो-बांध ट्यूबों के उपयोग की सिफारिश, खासकर जब नमूनों की कम मात्रा के साथ काम कर रहे ।
आम तौर पर, यात्रा पहले से स्थापित दृष्टिकोण ASOs के साथ RNAs पर कब्जा पूरक कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, गैर कोडिंग आरएनए Xist लंबे (९०-मेर) biotinylated डीएनए oligonucleotides कि पूरे प्रतिलिपि कवर की एक सरणी का उपयोग करके 200-800 मिलियन यूवी crosslinked कोशिकाओं से व्युत्पंन परमाणु निष्कर्षों से बाध्य प्रोटीन के साथ अलग किया गया था ३४,३५. हालांकि, चुना टाइलिंग दृष्टिकोण पार के लिए महान क्षमता के प्रकाश में समस्याग्रस्त हो सकता है संकरण असंबंधित RNAs के साथ, और यह विशिष्ट प्रतिलिपि, उदाहरणके लिए, वैकल्पिक रूप से ब्याह रूपों का चयन नहीं किया जा सकता है । हाल ही में, विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड बंद डिजाइन (LNA) या डीएनए ASO mixmers एक चुंबकीय राल से जुड़ी covalently थे इन विट्रो प्रतिलिपि में ठीक या उच्च कोशिका से राइबोसोमल RNAs व्यक्त मुक्त निष्कर्षों; हालांकि, यह की वसूली के लिए परीक्षण नहीं किया गया vivo में गठित mRNA-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स३६. RBPs और ncRNA द्वारा पोस्ट-transcriptional जीन नियंत्रण की वृद्धि हुई मांयता के प्रकाश में, हमें विश्वास है कि यात्रा एक उपयोगी तरीका है और intracellular और पर्यावरण cues और इसके प्रभाव पर कोशिकाओं के भीतर RNP परिसरों की गतिशीलता की जांच करने के लिए है स्वास्थ्य और रोग में ।

पोस्ट-transcriptional जीन विनियमन आरएनए-बंधन प्रोटीन (RBPs), गैर कोडिंग RNAs (ncRNAs) और mRNAs, जो प्रसंस्करण, स्थानीयकरण, अनुवाद और कोशिकाओं के भीतर हर प्रतिलिपि के क्षय प्रत्यक्ष के बीच बातचीत के माध्यम से संचालित है1 , 2. RBPs और ncRNA की पहचान विशेष mRNAs के साथ बातचीत, जो ribonucleoprotein परिसरों/कणों (RNPs) के रूप में जाना जाता है की स्थापना, इसलिए mRNAs और जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के भाग्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । पूरक दृष्टिकोण RNP परिसरों3,4के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए किए गए हैं: जबकि "प्रोटीन केंद्रित दृष्टिकोण" विशिष्ट RBPs की शुद्धि पर आधारित है, "आरएनए-केंद्रित" दृष्टिकोण शामिल है उपजनसंख् या व् यक्तिगत RNAs का अलगाव और उसके बाद के विश्लेषण में प्रोटीन या RNAs का आदान-प्रदान । हाल ही में, RBP प्रदर्शनों की पहचान के लिए एक आरएनए-केंद्रित दृष्टिकोण polyadenylated (पाली (ए)) के साथ बातचीत करने की RNAs5 एक पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश crosslinking कदम को शामिल करके तेजी से लोकप्रिय हो गया है प्रोटीन-आरएनए को स्थिर करने के लिए बातचीत mRNAs, जो नाटकीय रूप से मानव कोशिकाओं6,7,8,9,10,11में RBPs की सूची विस्तारित के अलगाव से पहले, Caenorhabditis एलिगेंस 12, Saccharomyces cerevisiae12,13,14, व अन्य जीव15,16,17,18, 19,20. हालांकि, प्रोटीन और/या विशेष टेप पर इकट्ठे ncRNAs की मानचित्रण अभी भी एक बड़ी चुनौती है । इस अंत करने के लिए, दो मुख्य दृष्टिकोण वर्तमान में इस्तेमाल कर रहे हैं: एक तरफ, आरएनए aptamer टैग संबंध शुद्धिकरण सक्षम करने के लिए ब्याज की आरएनए के लिए जुड़े हुए हैं. इस प्रकार, आरएनए aptamers tobramycin और streptomycin21,22,23,24, या प्रोटीन के लिए सहित aminoglycoside एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उच्च समानता के साथ बांध, इस तरह के कोट प्रोटीन के रूप में R17/MS2 भोजी या बैक्टीरियल streptavidin एस25,26,27,28,29से । हालांकि इस दृष्टिकोण को अपेक्षाकृत मजबूत और बहुमुखी दिखाया गया था, यह जांच के तहत आरएनए डिजाइन क्लोनिंग की आवश्यकता है, और इस तरह प्राकृतिक mRNAs पर कब्जा नहीं किया जा सकता है । दूसरी ओर, antisense oligonucleotides (ASOs) पर वसूली और अत्यधिक व्यक्त की देशी RNPs30,31 और वायरल RNAs३२के लक्षण वर्णन के लिए जल्दी पर इस्तेमाल किया गया । हाल ही में, ASOs लंबे समय गैर कोडिंग RNAs३३,३४,३५ पर कब्जा करने के लिए लागू किया गया और इन विट्रो में mRNPs३६का गठन । सभी आरएनए केंद्रित दृष्टिकोण के साथ एक प्रमुख सीमित कारक ब्याज की आरएनए की कॉपी संख्या है, कम व्यक्त mRNAs अधिक समस्याग्रस्त की वसूली कर रही है. इस सीमा की प्रतिक्रिया को बढ़ाने से दूर किया जा सकता है; हालांकि, यह संभवतः पृष्ठभूमि बढ़ाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
साथ ही, हम वर्णन हमारे हाल ही में विकसित ASO आधारित आरएनए अलगाव प्रक्रिया (ट्रिप) उच्च selectivity३७ (चित्रा 1) के साथ देशी mRNA-प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए। प्रोटोकॉल दो अनुक्रमिक ASO आधारित शुद्धि कदम, अर्थात् पाली के अलगाव (एक) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध oligo (डीटी) के साथ mRNAs विशेष रूप से डिजाइन लघु biotinylated 2 ' का उपयोग कर विशिष्ट mRNAs पर कब्जा करने के बाद मोती युग्मित शामिल है '-methoxy आरएनए ASOs. यह दो कदम प्रक्रिया दूषित प्रोटीन को नष्ट करने में मदद करता है और समायोजन और अनुकूलन के लिए अवसर जोड़ता है । इस उदाहरण में, यात्रा खमीर, सूत्रकृमि, और मानव कोशिकाओं से चयनित mRNAs पर लागू किया गया vivo में पुष्टि mRNA-प्रोटीन परिसरों का गठन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE5000-8CE</td>
			<td>Floor shaker to grow yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBD 6220</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator to grow human cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Soniprep150</td>
			<td>MSE</td>
			<td>MSS150.CX4.5</td>
			<td>Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td>Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>RETSCH MM200</td>
			<td>Device to mechanically disrupt yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge to spin down cells, lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator, Thriller</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Thermoshaker for 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads 0.5mm</td>
			<td>Stratech Scientific Limited</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Lysis of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter, 0.41 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NY4104700</td>
			<td>Collection of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HA Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHA02510</td>
			<td>Filter to clear nematode lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22431081</td>
			<td>Minimise protein loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microfuge tube</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12425</td>
			<td>Yeast extract preparation and other applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>129A</td>
			<td>Collection of HEK293 cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>Collection C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Collection yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966</td>
			<td>Media for culturing HEK293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Used to supplement cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>DNAse I to degrade DNA from cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td>RNase inhibitor to avoid RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Oligo (dT)25</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61011</td>
			<td>Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td>Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109550001</td>
			<td>transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td>To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Act1</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>869100</td>
			<td>Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Act1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td>Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-HuR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5261</td>
			<td>Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti&#8211;CYC-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>456100</td>
			<td>Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase anti-peroxidase soluble complex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1291</td>
			<td>Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NXA931</td>
			<td>HRP-coupled secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an oligonucleotide-based tandem rna isolation procedure to recover eukaryotic mrna-protein complexes

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स (RBPs) जीन एक्सप्रेशन के पोस्ट-transcriptional कंट्रोल में प्रमुख भूमिकाएं निभाते हैं । इसलिए, mRNA-प्रोटीन परिसरों के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन प्रोटीन या गैर कोडिंग RNAs बातचीत द्वारा mRNA नियमन को समझने के लिए आवश्यक है । साथ ही, हम एक मिलकर आरएनए अलगाव प्रक्रिया (यात्रा) है कि सेलुलर निष्कर्षों से endogenously गठन mRNA-प्रोटीन परिसरों की शुद्धि सक्षम बनाता है का वर्णन । दो कदम प्रोटोकॉल antisense oligo (डीटी) मोतियों के साथ polyadenylated mRNAs के अलगाव और 3 '-mRNA 2 ' के साथ ब्याज की एक biotinylated के बाद कब्जा शामिल है-O-methylated antisense आरएनए oligonucleotides, जो तब के साथ अलग किया जा सकता है streptavidin मोतियों की माला । यात्रा आगे आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) खमीर, सूत्रकृमि और मानव कोशिकाओं से परिसरों में ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस प्रकार, यात्रा एक बहुमुखी दृष्टिकोण है कि जीवों के पार polyadenylated RNAs के सभी प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है intracellular या पर्यावरण cues द्वारा लगाया mRNPs की गतिशील पुनः व्यवस्था का अध्ययन ।

Watch this Scientific Journal Video about An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes at JoVE.com

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

एक Oligonucleotide आधारित मिलकर आरएनए अलगाव प्रक्रिया Eukaryotic mRNA-प्रोटीन परिसरों को पुनर्प्राप्त करने के लिए

endogenously गठित mRNA-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की वसूली के लिए एक मिलकर आरएनए अलगाव प्रक्रिया (ट्रिप) का वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, आरएनए-प्रोटीन कॉंप्लेक्स vivo मेंcrosslinked हैं, polyadenylated RNAs oligo (डीटी) मोतियों के साथ अर्क से अलग कर रहे हैं, और विशेष रूप से mRNAs संशोधित आरएनए antisense oligonucleotides के साथ कब्जा कर रहे हैं । mRNAs से बंधे प्रोटीन immunoblot विश्लेषण द्वारा पाए जाते हैं ।

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

गैर-कोडिंग लघु शाही सेना मात्रा के लिए उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन का अलगाव

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

लेजर Microdissection शाही सेना seq के लिए प्रायोगिक डिजाइन: मक्का पत्तियों के विकास के एक विश्लेषण से सबक

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

मात्रात्मक Transcriptome विश्लेषण में उपयोग के लिए बीज से उच्च शुद्ध शाही सेना के अलगाव के लिए एक कारगर तरीका

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

प्रोटीन-आरएनए परिसरों की बढ़ी हुई जांच के लिए क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

बायोटिन से जुड़ी आरएनए का उपयोग करके Macromolecular परिसरों का एकल-चरण शुद्धिकरण और एक फोटो-सट linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

अभिव्यक्ति, घुलनबिलीकरण, और यूकार्योटिक बोरेट ट्रांसपोर्टरों की शुद्धि

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

वीवो में एंडोथेलियल सेल से आरएनए अलगाव के लिए रिबोसोम एफ़िनिटी शुद्धि (टीआरईआरई) का अनुवाद

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

अनुवाद विनियमन में आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...