Name: an oligonucleotide-based tandem rna isolation procedure to recover eukaryotic mrna-protein complexes
Uploaded: 2018-08-18T15:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes at JoVE.com

Мы благодарны д-р Джонатан холл и Мауро Циммерман (ETH Zurich) для синтеза PFK2 и ВИС-1 ASOs, доктор Maikel Ваутерс для проектирования p27/CDKN1B ASOs и доктор Рафал Ciosk (Фридрихом Мишером институт биомедицинских исследований, Базель) для антител анти GLD-1. Эта работа была поддержана биотехнологии и биологических наук научно-исследовательский совет (BB/K009303/1) и Королевского общества Вольфсон исследований заслуги (WM170036) для A.P.G.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Путешествие позволяет анализ белков, привязан к конкретные мРНК в vivo с биохимическими средствами. Хотя мы использовали этот метод для проверки взаимодействия конкретной ОДП с мРНК-мишеней, из разных организмов/клетки, поездки также может быть применимым для изучения других видов poly(A) РНК, например цитоплазматических длинные ncRNAs. Кроме того систематический анализ связанных белков и/или РНК с MS или РНК последовательности может быть достигнуто путем масштабирования вверх процедуры. В этой связи наши предварительные данные показывает, что 1 Л дрожжевых культур и по меньшей мере 100 миллионов клеток человека HEK293 может обеспечить достаточную исходным материалом для получения надежных данных MS для хорошо выраженной mRNAs (неопубликованные результаты).
Описано путешествие протокол включает облучения клеток с УФ света в 254 Нм до crosslink РНК белковых взаимодействий. Это позволяет осуществление строгих мыть условий во время очистки. Тем не менее хотя явно не проверял, мы хотим отметить что сшивки является необязательным и активного RNPs также могут быть взысканы с физиологической буферов. Однако в этом случае, потенциал переоборудование белков и РНК на целевом РНК в лизатов должны приниматься во внимание. И наоборот если УФ или других процедур сшивки прикладной (например, формальдегид), целостность РНК должно оцениваться как РНК деградация может привести к снижению восстановления mRNPs. Кроме того УФ сшивки является довольно неэффективной (~ 5%), и даже меньше, так для белков, взаимодействующих с двуцепочечной РНК, которая могла бы ввести смещения для обнаружения определенных классов ОДП12. Наконец УФ-облучение также может вызвать протеин протеина и протеин дна сшивки, которые должны быть рассмотрены для интерпретации данных45,46. Таким образом процедуры альтернативной сшивки, например с формальдегидом, также может быть особый интерес захватить больше белка сборок на мРНК.
Одной из ключевых особенностей поездки является двухэтапную процедуру очищения, на основе Асо восстановить особое РНК, тем самым увеличивая избирательности и уменьшается вероятность совместного очистки загрязняющих веществ. Например одна озабоченность касается добавления биотинилированным ASOs непосредственно в клеточных экстрактов, которые могут привести к совместно очистки биотин связывающих белков. Это обойти в ПОЕЗДКЕ путем реализации первый раунд очистки poly(A) РНК с помощью ковалентно спаренных oligo-(dT)25 магнитные бусы, который позволяет для очистки жестких условий, как это сделано для захвата interactome РНК белок. Кроме того выбор РНК poly(A) удаляет очень обильные ncRNAs, таких как рибосомная РНК и tRNAs и таким образом уменьшает сложность образца и потенциальных источников загрязнения и крест гибридизации. На втором этапе особенно mRNAs восстанавливаются с биотинилированным и изменение ASOs, которые отжига с регионами на мРНК-мишеней. Кроме того изменение ASOs может быть непосредственно ковалентно придает также магнитные шарики через Амин компоновщик, уменьшение склонности к захватить биотина связывания белков. Однако наш опыт показывает, инкубационный poly(A) РНК дробью ASOs перед добавлением бисера стрептавидина восстановлены mRNPs более эффективно, чем прямое добавление Асо сочетании бисера. Возможно свободный oligos кинетически благоприятствования лучший доступ к последовательности в структурированных РНК по сравнению с иммобилизованными oligos. Следовательно ковалентного соединения ASOs бисером до инкубации с образцом может быть пагубным для восстановления целевого РНК и должен быть проверены эмпирически.
Один недостаток с методами на основе Асо является неэффективным восстановление некоторых целевых мРНК. Поэтому мы рекомендуем оценки нескольких ASOs, которые отжига различных регионов стенограммы. В частности мы предлагаем дизайн ASOs 2-3, которые отжига с последовательностями в 3'-UTR или компакт-диски mRNA интереса. Каждый Асо могут демонстрировать различные эффективности для восстановления соответствующих целевых мРНК и должно быть эпирически испытания (Рисунок 2а, Б, данные не показаны). В конце мы обнаружили, что ASOs отжига для необычных 3' выполняются лучше по сравнению с теми, отжиг на компакт-диски. Это может быть из-за увеличения доступности привязки сайтов в необычных из-за отсутствия перевода рибосомы, тогда как рибосомы может препятствовать эффективной гибридизации в компакт-дисков. Мы также пережили, что сочетание нескольких ASOs может привести к увеличению загрязнения от обильные непромысловых мРНК и снизить эффективность тянуть вниз. В любом случае, избирательность выбранной oligos могут контролироваться конкурс экспериментов (например., добавлением конкурирующих oligos).
Еще озабоченность касается потенциальных крест гибридизации с несвязанными РНК, как мы наблюдали, что даже частичное гибридизации с другими мРНК может привести к восстановления этого мРНК (рис. 2 c). Для оценки пригодности разработанных ASOs, поэтому рекомендуется выполнять первоначальные в vitro тестирования с общей РНК для оптимизации соли концентрации и температуры стирки буферов. В наших руках Стиральная стрептавидина в сочетании магнитных шариков в буферы, содержащие 150 мм NaCl при 55 ° C выполняется лучше, но мы рекомендуем независимые тесты условий для каждого разработан Асо. Примечательно, мы обнаружили, что все ASOs, отобранных из экспериментов в пробирке (Рисунок 2D) были соотвествующими для захвата соответствующей целевой мРНК из сшитого клеточных экстрактов (рис. 3), далее подтверждающей действительность в in vitro тестирования. Помимо разработки подходящих ASOs для захвата мРНК, дополнительные факторы могут повлиять на избирательности. Таким образом всеобъемлющий блокировки процедуры с BSA и/или tRNA согласно спецификации типа шарик может предотвратить неспецифических привязки к бисеру. Чтобы дополнительно уменьшить поглощение неспецифических белков, также рекомендуется использовать Lo свяжите трубок, особенно при работе с низким количеством образцов.
Как правило путешествие может дополнять ранее разработанных подходов для захвата РНК с ASOs. Например, РНК-кодирования Xist был изолирован с привязанного белки от ядерных экстракты, полученные из 200-800 миллионов УФ высокоструктурированные клеток с помощью массива долго олигонуклеотиды ДНК (90-mer) биотинилированным, которые охватывают весь Стенограмма 34,35. Однако, выбранной плитки подход может стать проблематичным с учетом большой потенциал для крест гибридизации с несвязанными РНК, и он не может использоваться для выбора конкретных стенограмма, например., альтернативно сращивания формы. Недавно, специально заблокирован нуклеиновой кислоты (LNA) или mixmers ДНК Асо ковалентно были прикреплены к магнитной смолы для восстановления в vitro транскрипт или сильно выраженным рибосомной РНК из экстрактов клетки бесплатно; Однако он не был протестирован для восстановления в vivo сформировали мРНК белковых комплексов36. Учитывая растущее признание post-transcriptional гена контроля за ОДП и ncRNA мы считаем, что поездка является полезным методом для изучения состава и динамики RNP комплексов в ячейках на внутриклеточную и экологические сигналы и его влияние в здоровье и болезни.

Регулирование POST-transcriptional гена управляется через взаимодействия RNA-связывая протеинов (ОДП), некодирующих РНК (ncRNAs) и мРНК, который прямой обработки, локализация, перевод и распад каждый Стенограмма внутри клетки1 , 2. выявление ОДП и ncRNA взаимодействия с конкретной мРНК, установления, что известно как рибонуклеопротеида комплексы/частиц (RNPs), поэтому является ключом к пониманию судьбы мРНК и ген выражение элемента управления. Взаимодополняющие подходы осуществляются для биохимических характеристик RNP комплексов3,4: в то время как «белка ориентированных» подход основан на очищения конкретных ОДП, «РНК ориентированных» подход предполагает изоляция субпопуляций или отдельных молекул РНК и последующего анализа взаимодействия белков и РНК. Недавно, РНК ориентированный подход для выявления ОДП репертуар, взаимодействующих с polyadenylated (poly(A)) РНК5 становится все более популярным, включив ультрафиолетового (УФ) света сшивки шаг для стабилизации белка РНК взаимодействие предварительного изоляции мРНК, который значительно расширенный каталог ОДП в клетки человека6,,78,9,10,11, Caenorhabditis elegans 12, saccharomyces cerevisiae12,13,14и другие организмы15,16,17,18, 19,20. Однако картирования белков и/или ncRNAs, собрал на конкретных протоколов по-прежнему большой проблемой. С этой целью в настоящее время используются два основных подхода: с одной стороны, РНК aptamer Теги сплавлены к РНК интерес для включения очищение сродства. Таким образом аптамеры РНК связываются с высоким сродством аминогликозидами антибиотики, включая тобрамицина и стрептомицина21,,2223,24, или белков, таких как протеин пальто из R17/MS2 бактериофага или бактериальной стрептавидина S125,26,27,,2829. Хотя этот подход был показан относительно надежный и универсальный, он требует клонирование дизайна РНК под следствием и таким образом не может использоваться для захвата природных мРНК. С другой стороны для восстановления на раннем этапе использовались антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) и характеристика высоко выразил родной RNPs30,31 и вирусной РНК32. Совсем недавно ASOs были применены для захвата долго не кодирования RNAs33,34,-35 и в пробирке образовали mRNPs36. Один из основных факторов, препятствующих с все РНК ориентированных подходов — это копия количество РНК интерес, делая восстановлению низкого выразил mRNAs более проблематичным. Это ограничение можно преодолеть путем масштабирования реакции; Однако это потенциально может привести к увеличению на фоне.
Здесь мы описываем наш недавно разработанных на основе Асо тандем процедуры изоляции РНК (поездка) изолировать родной мРНК белковых комплексов с высокой селективностью37 (рис. 1). Протокол включает два последовательных очистки на основе Асо шаги, а именно изоляции poly(A) мРНК с коммерчески доступных oligo(dT) сочетании бусы, следуют захвата конкретные мРНК, используя специально разработанные короткие биотинилированным 2'-метокси ASOs РНК. Эта двухэтапная процедура помогает, устраняя загрязняясь протеины и добавляет возможности для перестройки и оптимизации. В этом случае поездка была применена на выбранных мРНК из дрожжей, нематоды, и человеческие клетки для подтверждения в естественных условиях образуется мРНК белковых комплексов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE5000-8CE</td>
			<td>Floor shaker to grow yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBD 6220</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CO2 incubator to grow human cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Soniprep150</td>
			<td>MSE</td>
			<td>MSS150.CX4.5</td>
			<td>Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td></td>
			<td>Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>RETSCH MM200</td>
			<td>Device to mechanically disrupt yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge to spin down cells, lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator, Thriller</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td></td>
			<td>Thermoshaker for 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads 0.5mm</td>
			<td>Stratech Scientific Limited</td>
			<td>11079105</td>
			<td>Lysis of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter, 0.41 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NY4104700</td>
			<td>Collection of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HA Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLHA02510</td>
			<td>Filter to clear nematode lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22431081</td>
			<td>Minimise protein loss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microfuge tube</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM12425</td>
			<td>Yeast extract preparation and other applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>129A</td>
			<td>Collection of HEK293 cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td>Collection C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL plastic tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Collection yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966</td>
			<td>Media for culturing HEK293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Used to supplement cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>DNAse I to degrade DNA from cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td>RNase inhibitor to avoid RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Oligo (dT)25</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61011</td>
			<td>Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td>Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109550001</td>
			<td>transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td>To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Act1</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>869100</td>
			<td>Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Act1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1978</td>
			<td>Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-HuR</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5261</td>
			<td>Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti&#8211;CYC-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>456100</td>
			<td>Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase anti-peroxidase soluble complex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1291</td>
			<td>Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NXA931</td>
			<td>HRP-coupled secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an oligonucleotide-based tandem rna isolation procedure to recover eukaryotic mrna-protein complexes

RNA-связывая протеинов (ОДП) играют ключевую роль в элементе post-transcriptional экспрессии генов. Таким образом биохимическая характеристика мРНК белковых комплексов имеет важное значение для понимания регулирования мРНК, выводимый платформой взаимодействия белков или RNAs-кодирования. Здесь мы описываем процедура изоляции тандем РНК (поездки), которая позволяет очистки эндогенно сформированных мРНК белковых комплексов из клеточных экстрактов. Двухэтапный протокол включает изоляции polyadenylated мРНК с бисером антисмысловых oligo(dT) и последующего захвата мРНК интерес с 3'-биотинилированным 2'-O-метилированную Антисмысловые РНК олигонуклеотиды, которые затем могут быть изолированы с стрептавидина бисер. Поездка была использована для восстановления в vivo высокоструктурированные мРНК рибонуклеопротеида (mRNP) комплексы из дрожжей, нематод и человеческих клеток для дальнейшего анализа РНК и белка. Таким образом поездка является универсальный подход, который может быть адаптирован для всех видов polyadenylated РНК различных организмов для изучения динамических переоборудование mRNPs, введенных внутриклеточных или экологические сигналы.

Watch this Scientific Journal Video about An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes at JoVE.com

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

Процедура изоляции на основе олигонуклеотида тандем РНК для восстановления эукариотические мРНК белковых комплексов

Описывается процедура изоляции тандем РНК (поездка) для восстановления эндогенно сформированных мРНК белковых комплексов. Конкретно комплексы РНК белок, сшитыми в естественных условиях, polyadenylated РНК, изолированы от выдержки с oligo(dT) бусы, и частности mRNAs фиксируются с модифицированных олигонуклеотидов Антисмысловые РНК. Белки, привязан к мРНК распознаются immunoblot анализа.

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Выделение липопротеидов высокой плотности для Некодирующих малых РНК квантификации

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Экспериментальный дизайн для лазерных микродиссекция РНК-Seq: уроки из анализа развития листьев кукурузы

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...