Name: dissipative microgravimetry to study the binding dynamics of the phospholipid binding protein annexin a2 to solid-supported lipid bilayers using a quartz resonator
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Reso

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft under grants SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 og SFB 1348/A11.

Bemærk: Buffere skal være filtreret ved hjælp af et 0,22 µm filter og afgasses af et tomrum i 1 time.
1. lipid vesikel forberedelse
<ol><li>Bruge 2-mL glasrør. Opløse hver lipid, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (pop) og kolesterol (Chol), i en blanding af kloroform / methanol (50/50 v/v) til at udarbejde en klar 5 mM lipid løsning. Opløs 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4,5) P2) i en blanding af kloroform/methanol/vand (20:9:1 v/v).</li>
	<li>Kombiner de opløste lipider i den ønskede molære forhold på POPC/dukker (80/20), POPC/PI (4,5) P2 (95/5), POPC/pop/Chol (60/20/20), POPC/pop/PI (4,5) P2/Chol (60/17/3/20) og POPC/DOPC/pop/PI (4,5) P2/Chol (37/20/20/3/20) () Tabel 1) i 10 mL glasrør. NOTE: Den endelige mængden af samlede lipid er 500 µg.</li>
	<li>Fordampe de organiske opløsningsmidler ved hjælp af en tør strøm af kvælstof. Forlade lipid blandingen på et højt vakuum (ingot) system til 3 h til at fjerne enhver resterende spor af opløsningsmidler. Bemærk: Dette resulterer i en tør klar film.</li>
	<li>Resuspend lipid film i 1 mL af citratbuffer (10 mM-Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6). Inkuber lipid suspension ved 60 ° C (denne temperatur er omkring 10 ° C over den fase overgang temperatur af det højeste smeltepunkt lipid i blandingen) i 30 minutter i et vandbad og vortex det kraftigt hvert 5 min. Bemærk: Dette resulterer i dannelsen af store, multilamellar blærer (MLVs). Holde suspension over overgangen temperatur.</li>
	<li>Forvarm ekstruder (ved 60 ° C i dette tilfælde) udstyret med en 50-nm diameter pore-størrelse polycarbonat membran over den overgang temperatur (som er 40-50 ° C her) i 30 min.</li>
	<li>Indlæse MLV suspension i forvarmet ekstruder og forsigtigt passere blanding 31 x gennem polycarbonat membran til at danne små unilamellar vesikler (SUV)14. Holde temperaturen over overgangen temperatur.</li>
	<li>Overføre SUV suspension til en 2 mL plastik reaktion fartøj og tilføje citratbuffer (Se trin 1.4) til at bringe de endelige mængden til 2 mL. Bemærk: Dette vil give en afsluttende lipid koncentration af 250 µg/mL.</li>
</ol>2. håndtering af kvarts sensorer
Bemærk: Altid håndtere kvarts sensorer med en pincet.
<ol><li>Inkuber fire sensorer indsat i en polytetrafluorethylen indehaver i en 2% SDS løsning for ≥ 30 min. vask dem grundigt med ultra rent vand til helt at fjerne SDS og lad dem tørre ved hjælp af en strøm af tørre argon eller nitrogen.</li>
	<li>Bruge en plasma-rengøring system til helt for at fjerne alle forurenende stoffer. Indsæt de tørre sensorer i salen, plasma-rengøring, evakuere kammeret og skylle det 3 x med ilt. Drej plasmaet renere på. Brug de følgende parametre: 1 x 10-4 Torr pres, høj radio frekvens (RF) magt og 10 min af procestid. Sluk maskinen og tage ud sensorerne.</li>
</ol>3. microbalance drift
Bemærk: Et microbalance system med fire temperaturregulerede flow kamre i en parallel konfiguration, forbundet til en peristaltisk pumpe og indstillet til en gennemstrømningshastighed på 80 µL/min, blev brugt. I tilstanden åben flow var bufferen pumpet fra feeder reservoiret ind i den modtagende tank. I loop mode, var den modtagende tank forbundet med feeder reservoir til at generere et lukket kredsløb. Temperaturen var indstillet til 20 ° C.
<ol><li>Omhyggeligt dock plasma-rengjort sensorer i 4 flow kamre, ved hjælp af pincet. Undgå pres på eller torsion af afdelingerne og rør, der kan forårsage utæt.</li>
	<li>Skylle systemet med citratbuffer (10 mM-Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6) i open-flow-tilstand i 10 min. Bemærk: Dette kræver præcis 3,2 mL buffer, men det er tilrådeligt at bruge et overskud af buffer (10 mL).</li>
	<li>Starte programmet. Starte optagelsen eventuelle ændringer i hyppigheden og spredning af den første grundtone (n = 1.) og overtoner (n = 3-13) ved hjælp af software, indtil frekvensen og varmeafledning basislinjer er stabil (dette vil tage omkring 40-60 min). Bemærk: Frekvens støj (spids til spids) bør være lavere end 0,5 Hz og for varmeafledning, lavere end 0.1·10-6, med en maksimal drift (i vandig opløsning) på 1 Hz/h i frekvens og 0.3·10-6h i varmeafledning.</li>
	<li>Når de oprindelige planer er stabil, anvende SUV suspension i citratbuffer (2 mL i et lille rør). Ved hjælp af en reaktion fartøj, fjerne 1,5 mL af den dødvolumen. Luk systemet i loop-flow-tilstand. Post frekvens/varmeafledning skift i yderligere 10 minutter. Bemærk: I løbet af denne tid, blærer vil spredes på SiO2 overflade og lunte til at danne en kontinuerlig tolagede15,16 (trin 2 i figur 1, figur 2og figur 3). SUV'er adsorption på overfladen af sensoren er to-phasic og har en typisk frekvens minimum- og maksimumværdierne i for stort ressourcespild. En stabil ny frekvens/varmeafledning baseline med en karakteristisk frekvens Skift (afhængigt af lipid sammensætning) fra 26-29 Hz viser (Se tabel 1) en kontinuerlig tolagede på overfladen.</li>
	<li>Når SLB er stabil (Se trin 3.4), reagensglasset system med den kører buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) i de krævede Ca2 + koncentrationer (lige fra 50 µM op til 1 mM CaCl2, afhængigt af eksperimentet) i en åben flow tilstand for 40 min.</li>
	<li>Tilføje protein (her, AnxA2) til at køre buffer indeholdende Ca2 + (Se trin 3.5). Udføre udligningen af protein i et loop-flow tilstand, indtil en ligevægt steady state er nået (trin 3 i figur 1, figur 2og figur 3). Bemærk: Proteinkoncentration kan variere fra 1 til 400 nM. Protein adsorption resulterer i en koncentration-afhængige frekvens Skift afspejler masse (protein) adsorption.</li>
	<li>Adskille de bundne protein af chelaterende Ca2 + ioner med 5 mM EGTA i den kørende buffer i åben flow tilstand (trin 4 i figur 1 og figur 2). Bemærk: En genopretning af frekvens og spredning til SLB baseline angiver en total reversibilitet af protein binding. Association-dissociation cyklusser kan gentages for at sammenligne forskellige koncentrationer eller proteiner.</li>
</ol>4. microbalance rengøring
Bemærk: Udføre en minimal rengøring procedure efter hver måling.
<ol><li>Regenerere microbalance systemet med 50 mL af Hedeselskabet2O i en kontinuerlig åben flow tilstand, fjerne rør fra vandbeholderen, og lade systemet køre tør.</li>
	<li>Forsigtigt fjerne krystal sensor og rense det med 2% SDS løsning ved hjælp af indehaveren af polytetrafluorethylen (Se trin 2.1).</li>
	<li>Tør de synlige dele af kraterets flow modul hvor sensoren blev placeret. Bemærk: Udføre en intensiv rengøring procedure efter en serie på 10 målinger.</li>
	<li>Ren ordningen med en 2% SDS løsning (50 mL) ved 40 ° C (setup i software) i en kontinuerlig åben flow (tube) funktion ved hjælp af en flow-hastighed på 20 µL/min for udvidet kontakt med vaskemiddel.</li>
	<li>Ren med 250 mL af Hedeselskabet2O i kontinuerlig åben flow tilstand med en væskehastighed på 160 µL/min. Bemærk: Efter 4 måneder, foretage en omfattende rengøring procedure efter producentens manual.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).</li><li>Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexins:+linking+Ca2++signalling+to+membrane+dynamics.">Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).</li><li>Mim, C., Unger, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+and+its+generation+by+BAR+proteins.">Membrane curvature and its generation by BAR proteins.</a> Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).</li><li>Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+2+is+a+phosphatidylinositol+(4,5)-bisphosphate+binding+protein+recruited+to+actin+assembly+sites+at+cellular+membranes.">Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes.</a> Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).</li><li>Gerke, V., Moss, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexins:+from+structure+to+function.">Annexins: from structure to function.</a> Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).</li><li>Heitzig, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+promotes+demand-driven+recruitment+of+AnxA8+to+cholesterol-containing+membranes.">Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).</li><li>Dr&#252;cker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+characterization+of+supported+lipid+bilayers+containing+phosphatidylinositol-4,5-biphosphate+and+cholesterol+as+functional+surfaces.">Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces.</a> Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).</li><li>McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+membranes+in+studies+of+cell-cell+recognition+in+the+immune+system.">Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).</li><li>Anderson, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+bilayers+on+silica+substrates.">Formation of supported bilayers on silica substrates.</a> Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).</li><li>Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+adsorption+and+phospholipid+bilayer+formation+on+topographically+and+chemically+nanostructured+surfaces.">Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces.</a> Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).</li><li>Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms:+a+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide.">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li><li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+formation+of+lipid+bilayer+coatings+on+bare+aluminium+oxide:+overcoming+the+force+of+interfacial+water.">Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li><li>Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+liposomes+of+defined+size+distribution+by+extrusion+through+polycarbonate+membranes.">Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).</li><li>Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+lipid+vesicle+deposition+on+solid+surfaces:+a+combined+QCM-D+and+AFM+study.">Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study.</a> Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).</li><li>Richter, R. P., B&#233;rat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers:+an+integrated+view.">Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li><li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verwendung+von+Schwingquarzen+zur+W&#228;gung+d&#252;nner+Schichten+und+zur+Mikrow&#228;gung.">Verwendung von Schwingquarzen zur W&#228;gung d&#252;nner Schichten und zur Mikrow&#228;gung.</a> Zeitschrift f&#252;r Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).</li><li>Rodahl, M., H&#246;&#246;k, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance+setup+for+frequency+and+Q-factor+measurements+in+gaseous+and+liquid+environments.">Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).</li><li>Dr&#252;cker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+of+annexin+A2+to+cholesterol-and+phosphatidylinositol-4,+5-bisphosphate-containing+bilayers.">Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=External+push+and+internal+pull+forces+recruit+curvature-sensing+N-BAR+domain+proteins+to+the+plasma+membrane.">External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane.</a> Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li><li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+the+cell+cortex:+the+role+of+ERM+proteins.">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).</li><li>Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+membranes+doped+with+PIP2:+influence+of+ionic+strength+and+pH+on+bilayer+formation+and+membrane+organization.">Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization.</a> Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).</li><li>Bianco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance+as+cell-based+biosensor+to+detect+and+study+cytoskeletal+alterations+and+dynamics.">Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics.</a> Biotechnology Journal. , 1700699 (2018).</li><li>Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance:+Sensing+cell-substrate+adhesion+and+beyond.">Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).</li><li>Bragazzi, N. L., et al., Donev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Crystal+Microbalance+(QCM)+for+Public+Health:+An+Overview+of+Its+Applications.">Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications.</a> Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 101, 149-211 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

For at besvare spørgsmål vedrørende struktur-funktion relationer af cellulære membraner både i en kvantitativ og kvalitativ måde, celle biologi overskud umådeligt fra brugen af biofysiske metoder baseret på veletablerede og udbredte teknikker , herunder atomic force mikroskopi (AFM), overflade plasmon resonans (SPR), og QCM-D teknik ansat her. Vi viste i tidligere undersøgelser, der annexin proteiner binder i en Ca2 +-afhængige måde til det immobiliserede membran med høj affinitet. Vi bruger frekvens og varmeafledning forskydninger af 7th overtone (Δf7), fordi det repræsenterer det bedste kompromis af påvisning følsomhed og oscillation stabiliteten.
Denne teknik også tillader en kvantitativ beskrivelse af membran-protein interaktion. AnxA2 binding til membranen er kendetegnet ved positive cooperativity, som er formidlet af det bevarede annexin core domæne og afhænger af tilstedeværelsen af kolesterol. De kvantitative data indhentet for AnxA2 og AnxA8 er rapporteret i detaljer andetsteds6,8.
Der er mange kritiske trin i denne protokol. Brug af Liposomer straks; ellers kan små blærer smelte ind i større vesikler med mindre overfladespænding, fører til hæmning af lipid tolagede dannelse. Opretholde en konstant temperatur under målingerne. Hver lille afvigelse i temperatur resulterer i en ikke ubetydelig frekvens og varmeafledning Skift. Undgå luftbobler; ellers systemet er ustabilt og vil ikke oprette en oprindelig plan.
Sauerbrey ligningen tillader den direkte omdannelse af den observerede frekvens ændres til ændringer i massen og er derfor meget udbredt. Men en antagelse om en lineær korrelation mellem ændringen i resonansfrekvens og tilføjede massen kun gælder for komponenter, der udgør en stiv og ensartet film på sensoren overfladen. Sauerbrey ligning kan ikke bruges til viskoelastiske adsorbenter såsom vand-rige protein film, lipid lag med indbygget vand, eller endda adsorberet celler. Her, er mere komplekse matematiske modeller påkrævet. Det er derfor yderst vigtigt at samtidig overvåge ændringer i hyppighed og varmeafledning. For at registrere strukturelle ændringer under målingen, kan ΔD versus Δf nøgletal afbildes, med en lige linje, der angiver ingen konformationelle ændringer.
En stor fordel ved denne teknik er muligheden for at bruge en meget bred vifte af materialer som substrater. Derudover er det en pålidelig og direkte metode til at studere en bred vifte af Makromolekylære interaktioner, som ordentlig dannelsen af overflade-belægning film (som SLB), samt yderligere protein-lipid interaktioner, kan overvåges online.
Denne protokol kan blive anvendt på andre membran-interagere proteiner, for eksempel, BAR domæne proteiner19, den ERM (ezrin, radixin og moesin) protein familie, der har en vigtig rolle i membran-cytoskeleton kobling20,21 ,22, eller proteiner der indeholder C2 eller PH domæner. Desuden har en bred vifte af anvendelser af denne teknik til at studere biologiske materialer været publiceret, dermed skabe QCM som en velegnet eksperimentelle platform til at studere samspillet af mere komplekse makromolekylære forsamlinger eller endda celler23,24.

Cellemembraner er stærkt dynamiske og komplekse strukturer. Den sammensatte blanding af membran lipider, sammen med perifert og/eller gennemfoert fuldt forbundet Membranproteiner, samle til form microdomains. Den koordinerede tempo-rumlige organisering af disse membran microdomains er involveret i vigtige fysiologiske processer1. Membran microdomain dynamics er drevet af samspillet mellem membran lipider og perifere Membranproteiner til at genkende og interagere med lipider beriget i microdomains evne. Ansættelse af proteiner til de specifikke lipider er ofte opnået via lipid-anerkendelse moduler, såsom pleckstrin Homologi (PH) eller C2 domæner2,3. Biofysiske analytiske metoder ved hjælp af model membraner er nøglen til at forstå de grundlæggende principper for disse processer på det molekylære niveau.
Annexins, en stor multigene-familie, er kendt for deres evne til at binde til negativt ladede membran lipider, overvejende Phosphatidylserin (PS), i en Ca2 +-kontrolleret måde2. Den anden hallmark af annexin familien er tilstedeværelsen af en bevaret strukturelle segment, den annexin gentage, og det nuværende fire eller otte gange og havne Ca2 +- og phospholipid-bindende websteder4. Ca2 +-afhængige lipid interaktion placerer annexins i en perfekt position til at sanse og formidle Ca2 +-medieret signalerer til target membraner. Konsekvent, er annexins i stand til at inducere dannelse af microdomains beriget med kolesterol, phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) og PS, både i cellulære og/eller kunstig membran systemer5. Denne protokol beskriver en metode til at analysere annexin membran interaktion ved hjælp af en kvartskrystal Microbalance spredning (QCM-D)6,7,8.
Den grundlæggende komponent i denne microbalance er en oscillerende krystal, der fungerer som sensoren overfladen. Adsorption og/eller binding af molekyler til sensoren overfladen falder resonansfrekvens (f) proportional med stigningen i massen. Hvis overfladen er jævnt overtrukket med en film, bindingen af yderligere stoffer kan forstyrre dette lag strukturelle integritet, og sådanne ændringer i viscoelasticity (energi varmeafledning faktoren D) Desuden kan overvåges. Dette er en udbredt teknik til at studere samspillet mellem proteiner og lipid dobbeltlag. I denne tilgang absorberes lipid vesikler passende belagt sensoren overfladen. Lipid tolagede dannelse er gunstig på silica-baserede materialer9,10, som blærer ofte ikke brud på andre hydrofile overflader, såsom guld11 oxideret efter UV-ozon eksponering, TiO212eller Al 2O313. Brud på de samler vesikler frigiver den vandige fase, medfører karakteristiske ændringer i massen og varmeafledning. Generation af solid-støttede dobbeltlag (SLB) af vesikel fusion er enkel og robust og kan bruges til at oprette komplekse modeller, der efterligner cellemembraner.
Antistatiske kvarts krystal microbalance er en etiket-fri og følsom teknik. En stor fordel er muligheden for at pels materiale, der genererer en tilstrækkelig tynd film på overfladen, hvilket giver en bred vifte af applikationer i forskellige forskningsområder. Protein-membran interaktion er observeret i realtid, og resultaterne kan analyseres direkte. Den samme sensor overflade kan bruges i de efterfølgende målinger (efter udførelse af en minimal rengøring som beskrevet i denne protokol), hvilket giver mulighed for præcis intern kontrol og en sammenlignelighed mellem analysander.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calciumchloride</td>
			<td style="width:163px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">017-013-00-2</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4432.1</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DOPC</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0878</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">PiP2</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">850155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">POPC</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">POPS</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840034P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiumchloride</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:163px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trisodium citrate</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder Liposofast</td>
			<td style="width:163px;">Avestin</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qsense E4 Analyzer</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QSense Dfind</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump IPC 4</td>
			<td style="width:163px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;">QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PC Membranes 0.05&#956;m</td>
			<td style="width:163px;">Avanti polar lipids</td>
			<td style="width:119px;">610003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro</td>
			<td style="width:163px;">OriginLab Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Version 8 and 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissipative microgravimetry to study the binding dynamics of the phospholipid binding protein annexin a2 to solid-supported lipid bilayers using a quartz resonator

Antistatiske kvarts krystal microbalance teknik er en enkel og etiket-fri tilgang til måle samtidig de masse udbredelse og viskoelastiske egenskaber masse absorberes/immobiliseret på sensor overflader, så målingerne af samspillet af proteiner med fast-understøttet overflader, såsom lipid dobbeltlag, i realtid og med en høj følsomhed. Annexins er en stærkt bevarede gruppe af fosfolipid-bindende proteiner, der interagerer kan dekrypteres med den negativt ladede headgroups via samordning af calciumioner. Her, vi beskriver en protokol, der blev anvendt til kvantitativt analysere bindingen af annexin A2 (AnxA2) til planar lipid dobbeltlag forberedt på overfladen af et quartz sensor. Denne protokol er optimeret for at opnå robuste og reproducerbare data og indeholder en detaljeret trin for trin beskrivelse. Metoden kan anvendes til andre membran-bindende proteiner og tolagede kompositioner.

Faldet i den resonant frekvens (Δf) korrelerer lineært med den adsorberede masse (Δm), som defineret af Sauerbrey ligning. 17
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg">
Her, f er resonant frekvensen, Cf er en konstant, som afhænger af den givne kvarts og resonant frekvensen geometriske og fysiske karakteristika, og A er den sensor areal.
I de fleste programmer er den adsorberede lag ikke helt stiv men viskoelastiske. Den resulterende dæmpning af kvarts sensor svingning omtales som varmeafledning (D). Den overvågede varmeafledning ændringer (ΔD) korrelere med de viskoelastiske egenskaber af den bundne masse18 og er defineret som følger8.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg">
Her, Espredes er energi tabt i én svingning periode, og Egemt er den samlede energi af frit oscillerende sensoren.
For at analysere og kvantificere bindingsparametrene, er frekvens isotermerne afledt af plotte ligevægt frekvens Skift (ΔΔfe) mod protein koncentrationer. ΔΔfe er defineret som
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg">
Her, repræsenterer Δft1 begyndelsen af protein adsorption og Δft2 tilstanden ligevægt. Ikke-lineær kurve montering kan udføres ved hjælp af en Hill udvidelse af Langmuir ligningen som følgende6,8.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg">
Her ΔΔfmax er ΔΔfe protein fusionen resulterer i maksimal (mætte) bindende, Kd er den tilsyneladende dissociationskonstant for protein/membran komplekse, og n er Hill-koefficient.
Hill koefficient (n) beskrives cooperativity af bindende. For n = 1, Hill adsorption model er en simpel Langmuir isoterm (de lige bindingssteder og alle molekyler binder uafhængigt af hinanden til lipid tolagede). Hvis n ≠ 1, en bundet ligand ændrer membranen bindende affinitet for andre ligander, enten øget (n > 1, positive cooperativity) eller faldende (n < 1, negativ cooperativity) affinitet.
Figur 1 viser et skematisk af eksperimentelle arbejdsprocessen vores laboratorium har anvendt til at måle skift i resonans og hyppighed i løbet af Ca2 +-afhængige bindende og frigivelsen af AnxA2 til lipid tolagede i den flydende fase. En eksemplarisk optagelse er vist i figur 2. Figur 2 A viser optagelsen af frekvens kurve, og figur 2B varmeafledning skiftehold. Den fremtrædende drop i frekvens ved tilsætning af Liposomer (figur 2A [step 1]) angiver deres adsorption. Fordi de buffer-fyldt blærer er ikke stiv, men viskoelastiske, spredning øger (figur 2B [step 1]). Efterfølgende, den samler vesikler brud. Samtidig frigivelse af buffer inde vesikler falder den adsorberede masse indtil en stabil plateau er nået (figur 2A [step 2]). Af note, tilsætning af vesikler resulterer i en høj varmeafledning Skift, mens Skift som svar på tolagede er meget mindre på grund af stive homogen karakteren af SLB (figur 2B [step 2]). Trin 3 i figur 2A og 2B poster bindingen af AnxA2 til lipider, som tilføjer masse, som det ses af den klare frekvens Skift, men ikke forstyrrer tolagede struktur, som angivet af den eneste lille ændring i varmeafledning. Når Ca2 + er fjernet af chelatdanner EGTA (figur 1 og figur 2 [trin 4]), tager AnxA2 fra filmens lipid. Frekvensen, som varmeafledning optagelser, Skift til de niveauer, set med tolagede kun (Sammenlign trin 2 og 4 i figur 2A og 2B), som angiver, at AnxA2 bindende er helt afhængige af Ca2 + og der lipid film forbliver intakt.
AnxA2, som gør mest af annexins, afhænger af negativt ladede lipider som PS. Dette ses tydeligt, når popper er fraværende i lipid tolagede (figur 3). Figur 3 A viser optagelsen af frekvens kurve, og figur 3B varmeafledning skiftehold. Bemærk at frekvensen skifter til en stabil basislinje på-25 Hz, men varmeafledning er ikke ændret (fig. 3B [step 2]), der indikerer en passende tolagede dannelse. Dog er ingen ændringer i frekvens (fig. 3A) eller spredning (fig. 3B) observeret efter tilsætning af AnxA2 under overværelse af Ca2 + (figur 3A og 3B [trin 3]) eller EGTA (figur 3a og 3B [trin 4]), som AnxA2 ikke kan interagere med lipid-film.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg"> Figur 1 : Grafisk model af den eksperimentelle arbejdsproces. Denne arbejdsproces illustrerer vesikel absorption på hydrofile sensoren overfladen (trin 1), vesikel fusion/brud fører til SLB dannelse (trin 2), og Ca2 +-afhængige adsorption (trin 3) og EGTA-afhængige desorption af AnxA2 (trin 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg"> Figur 2 : Eksemplarisk optagelse. Disse paneler viser (A) tidsafhængig overvågning af de 7 overtone resonansfrekvens og (B) varmeafledning forskydninger af kvarts sensorer under målingen. Anvendelsen af Liposomer forårsager en hurtig nedgang i frekvens baseline, hvorimod varmeafledning baseline øger (trin 1). Stabilisering af basislinjer angiver dannelsen af tolagede (trin 2). AnxA2 (200 nM) adsorption (tilstedeværelse af Ca2 +) på pop-holdige lipid tolagede tilføjer masse uden væsentligt ændring varmeafledning, der angiver, at filmens lipid ikke er urolig (trin 3). Inddrivelse af frekvens baseline ved Ca2 + kelation med EGTA angiver den samlede desorption af protein (trin 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg"> Figur 3 : Negative kontrol eksperiment, demonstrerer, at AnxA2 ikke binder sig til SLBs i mangel af popper. Disse paneler viser tilføjelsen af Liposomer og SLB dannelse (trin 1 og 2). Ingen ændringer i (A) hyppighed eller (B) varmeafledning er tilsyneladende efter tilsætning af AnxA2 (trin 3; 200 nM, i overværelse af Ca2 +) eller EGTA (trin 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Sammensætning</td>
			<td>ΔΔF/Hz efter dannelsen af SLBs</td>
			<td>ΔΔD * 10-6 efter dannelsen af SLB</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPPER (80: 20)</td>
			<td>26,3 ± 0,2</td>
			<td>0,26 ± 0,03</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/PI (4,5) P2 (95: 5)</td>
			<td>26.5 ± 0,5</td>
			<td>0.31 ± 0,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/pop/Chol (60: 20: 20)</td>
			<td>29,2 ± 0,2</td>
			<td>0,45 ± 0,09</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/pop/PI (4,5) P2/Chol (60: 17: 3:20)</td>
			<td>29,6 ± 0,6</td>
			<td>0,43 ± 0,10</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/DOPC/pop/PI (4,5) P2/Chol (37: 20: 20: 3:20)</td>
			<td>29.4 ± 0,4</td>
			<td>0,39 ± 0,14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Lipid sammensætning og dannelse data af SLB 7 .

Watch this Scientific Journal Video about Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Reso

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Her præsenterer vi en forsøgsplan, der kan anvendes til at fastlægge bindende tilhørsforhold og tilstand af samspillet mellem etiket-fri phospholipid-bindende protein annexin A2 med immobiliserede fast-understøttet dobbeltlag (SLB) ved samtidig måling af massiv udbredelse og viskoelastiske egenskaber af protein annexin A2.

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Denne metode kan hjælpe med at studere retninger af proteiner med lipidmembraner. I vores tilfælde skal du bruge den til at analysere calcium afhængig binding af bilags til negativt ladede fosfolipider. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er etiket gratis, følsomme, kvantitative, og at interaktioner kan observeres i realtid.Således giver mulighed for direkte analyse af reelle resultater. Denne teknik kan også anvendes på andre systemer, såsom samspillet mellem mere komplekse mikromolekyle forsamlinger eller endda celler. Brug klare fem millimolar lipidopløsninger som beskrevet i tekstprotokollen.Kombiner de opløste lipider i det ønskede kindtandforhold i 10 milliliterglas. Fordamp de organiske opløsningsmidler ved hjælp af en tør strøm af kvælstof. Lad lipidblandingen være på et højvakuofiltsystem i tre timer for at fjerne eventuelle resterende spor af opløsningsmidlerne.Nu, resuspend den lipid film i en milliliter citrat buffer. Inkuber lipidaffjedringen ved 60 grader Celsius i 30 minutter i et vandbad og vortexing det kraftigt hvert femte minut. Denne temperatur er omkring 10 grader Celsius over fase overgangstemperaturen af den højeste smeltende lipid i blandingen.I mellemtiden forvarm ekstruderen udstyret med en 50 nanometer diameter pore størrelse polycarbonat membran over overgangstemperaturen i 30 minutter. Læg multilamellar vesikelaffus suspensionen i den forvarmede ekstruder. Forsigtigt passere blandingen 31 gange gennem polycarbonatmembranen til at danne små unilamellar vesikler eller SUV'er.Hold temperaturen over overgangstemperaturen. Overfør SUV suspensionen til en to milliliter plast reaktion fartøj og tilsæt citrat buffer til at bringe det endelige volumen til to milliliter. Inkuber fire sensorer indsat i en polytetrafluorethylenholder i en 2% SDS-opløsning i mindst 30 minutter.Vask dem derefter grundigt med ultra rent vand for helt at fjerne SDS og prøv dem ved hjælp af en strøm af tør argon eller nitrogen. Brug et plasmarengøringssystem til helt at fjerne eventuelle forurenende stoffer. For at gøre dette skal du indsætte de tørre sensorer i plasmarensningskammeret, evakuere kammeret og skylle det tre gange med ilt.Tænd derefter for plasmarenseren. Brug vakuum, høj radiofrekvens effekt, og 10 minutters procestid. Efter rengøringen skal du slukke for maskinen og tage sensorerne ud.Dock forsigtigt plasma rensede sensorer ind i de fire flow kamre ved hjælp af pincet. Undgå tryk på eller torsion af kamre og rør, der kan forårsage utæt. Skyl systemet med citratbuffer i åben flowtilstand i 10 minutter.Start programmet. Begynd at registrere eventuelle ændringer i hyppigheden og spredningen af de første grundlæggende tone- og overtoner ved hjælp af softwaren, indtil frekvensen og spredningslinjen er stabile. Når basislinjen er stabile, skal du anvende SUV-suspensionen i citratbufferen.Fjern 1,5 milliliter det døde volumen ved hjælp af et reaktionskar, og luk derefter systemet i løkkeflowtilstand. Optag frekvensafledningsskiftet i yderligere 10 minutter. Når SLB er stabil, skal systemet ligevægte med en løbebuffer ved de krævede calciumkoncentrationer i åben strømningstilstand i 40 minutter.Tilsæt proteinet til den løbende buffer, der indeholder calcium. Udfør anvendelsen af proteinet i en løkkeflowtilstand, indtil en balance steady state er nået. Nu, dissociate det bundne protein ved chelater calciumioner med fem millimolar EGTA i løbe buffer i open flow mode.Regenerer mikrobalancesystemet med 50 milliliter dobbelt destilleret vand i kontinuerlig åben flowtilstand. Fjern rørene fra vandbeholderen og lad systemet køre tør. Fjern forsigtigt krystalsensoren, og rengør den med en 2% SDS-opløsning ved hjælp af polytetrafluorethylenholderen.Tør de synlige dele af flowmodulets interiør, hvor sensoren blev placeret. Vist her, er registreringen af frekvenskurven og spredningsskift. Den fremtrædende fald i frekvens ved tilsætning af liposomer, angiver deres absorption, fordi buffer fyldte vesikler ikke er stive, men viskoelastiske, spredningen stiger.Efterfølgende brister de smeltende vesikler. Den samtidige frigivelse af bufferen inde i vesiklerne nedsætter adsorbereddens masse, indtil et stabilt plateau er nået. Bindingen af bilag I A2 til lipiderne tilføjer masse som det fremgår af det klare frekvensskift, men forstyrrer ikke tolagsstrukturen som angivet ved den eneste lille ændring i spredningen.Når calciumion fjernes af chelatdanner, EGTA, tager bilag I A2 afstand fra lipidfilmen. Frekvensen og spredningsoptagelserne flyttes til de niveauer, der ses med tolagsindbindingen, og som kun angiver bilag i A2-bindingen, er fuldstændig afhængig af calciumionen, og at lipidfilmen forbliver intakt. Et repræsentativt negativt kontroleksperiment vises her.Når der ikke forekommer fosfatidyserin, er der ingen ændringer i hyppighed eller spredning efter tilsætning af bilag I A2 ved tilstedeværelse af calciumion. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at sikre korrekt tolagsdannelse. Brug liposomer straks, ellers de små vesikler vil smelte sammen i større dem med mindre overfladespænding, der kan føre til en ustabil baseline.Efter denne procedure kan der udføres en kvantativ beskrivelse af en membranproteininteraktion for at besvare yderligere spørgsmål som kooperativ versus ikke-samarbejdsvillig binding.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...