Name: dissipative microgravimetry to study the binding dynamics of the phospholipid binding protein annexin a2 to solid-supported lipid bilayers using a quartz resonator
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Reso

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft onder subsidies SFB 858/B04, UITM 1003, SFB 1348/A04 en SFB 1348/A11.

Opmerking: Buffers moeten worden gefilterd met behulp van een filter van 0.22-µm en ontgast door een vacuüm gedurende 1 uur.
1. lipide vesikel voorbereiding
<ol><li>Gebruik 2-mL glazen buizen. Los van elke lipide, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POP's) en cholesterol (Chol), in een mengsel van chloroform / methanol (50:50 v/v) voor te bereiden van een oplossing van de lipide duidelijk 5 mM. Los 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4,5) P2) in een mengsel van chloroform/methanol/water (20:9:1 v/v).</li>
	<li>Combineren van de opgeloste lipiden in de gewenste molaire verhouding van POPC/POP's (80/20), POPC/PI (4,5) P2 (95/5), POPC/pop/Chol (60/20/20), POPC/pop/HD-PI (4,5) P2/Chol (60/17/3/20) en () POPC/DOPC/pop/HD-PI (4,5) P2/Chol (37/20/20/3/20) Tabel 1) in 10 mL glazen buizen. Opmerking: Het definitieve bedrag van de totale lipide is 500 µg.</li>
	<li>Het verdampen van de organische oplosmiddelen die met behulp van een droge stroom van stikstof. Laat het mengsel van lipide op een hoog vacuüm (lyofilisatie) systeem gedurende 3 uur voor het verwijderen van eventuele resterende sporen van de oplosmiddelen. Opmerking: Dit resulteert in een droge duidelijk film.</li>
	<li>Resuspendeer de lipide-film in 1 mL ammoniumcitraat buffer (Trinatriumcitraat 10 mM-citraat, 150 mM NaCl, pH 4.6). Incubeer de lipide schorsing bij 60 ° C (deze temperatuur is ongeveer 10 ° C boven de temperatuur van de overgang fase van de hoogste smeltende lipide in het mengsel) gedurende 30 minuten in een waterbad, en vortex het krachtig iedere 5 min. Opmerking: Dit resulteert in de vorming van blaasjes van grote, multilamellar (MLVs). Houd de schorsing boven de temperatuur van de overgang.</li>
	<li>Verwarm de extruder (bij 60 ° C in dit geval) uitgerust met een 50-nm diameter poriegrootte polycarbonaat membraan boven de overgang temperatuur (die is hier 40-50 ° C) gedurende 30 minuten.</li>
	<li>De MLV-schorsing in de voorverwarmde extruder laden en voorzichtig passeren de mengsel 31 x door de polycarbonaat membraan vormen van kleine unilamellar blaasjes (SUV's)14. Houd de temperatuur boven de temperatuur van de overgang.</li>
	<li>Breng de SUV een kunststof reactievat van 2 mL en voeg de citraat buffer (zie stap 1.4) toe zodat het eindvolume 2 mL. Opmerking: Dit zal opleveren een definitieve vetgehalte van 250 µg/mL.</li>
</ol>2. behandeling van de Quartz-sensoren
Opmerking: Behandelen altijd de kwarts sensoren met een pincet.
<ol><li>Incubeer vier sensoren ingevoegd in een polytetrafluorethyleen houder in een 2% SDS-oplossing voor ≥ 30 min. wassen ze uitgebreid met ultra pure water volledig verwijderen van de SDS en laat ze drogen met behulp van een stroom van droge argon of stikstof.</li>
	<li>Een plasma-Clean-systeem gebruiken voor het verwijderen van eventuele verontreinigingen. Plaats de droge sensoren in de plasma-schoonmaken kamer, evacueren van de zaal en spoel het 3 x met zuurstof. Draai het plasma reiniger op. Gebruik van de volgende procesparameters: 1 x 10-4 Torr druk, hoge radiofrequentie (RF) kracht en 10 min van verwerkingstijd. Uitschakelen van de machine en neem uit de sensoren.</li>
</ol>3. microbalans operatie
Opmerking: Een microbalans systeem met vier temperatuurgevoelig stroom holtes in parallelle configuratie, aangesloten op een peristaltische pomp en ingesteld op een debiet van 80 µL/min, werd gebruikt. In de modus open stroom was de buffer uit het reservoir feeder in de ontvangende tank gepompt. In de loop-modus, was de ontvangende tank verbonden met het reservoir van de feeder voor het genereren van een gesloten lus. De temperatuur werd ingesteld op 20 ° C.
<ol><li>Zorgvuldig dok de plasma-gereinigd sensoren in de 4 stroom chambers, gebruik pincet. Dat de druk op de of torsie van de kamers en de buizen die leiden lekken tot kunnen te voorkomen.</li>
	<li>Spoelen van het systeem met citraat buffer (Trinatriumcitraat 10 mM-citraat, 150 mM NaCl, pH 4.6) in de open-flow modus voor 10 min. Opmerking: Dit vereist precies 3.2 mL buffer, maar het is raadzaam om het gebruik van een overmaat van buffer (10 mL).</li>
	<li>Start het programma. Start de opname van wijzigingen in de frequentie en de afbraak van de eerste fundamentele Toon (n = 1e) en boventonen (n = 3e-13e) met behulp van de software, totdat de frequentie en dissipatie basislijnen stabiel zijn (dit duurt ongeveer 40-60 min). Opmerking: Frequentie geluidsniveaus (piek-tot-piek) moet lager zijn dan 0,5 Hz en, voor de dissipatie, lager is dan 0.1·10-6, met een maximale drift (in waterige oplossing) van 1 Hz/h in frequentie en 0.3·10-6/h in dissipatie.</li>
	<li>Wanneer de basislijnen stabiel zijn, de opschorting van de SUV in citraat buffer (2 mL in een klein buisje) van toepassing. Met behulp van een reactievat, 1,5 mL van het dode volume verwijderen. Sluit het systeem in de lus-flow-modus. De frequentie/dissipatie verschuiving opnemen voor nog eens 10 minuten. Opmerking: Gedurende deze tijd, de blaasjes zal verspreid op het oppervlak van SiO2 en zekering om te vormen van een continu dubbelgelaagde15,16 (stap 2 in de figuren 1, Figuur 2en Figuur 3). De SUV's adsorptie aan het oppervlak van de sensor is twee-phasic en heeft een typische frequentie minimum- en maximumwaarden in de dissipatie. Een stabiele nieuwe frequentie/dissipatie basislijn met een frequentieverschuiving van de karakteristieke (afhankelijk van de samenstelling van lipide) van 26-29 Hz (Zie tabel 1) geeft aan dat een continue dubbelgelaagde op het oppervlak.</li>
	<li>Wanneer de SLB is stabiel (zie stap 3.4), het systeem met de lopende buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) bij de vereiste Ca2 + concentraties (variërend van 50 µM tot 1 mM CaCl2, afhankelijk van het experiment) in een open stroom modus voor equilibreer 40 min.</li>
	<li>Voeg het eiwit (hier, AnxA2) voor de werking van de buffer met Ca2 + (zie stap 3.5). Voeren de toepassing van het eiwit in een lus-flow-modus totdat een evenwicht stationaire toestand is bereikt (stap 3 in Figuur 1en Figuur 2 Figuur 3). Opmerking: De eiwitconcentratie kan variëren van 1 tot 400 nM. Eiwit adsorptie resulteert in een concentratie-afhankelijke frequentieverschuiving als gevolg van de adsorptie van de massa (eiwit).</li>
	<li>De afhankelijke eiwitten distantiëren door chelaat Ca2 + ionen met 5 mM EGTA in de lopende buffer in open stroom modus (stap 4 in de figuren 1 en Figuur 2). Opmerking: Een herstel van de frequentie en de dissipatie tot de SLB basislijn geeft een totale omkeerbaarheid van binding aan eiwitten. Associatie-dissociatie cycli kunnen worden herhaald om te vergelijken verschillende concentraties of eiwitten.</li>
</ol>4. microbalans schoonmaken
Opmerking: Een minimale schoonmaak procedure uitvoeren na elke meting.
<ol><li>Regenereren de microbalans systeem met 50 mL voor ddH2O in een continue stroom van de open modus, verwijder de buizen uit de watercontainer en laat het systeem droog.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de crystal-sensor en het schoon te maken met de 2% SDS oplossing met behulp van de houder van polytetrafluorethyleen (zie stap 2.1).</li>
	<li>Droog de zichtbare delen van de stroom module interieur waar de sensor werd geplaatst. Opmerking: Een intensieve reiniging van procedure na een reeks van 10 metingen uitvoeren</li>
	<li>Het reinigen van het systeem met een 2% SDS-oplossing (50 mL) bij 40 ° C (setup in de software) in een continue open stroom (buis)-modus, met behulp van een debiet van 20 µL/min voor uitgebreide contact met het wasmiddel.</li>
	<li>Schoon met 250 mL ddH2O in continue open stroom-modus op een debiet van 160 µL/min. Opmerking: Na 4 maanden, voert u een uitgebreide schoonmaak procedure volgens de handleiding van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).</li><li>Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexins:+linking+Ca2++signalling+to+membrane+dynamics.">Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).</li><li>Mim, C., Unger, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+and+its+generation+by+BAR+proteins.">Membrane curvature and its generation by BAR proteins.</a> Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).</li><li>Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+2+is+a+phosphatidylinositol+(4,5)-bisphosphate+binding+protein+recruited+to+actin+assembly+sites+at+cellular+membranes.">Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes.</a> Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).</li><li>Gerke, V., Moss, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexins:+from+structure+to+function.">Annexins: from structure to function.</a> Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).</li><li>Heitzig, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+promotes+demand-driven+recruitment+of+AnxA8+to+cholesterol-containing+membranes.">Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).</li><li>Dr&#252;cker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+characterization+of+supported+lipid+bilayers+containing+phosphatidylinositol-4,5-biphosphate+and+cholesterol+as+functional+surfaces.">Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces.</a> Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).</li><li>McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+membranes+in+studies+of+cell-cell+recognition+in+the+immune+system.">Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).</li><li>Anderson, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+bilayers+on+silica+substrates.">Formation of supported bilayers on silica substrates.</a> Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).</li><li>Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+adsorption+and+phospholipid+bilayer+formation+on+topographically+and+chemically+nanostructured+surfaces.">Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces.</a> Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).</li><li>Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms:+a+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide.">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li><li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+formation+of+lipid+bilayer+coatings+on+bare+aluminium+oxide:+overcoming+the+force+of+interfacial+water.">Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li><li>Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+liposomes+of+defined+size+distribution+by+extrusion+through+polycarbonate+membranes.">Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).</li><li>Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+lipid+vesicle+deposition+on+solid+surfaces:+a+combined+QCM-D+and+AFM+study.">Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study.</a> Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).</li><li>Richter, R. P., B&#233;rat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers:+an+integrated+view.">Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li><li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verwendung+von+Schwingquarzen+zur+W&#228;gung+d&#252;nner+Schichten+und+zur+Mikrow&#228;gung.">Verwendung von Schwingquarzen zur W&#228;gung d&#252;nner Schichten und zur Mikrow&#228;gung.</a> Zeitschrift f&#252;r Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).</li><li>Rodahl, M., H&#246;&#246;k, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance+setup+for+frequency+and+Q-factor+measurements+in+gaseous+and+liquid+environments.">Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).</li><li>Dr&#252;cker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+of+annexin+A2+to+cholesterol-and+phosphatidylinositol-4,+5-bisphosphate-containing+bilayers.">Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=External+push+and+internal+pull+forces+recruit+curvature-sensing+N-BAR+domain+proteins+to+the+plasma+membrane.">External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane.</a> Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li><li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+the+cell+cortex:+the+role+of+ERM+proteins.">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).</li><li>Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+membranes+doped+with+PIP2:+influence+of+ionic+strength+and+pH+on+bilayer+formation+and+membrane+organization.">Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization.</a> Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).</li><li>Bianco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance+as+cell-based+biosensor+to+detect+and+study+cytoskeletal+alterations+and+dynamics.">Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics.</a> Biotechnology Journal. , 1700699 (2018).</li><li>Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance:+Sensing+cell-substrate+adhesion+and+beyond.">Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).</li><li>Bragazzi, N. L., et al., Donev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Crystal+Microbalance+(QCM)+for+Public+Health:+An+Overview+of+Its+Applications.">Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications.</a> Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 101, 149-211 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om vragen te beantwoorden over de structuur-functie relatie van cellulaire membranen beide een kwantitatieve en kwalitatieve wijze, cel biologie winsten enorm uit het gebruik van biofysische benaderingen op basis van gevestigde en gebruikte technieken , met inbegrip van atomaire kracht microscopie (AFM), oppervlakte plasmon resonantie (SPR), en de QCM-D techniek werkzaam hier. We toonden in eerdere studies die Annexine eiwitten in een Ca2 binden +-afhankelijke manier aan de geïmmobiliseerdet membraan met hoge affiniteit. We gebruiken frequentie en dissipatie verschuivingen van de 7de ondertoon (Δf7), omdat dit het beste compromis van detectie gevoeligheid en trilling stabiliteit.
Deze techniek maakt ook een kwantitatieve beschrijving van de membraan-eiwit interactie. AnxA2 binding aan het membraan wordt gekenmerkt door positieve Allosterie dat is bemiddeld door het geconserveerde annexin kern domein en hangt af van de aanwezigheid van cholesterol. De kwantitatieve gegevens verkregen voor AnxA2 en AnxA8 zijn gemeld detail elders6,8.
Er zijn vele kritische stappen in dit protocol. Gebruik de liposomen onmiddellijk; anders, kleine blaasjes kunnen samensmelten tot grotere blaasjes met minder oppervlaktespanning, waardoor de remming van de vorming van lipide dubbelgelaagde. Het handhaven van een constante temperatuur tijdens de metingen. Elke kleine afwijking in temperatuur resulteert in een niet te verwaarlozen frequentie en dissipatie verschuiving. Vermijden van luchtbellen; anders, het systeem is onstabiel en zal niet tot stand te brengen voor een basislijn.
De Sauerbrey-vergelijking kan de directe conversie van de waargenomen frequentie verandert in veranderingen in de massa en daarom is het op grote schaal gebruikt. Echter, de aanname van een lineaire correlatie tussen de verandering in resonantiefrequentie en de toegevoegde massa alleen geldt voor onderdelen vormen van een strenge en uniforme film op het sensoroppervlak. De Sauerbrey-vergelijking kan niet worden gebruikt voor visco adsorbents zoals water-rijke eiwitten films, lipide lagen met opgenomen water, of zelfs geadsorbeerde cellen. Hier, zijn meer complexe wiskundige modellen vereist. Daarom is het uiterst belangrijk gelijktijdig volgen de veranderingen in frequentie en dissipatie. U wilt opsporen structurele veranderingen tijdens de meting, ΔD versus Δf ratio's, kunnen worden weergegeven, met een rechte lijn die aangeeft geen conformationele wijzigingen.
Een groot voordeel van deze techniek is de mogelijkheid tot gebruik van een zeer breed scala aan materialen als substraten. Bovendien is het een betrouwbare en directe methode te bestuderen van een breed scala van macromoleculaire interacties, als de juiste formatie van de oppervlak-coating films (zoals SLB), evenals verdere lipide-eiwit interacties, kan online worden gecontroleerd.
Dit protocol kan worden toegepast op andere membraan-interactie eiwitten, bijvoorbeeld BAR domein eiwitten19, de ERM (ezrin radixin, familie, en moesin) eiwit dat een belangrijke rol in de membraan-cytoskelet koppeling20,21 ,,22, of eiwitten met C2 of PH domeinen. Bovendien heeft een brede waaier van toepassingen van deze techniek te bestuderen van biologische materialen met succes verschenen, waarmee QCM als een geschikt experimenteel platform te bestuderen van de interacties van meer complexe macromoleculaire assemblages of zelfs cellen23,24.

Cellulaire membranen zijn zeer dynamische en complexe structuren. De samengestelde mix van lipiden membraan, samen met zijdelings en/of onlosmakelijk verbonden membraaneiwitten, monteren aan formulier microdomains. De gecoördineerde tempo-ruimtelijke organisatie van deze membraan-microdomains is betrokken bij belangrijke fysiologische processen1. Membraan microdomain dynamics worden gedreven door het samenspel van lipiden membraan, evenals door de mogelijkheid van perifere membraaneiwitten te herkennen en ermee lipiden verrijkt in de microdomains. De aanwerving van de eiwitten aan de specifieke lipiden is vaak bereikt via lipide-erkenning modules, zoals de pleckstrin-homologie (PH) of de C2 domeinen2,3. Biofysische analysemethoden gebruik van model membranen zijn de sleutel tot het begrijpen van de fundamentele beginselen van deze processen op moleculair niveau.
Annexins, een grote multigene-familie, staan bekend om hun vermogen om te binden aan negatief geladen membraan lipiden, overwegend fosfatidylserine (PS), in a Ca2 +-gecontroleerde wijze2. Het tweede kenmerk van de annexin familie is de aanwezigheid van een geconserveerde structurele segment, de Annexine herhalen, dat is de huidige vier of acht keer en herbergt de Ca2 +- en fosfolipide-bindende plaatsen4. De Ca2 +-afhankelijke lipide interactie plaatst de annexins in een perfecte positie te voelen en overbrengen Ca2 +-bemiddelde signalering tot doel membranen. Consequent, kunnen voor het opwekken van de vorming van microdomains verrijkt met cholesterol, phosphatidylinositol-4,5-difosfaat (PI (4,5) P2) en PS, zowel in cellulaire en/of kunstlicht membraan systemen5annexins. Dit protocol beschrijft een aanpak om de interactie van de Annexine-membraan met behulp van een kwartskristal microbalans dissipatie (QCM-D)6,7,8te analyseren.
Het basis bestanddeel in deze microbalans is een oscillerende kristal dat als het sensoroppervlak fungeert. De adsorptie en/of de binding van moleculen tot het sensoroppervlak verlaagt de resonantiefrequentie (f) in verhouding tot de toename van de massa. Het oppervlak is gelijkmatig bedekt met een film, de binding van extra stoffen kan interfereren met de structurele integriteit van deze laag als dergelijke wijzigingen in de viscoelasticity (de energie dissipatie factor D) Daarnaast kunnen worden gecontroleerd. Dit is een wijdverbreide techniek te bestuderen de interactie tussen eiwitten en lipiden-bilayers. In deze benadering worden lipide blaasjes geabsorbeerd op het sensoroppervlak op de juiste wijze bekleed. Lipide dubbelgelaagde vorming is gunstig op silica gebaseerde materialen9,10, als blaasjes vaak niet op andere hydrofiele oppervlakken scheuren, zoals de gouden11 geoxideerd na blootstelling van UV-ozon, TiO212of Al 2O313. De breuk van de coalescing vesikels releases de waterige fase, wat leidt tot karakteristieke wijzigingen in massa en dissipatie. De generatie van solid-ondersteunde bilayers (SLB) door vesikel fusie is eenvoudig en robuust en kan worden gebruikt voor het genereren van complexe modellen die na te bootsen van cellulaire membranen.
Dissipatief Kwarts-microbalans is een label-vrij en gevoelige techniek. Een groot voordeel is de mogelijkheid om de jas van enig materiaal dat een voldoende dunne film op het oppervlak genereert, waardoor een brede waaier van toepassingen in verschillende onderzoeksgebieden. De interactie eiwit-membraan wordt waargenomen real-time, en de resultaten direct kunnen worden geanalyseerd. Het dezelfde sensoroppervlak kan worden gebruikt in latere metingen (na het uitvoeren van een minimale schoonmaken zoals beschreven in dit protocol), waardoor nauwkeurige interne controles en een vergelijkbaarheid tussen analyten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calciumchloride</td>
			<td style="width:163px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">017-013-00-2</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4432.1</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DOPC</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0878</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">PiP2</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">850155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">POPC</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">POPS</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840034P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiumchloride</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:163px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trisodium citrate</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder Liposofast</td>
			<td style="width:163px;">Avestin</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qsense E4 Analyzer</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QSense Dfind</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump IPC 4</td>
			<td style="width:163px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;">QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PC Membranes 0.05&#956;m</td>
			<td style="width:163px;">Avanti polar lipids</td>
			<td style="width:119px;">610003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro</td>
			<td style="width:163px;">OriginLab Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Version 8 and 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissipative microgravimetry to study the binding dynamics of the phospholipid binding protein annexin a2 to solid-supported lipid bilayers using a quartz resonator

De dissipatief Kwarts-microbalans techniek is een eenvoudige en label-vrije benadering te meten tegelijkertijd de massale verbreiding en visco eigenschappen van de massa geabsorbeerd/geïmmobiliseerd op oppervlakken van de sensor, waardoor de metingen van de interactie van eiwitten met solid-ondersteunde oppervlakken, zoals lipide-bilayers, in real time en met een hoge gevoeligheid. Annexins zijn een zeer geconserveerde groep van fosfolipide-bindende proteÃ¯nen die ermee omkeerbaar de negatief geladen headgroups via de coördinatie van calciumionen. Hier beschrijven we een protocol dat werkte kwantitatief analyseren de binding van het Annexine A2 (AnxA2) te vlakke lipide bilayers voorbereid op het oppervlak van een kwarts-sensor. Dit protocol is geoptimaliseerd om robuuste en reproduceerbare gegevens te verkrijgen en bevat een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving. De methode kan worden toegepast op andere membraan-bindende proteÃ¯nen en dubbelgelaagde composities.

De daling van de resonantie frequentie (Δf) correleert op een lineaire wijze met de geadsorbeerde massa (Δm), zoals gedefinieerd door de Sauerbrey-vergelijking. 17
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg">
Hier, f is de frequentie van resonant, Cf is een constante die is afhankelijk van de geometrische en fysieke kenmerken van de gegeven quartz en de resonant frequentie en A is de oppervlakte van de sensor.
In de meeste toepassingen is de geadsorbeerde laag niet volledig stijf maar Visco. De resulterende demping van de trilling van de sensor kwarts is dissipatie (D) genoemd. De gecontroleerde dissipatie wijzigingen (ΔD) correleren met de visco-eigenschappen van de afhankelijke massa18 en zijn als volgt gedefinieerd8.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg">
Hier Everdwenen is de energie verloren tijdens de periode van één trilling, en de totale energie van de vrij oscillerende sensor Eopgeslagen is.
Te analyseren en te kwantificeren van de bindende parameters, worden frequentie-isothermen afgeleid door het uitzetten van de evenwicht frequentie verschuivingen (ΔΔfe) tegen de concentraties eiwitten. ΔΔfe wordt gedefinieerd als
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg">
Δft1 vertegenwoordigt hier, het begin van het eiwit adsorptie en Δft2 de evenwicht staat. Niet-lineaire curve-fitting kan worden uitgevoerd met behulp van een uitbreiding van de heuvel van de Langmuir vergelijking als volgt6,8.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg">
Hier, ΔΔfmax is de ΔΔfe van de eiwitconcentratie, wat resulteert in maximale (verzadigen) bindende, Kd is de schijnbare dissociatieconstante voor het eiwit/membraan complexe en n is de Hill coëfficiënt.
De Hill coëfficiënt (n) beschrijft de Allosterie binding. Voor n = 1, het model van de adsorptie Hill is een eenvoudige Langmuir Thermo (de gelijke bandplaatsen en alle moleculen binden onafhankelijk van elkaar aan de lipide dubbelgelaagde). Als n ≠ 1, een afhankelijke ligand het membraan bindend affiniteit voor andere liganden verandert, ofwel (n > 1, positieve Allosterie) frequentierespons (n < 1, negatieve Allosterie) de affiniteit.
Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de experimentele werkstroom gebruikt in ons laboratorium voor het meten van de verschuivingen in resonantie en frequentie tijdens Ca2 +-afhankelijke bindende en de vrijlating van AnxA2 aan de lipide dubbelgelaagde in de vloeibare fase. Een voorbeeldige opname is afgebeeld in Figuur 2. Figuur 2 A toont de opname van de frequentie-curve en Figuur 2B toont de dissipatie verschuivingen. De prominente daling van de frequentie op de toevoeging van de liposomen (Figuur 2A [stap 1]) geeft aan dat hun adsorptie. Omdat de buffer gevulde blaasjes niet rigide zijn, maar Visco, de dissipatie toeneemt (Figuur 2B [stap 1]). Vervolgens de coalescing vesikels breuk. De gelijktijdige release van de buffer binnen de blaasjes vermindert de geadsorbeerde massa, totdat een stabiele plateau is bereikt (Figuur 2A [stap 2]). Van de nota, de toevoeging van blaasjes resulteert in een hoge dissipatie verschuiving, terwijl de verschuiving in reactie op de dubbelgelaagde is veel kleiner als gevolg van de rigide homogene aard van de SLB (Figuur 2B [stap 2]). Stap 3 in figuur 2A en 2B records de binding van AnxA2 aan de lipiden, die voegt massa, zoals gezien door de duidelijke frequentieverschuiving, maar niet interfereert met de dubbelgelaagde structuur, zoals aangegeven door de enige kleine verandering in de dissipatie. Wanneer Ca2 + wordt verwijderd door de chelaatvormer EGTA (Figuur 1 en Figuur 2 [stap 4]), distantieert AnxA2 van de lipide-film. De frequentie, alsmede de dissipatie opnames, verschuiven naar de niveaus gezien met de dubbelgelaagde alleen (vergelijk stap 2 en 4 in figuur 2A en 2B), die aangeeft dat de bindende AnxA2 volledig afhankelijk van Ca is2 + en die de lipide-film blijft intact.
AnxA2, als meest van de annexins, hangt af van negatief geladen lipiden zoals PS. Dit is duidelijk gezien wanneer de POP's ontbreekt in de lipide dubbelgelaagde (Figuur 3). Figuur 3 A toont de opname van de frequentie-curve en Figuur 3B toont de dissipatie verschuivingen. Opmerking dat de frequentie naar een stabiele basislijn bij-25 Hz verschuift, maar de dissipatie niet is veranderd (Figuur 3B [stap 2]), indicatief voor een juiste dubbelgelaagde formatie. Echter worden geen veranderingen in de frequentie (Figuur 3A) of dissipatie (Figuur 3B) waargenomen na de toevoeging van AnxA2 in aanwezigheid van Ca2 + (figuur 3A en 3B [stap 3]) of EGTA (figuur 3a en 3B [stap 4]), zoals AnxA2 kan niet met de lipide-film communiceren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg"> Figuur 1 : Grafisch model van de experimentele workflow. Deze werkstroom illustreert het blaasje absorptie aan het sensoroppervlak van de hydrofiele (stap 1), de vesikel fusion/breuk leidt tot de vorming van SLB (stap 2), en de Ca2 +-afhankelijke adsorptie (stap 3) en de EGTA-afhankelijke desorptie van AnxA2 (stap 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg"> Figuur 2 : Opname van de voorbeeldige. Deze panelen tonen (A) de tijd-afhankelijke monitoring van de 7de ondertoon resonantiefrequentie en (B) de dissipatie verschuivingen van de quartz-sensoren tijdens de meting. De toepassing van de liposomen veroorzaakt een snelle daling in de basislijn van de frequentie, overwegende dat de dissipatie basislijn verhoogt (stap 1). De stabilisatie van de basislijnen geeft aan de vorming van de dubbelgelaagde (stap 2). De AnxA2 (200 nM) adsorptie (in aanwezigheid van Ca2 +) op de pop-bevattende lipide dubbelgelaagde voegt massa aanzienlijk zonder de dissipatie, die aangeeft dat de lipide-film niet is verstoord (stap 3). Het herstel van de basislijn van de frequentie op Ca2 + chelatie met EGTA geeft de totale desorptie van het eiwit (stap 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg"> Figuur 3 : Negatieve controle-experiment, aan te tonen dat AnxA2 niet aan SLBs bij gebrek aan POP's bindt. Deze panelen tonen de toevoeging van liposomen en de vorming van SLB (stappen 1 en 2). Er zijn geen wijzigingen in de frequentie van de (A) of (B) dissipatie blijkt na toevoeging van AnxA2 (stap 3; 200 nM, in aanwezigheid van Ca2 +) of EGTA (stap 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Samenstelling</td>
			<td>ΔΔF/Hz na de vorming van SLBs</td>
			<td>ΔΔD * 10-6 na vorming van SLB</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POP 'S (80: 20)</td>
			<td>26.3 ± 0,2</td>
			<td>0,26 ± 0,03</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/HD-PI (4,5) P2 (95: 5)</td>
			<td>26.5 ± 0,5</td>
			<td>0.31 ± 0,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/pop/Chol (60: 20: 20)</td>
			<td>29.2 ± 0,2</td>
			<td>0,45 ± 0.09</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/pop/PI (4,5) P2/Chol (60: 17: 3:20)</td>
			<td>29.6 ± 0,6</td>
			<td>0,43 ± 0,10</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/DOPC/pop/PI (4,5) P2/Chol (37: 20: 20: 3:20)</td>
			<td>29.4 ± 0,4</td>
			<td>0.39 ± 0.14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: lipide gegevens van de samenstelling en vorming van de SLB 7 .

Watch this Scientific Journal Video about Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Reso

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Hier presenteren we een experimenteel protocol dat kan worden gebruikt om te bepalen van het bindende affiniteiten en de wijze van interactie van label-vrije fosfolipide-bindend-proteïne Annexine A2 met geïmmobiliseerdet solid-ondersteunde bilayers (SLB) door het meten van gelijktijdig de massale verbreiding en de visco-eigenschappen van het eiwit Annexine A2.

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Deze methode kan helpen bij het bestuderen van richtingen van eiwitten met lipidemembranen. In ons geval, gebruik het om de calciumafhankelijke binding van annexins te analyseren aan negatief geladen fosfolipiden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het label vrij, gevoelig, kwantitatief, en dat interacties kunnen worden waargenomen in real time.Aldus waardoor directe analyse van de werkelijke resultaten mogelijk is. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de interactie van meer complexe micromolecule assemblages of zelfs cellen. Gebruik duidelijke vijf millimolar lipide oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol.Combineer de opgeloste lipiden in de gewenste kiesverhouding in 10 milliliter glazen buizen. Verdamp de organische oplosmiddelen met behulp van een droge stroom stikstof. Laat het lipidemengsel drie uur op een hoog vacuümlyofielsysteem om eventuele restsporen van de oplosmiddelen te verwijderen.Nu, resuspend de lipide film in een milliliter citraat buffer. Broed de lipide suspensie bij 60 graden Celsius gedurende 30 minuten in een waterbad, vortexing het krachtig om de vijf minuten. Deze temperatuur ligt rond de 10 graden Celsius boven de faseovergangstemperatuur van de hoogste smeltende lipide in het mengsel.Verwarm ondertussen de extruder voor met een porie met een diameter van 50 nanometer die 30 minuten boven de overgangstemperatuur ligt. Laad de multilamellar vesicle suspensie in de voorverwarmde extruder. Steek het mengsel voorzichtig 31 keer door het polycarbonaatmembraan om kleine unilamellar vedels of SUV's te vormen.Houd de temperatuur boven de overgangstemperatuur. Breng de SUV-ophanging over op een twee milliliter kunststof reactievat en voeg de citraatbuffer toe om het uiteindelijke volume op twee milliliter te brengen. Incubeer vier sensoren die gedurende ten minste 30 minuten in een polytetrafluorethyleenhouder in een 2%SDS-oplossing worden geplaatst.Was ze vervolgens uitgebreid met ultra zuiver water om de SDS volledig te verwijderen en ze te proberen met behulp van een stroom van droge argon of stikstof. Gebruik een plasmareinigingssysteem om eventuele verontreinigingen volledig te verwijderen. Plaats hiervoor de droge sensoren in de plasmareinigingskamer, evacueer de kamer en spoel deze drie keer door met zuurstof.Zet vervolgens de plasmareiniger aan. Gebruik vacuüm, hoog radiofrequentievermogen en 10 minuten procestijd. Na de reinigingsrun schakelt u de machine uit en schakelt u de sensoren uit.Leg de plasma gereinigde sensoren voorzichtig aan in de vier stroomkamers met een pincet. Vermijd druk op of torsie van de kamers en buizen die kunnen leiden tot lekken. Spoel het systeem 10 minuten door met citratebuffer in de open flow-modus.Start het programma. Begin met het registreren van eventuele veranderingen in de frequentie en afvoer van de eerste fundamentele toon en boventonen met behulp van de software totdat de frequentie en dissipatie baselines stabiel zijn. Wanneer de basislijnen stabiel zijn, past u de SUV-vering toe in citrate buffer.Verwijder met behulp van een reactievat 1,5 milliliter van het dode volume en sluit het systeem vervolgens in de lusstroommodus. Nota van de frequentieafvoerverschuiving voor nog eens 10 minuten. Wanneer de SLB stabiel is, moet u het systeem gedurende 40 minuten in evenwicht brengen met een lopende buffer bij de vereiste calciumconcentraties in een open flow-modus.Voeg het eiwit toe aan de lopende buffer met calcium. Voer de toepassing van het eiwit uit in een lusstroommodus totdat een evenwichts steady state is bereikt. Nu, dissociaal het gebonden eiwit door chelating calcium ionen met vijf millimolar EGTA in de lopende buffer in open flow mode.Regenereer het microbalanssysteem met 50 milliliter dubbel gedestilleerd water in een continue open flow-modus. Haal de buizen uit de watercontainer en laat het systeem droog lopen. Verwijder de kristalsensor voorzichtig en maak deze schoon met een 2%SDS-oplossing met behulp van de polytetrafluorethyleenhouder.Droog de zichtbare delen van het binneninterieur van de stroommodule waar de sensor is geplaatst. Hier getoond, is de registratie van de frequentiecurve en dissipatie verschuivingen. De prominente daling van de frequentie bij de toevoeging van de liposomen, geeft hun absorptie aan omdat de met buffer gevulde vesikels niet stijf maar viscoelastisch zijn, de dissipatie neemt toe.Vervolgens scheuren de samensmeltende akels. De gelijktijdige afgifte van de buffer in de vesicles vermindert de adsorberende massa totdat een stabiel plateau is bereikt. De binding van bijlage A2 aan de lipiden voegt massa toe zoals blijkt uit de duidelijke frequentieverschuiving, maar verstoort niet de bilayerstructuur zoals aangegeven door de enige kleine verandering in dissipatie.Wanneer calciumion door het chelaatvormer wordt verwijderd, scheidt EGTA, bijlage A2 zich van de lipidefilm. De frequentie en de dissipatie-opnamen verschuiven naar de niveaus die bij de bilayer worden gezien en die alleen de bijlage in A2-binding aangeeft, is volledig afhankelijk van het calciumion en dat de lipidefilm intact blijft. Hier wordt een representatief negatief controleexperiment weergegeven.Wanneer fosphatidylserine afwezig is, zijn er geen veranderingen in frequentie of dissipatie zichtbaar na toevoeging van bijlage A2 in aanwezigheid van het calciumion. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om een goede bilayer formatie te waarborgen. Gebruik de liposomen onmiddellijk, anders zullen de kleine aluikels smelten in grotere met minder oppervlaktespanning die kan leiden tot een onstabiele basislijn.Na deze procedure kan een kwantitatieve beschrijving van een membraaneiwitinteractie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals coöperatieve versus niet-coöperatieve binding.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...