Name: dissipative microgravimetry to study the binding dynamics of the phospholipid binding protein annexin a2 to solid-supported lipid bilayers using a quartz resonator
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Reso

Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft subvenciones SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 y SFB 1348/A11.

Nota: Buffers deben filtrarse con un filtro de 0,22 μm y desgasificado al vacío durante 1 hora.
1. preparación de vesículas de lípidos
<ol><li>Utilizar tubos de vidrio de 2 mL. Disolver cada lípido, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (COP) y colesterol (Chol), en una mezcla de cloroformo / metanol (50: 50 v/v) para preparar una solución de lípidos de 5 mM transparente. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4,5) P2) se disuelven en una mezcla de Cloroformo/metanol/agua (20:9:1 v/v).</li>
	<li>Combinar los lípidos disueltos en la deseada relación molar de POPC/POPS (80/20), POPC/PI (4,5) P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (60/17/3/20) y POPC/DOPC/POPS/PI (4,5) P2() /Chol (37/20/20/3/20) Tabla 1) en tubos de vidrio de 10 mL. Nota: La cantidad final del total de lípidos es 500 μg.</li>
	<li>Se evaporan los disolventes orgánicos con corriente de nitrógeno seco. Dejar la mezcla de lípidos en un sistema de alto vacío (liofilización) durante 3 h para eliminar cualquier rastro residual de los solventes. Nota: Esto produce una película seca clara.</li>
	<li>Resuspender la película lipídica en 1 mL de tampón de citrato (10 mM-citrato de trisodio, 150 mM NaCl, pH 4.6). Incube la suspensión lipídica a 60 ° C (esta temperatura es alrededor de 10 ° C sobre la temperatura de transición de fase de los lípidos fusión más alto en la mezcla) durante 30 min en un baño de agua y agitar vigorosamente cada 5 min se. Nota: Esto resulta en la formación de vesículas grandes, multilamellar (MLV). Mantener la suspensión por encima de la temperatura de transición.</li>
	<li>Precaliente la extrusora (a 60 ° C en este caso) equipada con una membrana de policarbonato de tamaño de poro de 50 nm de diámetro superior a la temperatura de transición (que es aquí el 40-50 ° C) durante 30 minutos.</li>
	<li>Cargar la suspensión MLV en la extrusora precalentada y pasar suavemente la mezcla x 31 a través de la membrana de policarbonato para formar propiedades pequeñas vesículas (SUVs)14. Mantener la temperatura por encima de la temperatura de transición.</li>
	<li>Transferir la suspensión SUV a un recipiente de reacción de plástico de 2 mL y añadir el tampón de citrato (ver paso 1.4) para hacer el volumen final de 2 mL. Nota: Esto producirá una concentración de lípidos final de 250 μg/mL.</li>
</ol>2. manejo de los sensores de cuarzo
Nota: Manipule siempre los sensores de cuarzo con una pinza.
<ol><li>Incubar a cuatro sensores insertan en un soporte de politetrafluoroetileno en una solución de SDS 2% ≥ 30 minutos lava de les extensivamente con agua ultra puro para completamente eliminar el SDS y dejarlos secar con un chorro de argón seco o nitrógeno.</li>
	<li>Utilizar un sistema de limpieza por plasma para eliminar cualquier contaminante. Inserte los sensores seco en la cámara de limpieza por plasma, evacuar la cámara y lavar 3 x con oxígeno. Gire el plasma de la aspiradora. Utilice los siguientes parámetros: 1 x 10-4 Torr presión, energía de alta frecuencia de radio (RF) y a 10 min de tiempo de proceso. Apague la máquina y sacar los sensores.</li>
</ol>3. microbalanza operación
Nota: Se utilizó un sistema de microbalanza con cuatro cámaras de flujo con control de temperatura en una configuración paralelo, conectado a una bomba peristáltica y configurado a un caudal de 80 μl/min. En el modo de flujo abierto, el búfer se bombea del depósito alimentador en el tanque de recepción. En el modo de bucle, el tanque de recepción fue conectado con el depósito alimentador para generar un bucle cerrado. Se ajusta la temperatura a 20 ° C.
<ol><li>Muelle cuidadosamente el plasma limpiado los sensores en las cámaras de 4 flujo, con unas pinzas. Evitar cualquier presión o torsión de las cámaras y los tubos que puedan causar fugas.</li>
	<li>Lave el sistema con tampón de citrato (10 mM-citrato de trisodio, 150 mM NaCl, pH 4.6) en el modo de flujo abierto durante 10 minutos. Nota: Esto requiere exactamente 3,2 mL de tampón, pero es recomendable utilizar un exceso de buffer (10 mL).</li>
	<li>Inicie el programa. Iniciar la grabación de los cambios en la frecuencia y la disipación del primer tono fundamental (n = 1) y armónicos (n = 3-13) con el software, hasta las instantáneas de la frecuencia y la disipación son estables (esto tardará alrededor de 40-60 min). Nota: Los niveles de ruido de frecuencia (pico a pico) deben ser inferiores a 0,5 Hz y, para la disipación, inferior 0.1·10-6, con una deriva máxima (en solución acuosa) de 1 Hz por hora en frecuencia y 0.3·10/h-6en la disipación.</li>
	<li>Cuando las líneas de base son estables, se aplica la suspensión SUV en tampón de citrato (2 mL en un tubo pequeño). Utilizando un recipiente de la reacción, quitar 1,5 mL del volumen muerto. Luego cerrar el sistema en el modo de flujo de lazo. Registrar el cambio de frecuencia/disipación por otros 10 minutos. Nota: Durante este tiempo, las vesículas se extendió sobre la superficie de SiO2 y fusible para formar una bicapa continua15,16 (paso 2 en las figuras 1, figura 2y figura 3). La adsorción de SUVs en la superficie del sensor es dos fases y tiene una típica frecuencia mínima y máxima en la disipación. Una base estable de frecuencia/disipación nuevo con un cambio de la frecuencia característica (dependiendo de la composición de lípido) de 26-29 Hz (ver tabla 1) indica una bicapa continua en la superficie.</li>
	<li>Cuando el SLB es estable (ver paso 3.4), equilibrar el sistema con el buffer corriente (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) en el Ca2 + concentraciones requeridas (desde 50 μm a 1 mM CaCl2, según el experimento) en forma de flujo abierto de 40 min.</li>
	<li>Añadir la proteína (aquí, AnxA2) para el funcionamiento del almacenador intermediario que contiene Ca2 + (ver paso 3.5). Realizar la aplicación de la proteína en modo loop flujo hasta alcanzar un estado de equilibrio estacionario (paso 3 en la figura 1, figura 2y figura 3). Nota: La concentración de proteína puede variar de 1 a 400 nM. Adsorción de proteínas resulta en un cambio de frecuencia dependiente de la concentración, que refleja la absorción de masa (proteína).</li>
	<li>Disocia la proteína encuadernada por quelantes de iones de Ca2 + con 5 mM EGTA en el búfer de ejecución en modo de flujo abierta (paso 4 en las figuras 1 y figura 2). Nota: Una recuperación de la frecuencia y la disipación a la línea de base SLB indica una reversibilidad total de la Unión a proteínas. Ciclos de asociación-disociación se pueden repetir para comparar diferentes concentraciones o proteínas.</li>
</ol>4. limpieza de microbalanza
Nota: Realizar un mínimo procedimiento de limpieza después de cada medición.
<ol><li>Regenerar el sistema de la microbalanza con 50 mL de ddH2O en modo de flujo continuo abierto, retirar los tubos del envase del agua y deje que el sistema funcione en seco.</li>
	<li>Con cuidado retire el sensor de cristal y limpiar con la solución de SDS 2% utilizando el soporte del politetrafluoetileno (vea el paso 2.1).</li>
	<li>Secar las partes visibles del interior de módulo de flujo donde se colocó el sensor. Nota: Realizar una intensiva limpieza después de una serie de 10 mediciones.</li>
	<li>Limpie el sistema con una solución de SDS 2% (50 mL) a 40 ° C (instalación del software) en modo de flujo continuo abierto (tubo), con un caudal de 20 μl/min para el contacto prolongado con el detergente.</li>
	<li>Limpie con 250 mL de ddH2O en el modo de flujo continuo abierto con un caudal de 160 μl/min. Nota: Después de 4 meses, llevar a cabo un extenso procedimiento de limpieza según el manual del fabricante.</li>
</ol>

<ol>
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S., Xi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+crystal+microbalance:+Sensing+cell-substrate+adhesion+and+beyond.">Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).</li><li>Bragazzi, N. L., et al., Donev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Crystal+Microbalance+(QCM)+for+Public+Health:+An+Overview+of+Its+Applications.">Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications.</a> Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 101, 149-211 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para responder preguntas acerca de la relación estructura-función de las membranas celulares de manera cuantitativa y cualitativa, célula biología ganancias enormemente de la utilización de métodos biofísicos en basan bien establecidas y ampliamente utilizan técnicas , incluyendo atómica microscopía (AFM), resonancia de plasmón superficial (SPR), la fuerza y la técnica de QCM-D empleada aquí. Hemos demostrado en estudios anteriores que se unen a proteínas anexinas en Ca2 +-manera dependiente a la membrana inmovilizada con alta afinidad. Utilizamos frecuencias y disipación de turnos de los armónicos 7 (Δf7) porque esta representa el mejor compromiso de detección sensibilidad y oscilación estabilidad.
Esta técnica también permite una descripción cuantitativa de la interacción de la proteína de la membrana. AnxA2 Unión a la membrana se caracteriza por cooperatividad positiva que es mediada por el dominio conservado de núcleo anexina y depende de la presencia de colesterol. Los datos cuantitativos obtenidos para AnxA2 y AnxA8 están registrados en detallan en otra parte6,8.
Hay muchos pasos críticos en este protocolo. Uso de los liposomas inmediatamente; de lo contrario, podrían fusible de pequeñas vesículas en vesículas más grandes con menos tensión de la superficie, conduciendo a la inhibición de la formación de la bicapa de lípidos. Mantener una temperatura constante durante las mediciones. Cada pequeña desviación en la temperatura resulta en un cambio de frecuencia y disipación no despreciable. Evitar burbujas de aire; de lo contrario, el sistema es inestable y no establecerá una línea de base.
La ecuación de Keiser permite la conversión directa de la frecuencia observada cambia en los cambios en masa y por lo tanto, es ampliamente utilizado. Sin embargo, la asunción de una correlación lineal entre el cambio en la frecuencia de resonancia y la masa adicional sólo es válida para componentes formando una película rígida y uniforme en la superficie del sensor. La ecuación de Keiser no puede utilizarse para viscoelástico adsorbentes tales como películas de proteína rica en agua, capas de lípidos con agua incorporada, o incluso adsorbe las células. Aquí, se requieren modelos matemáticos más complejos. Por lo tanto, es extremadamente importante controlar simultáneamente los cambios en frecuencia y disipación. Para detectar cambios estructurales durante la medición, se pueden trazar relaciones de ΔD frente a Δf, con una línea recta no indicando ningún cambio conformacional.
Una gran ventaja de esta técnica es la posibilidad de utilizar una gama muy amplia de materiales como sustratos. Por otra parte, es un método confiable y directo para el estudio de una amplia gama de interacciones macromoleculares, como la formación adecuada de las películas de recubrimiento de la superficie (como SLB), así como de otras interacciones proteína-lípido, puede ser monitoreado en línea.
Este protocolo puede ser aplicado a otras proteínas de membrana interactuando, por ejemplo, la barra de proteínas de dominio19, la ERM (ezrin, radixin y moesin) familia de proteínas que tiene un papel importante en la membrana-citoesqueleto acoplamiento20,21 ,22, o proteínas que contienen dominios C2 o el PH. Por otra parte, una amplia gama de aplicaciones de esta técnica para el estudio de materiales biológicos ha sido con éxito publicada, como una plataforma experimental adecuada para el estudio de las interacciones de asambleas macromoleculares más complejas o incluso estableciendo QCM las células de23,24.

Las membranas celulares son estructuras muy dinámicas y complejas. La mezcla compuesta de lípidos de membrana, junto con proteínas de la membrana periférica o integralmente asociados, Monte en forma microdominios. La organización tempo-espacial coordinada de estos microdominios de membrana está implicada en procesos fisiológicos fundamentales1. Membrana microdomain dinámica es conducido por la interacción de los lípidos de membrana, así como por la capacidad de las proteínas de la membrana periférica para reconocer e interactuar con lípidos enriquecidos en los microdominios. El reclutamiento de las proteínas de los lípidos específicos suele ser alcanzado a través de lípidos-módulos de reconocimiento, tales como la homología de pleckstrin (PH) o los dominios C22,3. Métodos de análisis biofísicos con membranas modelo son clave para entender los principios fundamentales que rigen estos procesos a nivel molecular.
Anexinas, una gran familia de multigene, son bien conocidos por su capacidad enlazar a lípidos de la membrana negativamente cargada, predominante de fosfatidilserina (PS), en un Ca2 +-controlado de la forma2. El segundo sello de la familia de la anexina es la presencia de un segmento estructural conservada, la anexina repetir, es decir presente cuatro u ocho veces y alberga el Ca2 +- y de sitios de unión a fosfolípidos4. El Ca2 +-interacción lípido dependiente coloca las anexinas en una posición perfecta para sentir y transmitir Ca2 +-mediada de señalización a las membranas del destino. Constantemente, anexinas son capaces de inducir la formación de microdominios enriquecidos en colesterol, fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato (PI (4,5) P2) y PS, en la membrana celular y artificial sistemas5. Este protocolo describe un enfoque para analizar la interacción de membrana anexina con una disipación de la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM-D)6,7,8.
El componente básico de este microbalanza es un cristal oscilante que sirve como la superficie del sensor. La adsorción o atascamiento de las moléculas de la superficie del sensor disminuye la frecuencia de resonancia (f) proporcional al aumento en la masa. Si la superficie es uniformemente cubierto con una película, la Unión de sustancias adicionales puede interferir con la integridad estructural de esta capa, y pueden controlarse además tales cambios en viscoelasticidad (el factor D de la disipación energética). Esta es una técnica generalizada para el estudio de la interacción de proteínas con bicapas de lípidos. En este enfoque, vesículas de lípidos se absorben en la superficie del sensor adecuadamente cubierto. Formación de bilayer del lípido es favorable en materiales basados en sílice9,10, como las vesículas no rompen a menudo en otras superficies hidrofílicas, como oro11 oxidado después de exposición al UV-ozono, TiO212o Al 2O313. La ruptura de las vesículas coalescentes lanza la fase acuosa, conduciendo a cambios característicos en la masa y disipación. La generación de apoyo sólido bicapas (SLB) por fusión de la vesícula es simple y robusto y puede utilizarse para generar modelos complejos que imitan a las membranas celulares.
Microbalanza disipante cristal de cuarzo es una técnica sensible y sin etiqueta. Una gran ventaja es la posibilidad de cubrir cualquier material que genera una película lo suficientemente fina en la superficie, proporcionando una amplia gama de aplicaciones en áreas de investigación diversas. La interacción de la proteína de la membrana se observa en tiempo real, y los resultados pueden ser analizados directamente. La misma superficie del sensor puede ser utilizada en mediciones sucesivas (después de realizar una limpieza mínima como se describe en este protocolo), permitiendo así precisos controles internos y una comparabilidad entre los analitos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calciumchloride</td>
			<td style="width:163px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">017-013-00-2</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">4432.1</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DOPC</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0878</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">PiP2</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">850155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">POPC</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">POPS</td>
			<td style="width:163px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840034P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiumchloride</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:163px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trisodium citrate</td>
			<td style="width:163px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder Liposofast</td>
			<td style="width:163px;">Avestin</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qsense E4 Analyzer</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QSense Dfind</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump IPC 4</td>
			<td style="width:163px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM 930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm</td>
			<td style="width:163px;">Qsense</td>
			<td style="width:119px;">QSX 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PC Membranes 0.05&#956;m</td>
			<td style="width:163px;">Avanti polar lipids</td>
			<td style="width:119px;">610003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro</td>
			<td style="width:163px;">OriginLab Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Version 8 and 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissipative microgravimetry to study the binding dynamics of the phospholipid binding protein annexin a2 to solid-supported lipid bilayers using a quartz resonator

La técnica de microbalanza disipante cristal de cuarzo es un enfoque simple y sin etiqueta para medir simultáneamente las propiedades de masa absorción y viscoelásticas de la masa absorbida/inmovilizado en las superficies de sensor, lo que permite las mediciones de la interacción de proteínas con superficies de apoyo sólido, como bicapas de lípidos, en tiempo real y con una alta sensibilidad. Anexinas constituyen un grupo altamente conservado de fosfolípidos-proteínas que interactúan reversiblemente con la contiene carga negativa a través de la coordinación de iones calcio. Aquí, describimos un protocolo que se utilizó para analizar cuantitativamente la Unión de la anexina A2 (AnxA2) en bicapas lipídicas planares preparados sobre la superficie de un sensor de cuarzo. Este protocolo está optimizado para obtener datos reproducibles y robustos e incluye una descripción detallada paso a paso. El método puede aplicarse a otras proteínas de unión a membrana y la bicapa composiciones.

La disminución en la frecuencia resonante (Δf) se correlaciona de manera lineal con la masa adsorbida (Δm), según lo definido por la ecuación de Keiser. 17
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg">
Aquí, f es la frecuencia resonante, Cf es una constante que depende de las características geométricas y físicas del cuarzo dado y la frecuencia de resonancia, y A es la superficie del sensor.
En la mayoría de las aplicaciones, la capa adsorbida no es totalmente rígida pero viscoelástico. Amortiguación de la resultante de la oscilación del sensor de cuarzo se denomina disipación (D). La disipación monitoreada cambios (ΔD) se correlacionan con las propiedades viscoelásticas de la masa límite18 y define a continuación8.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg">
Aquí, Edisipado es la energía perdida durante el período de una oscilación y Eguardado es la energía total del sensor libremente oscilante.
Para analizar y cuantificar los parámetros de enlace, isotermas de frecuencia se derivan mediante la representación de los cambios de la frecuencia de equilibrio (ΔΔfe) contra las concentraciones de proteína. ΔΔfe se define como
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg">
Aquí, Δft1 representa el comienzo de la proteína de la adsorción y Δft2 el estado de equilibrio. Ajuste de curvas no lineales puede realizarse mediante una expansión de la colina de la ecuación de Langmuir de la siguiente manera6,8.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg">
Aquí, ΔΔfmáximo es de ΔΔfe de la concentración de proteína, resultando en el atascamiento máximo (saturación), Kd es la constante de disociación aparente de la proteína/membrana compleja, y n es el coeficiente de Hill.
El coeficiente de Hill (n) describe la cooperatividad de Unión. Para n = 1, el modelo de adsorción de colina es un simple isoterma de Langmuir (los sitios de Unión igual y todas las moléculas se unen independientemente uno del otro de la bicapa lipídica). Si n ≠ 1, un ligando enlazado cambia la membrana atar afinidad por otros ligandos, ya sea aumentando (n > 1, cooperatividad positiva) o disminuyendo (n < 1, la cooperatividad negativa) la afinidad.
La figura 1 muestra un esquema del flujo de trabajo experimental utilizado en nuestro laboratorio para medir los cambios en frecuencia y resonancia durante el Ca2 +-dependiente obligatorio y la liberación de AnxA2 a la bicapa lipídica en la fase líquida. Un registro de ejemplar se muestra en la figura 2. Figura 2 A muestra la grabación de la curva de frecuencia y 2 de la figuraB muestra los cambios de la disipación. La prominente caída en la frecuencia con la adición de liposomas (figura 2A [paso 1]) indica su adsorción. Porque las vesículas llenas de búfer no son rígidas, sino viscoelásticas, la disipación aumenta (figura 2B [paso 1]). Posteriormente, la ruptura de vesículas coalescentes. La concomitante liberación de la memoria intermedia dentro de las vesículas disminuye la masa adsorbida hasta alcanzar una meseta estable (figura 2A [paso 2]). De nota, además de vesículas resulta en un cambio de alta disipación, mientras que el cambio en respuesta a la bicapa es mucho menor debido a la naturaleza homogénea rígida de la SLB (figura 2B [paso 2]). Paso 3 en los registros figura 2A y 2B el atascamiento de AnxA2 a los lípidos, que agrega la masa, como se ve por el cambio de la frecuencia claro, pero no interfiere con la estructura de la bicapa, como se indica en el único cambio pequeño en la disipación. Cuando Ca2 + se elimina por el agente quelante EGTA (figura 1 y figura 2 [paso 4]), AnxA2 se disocia de la película de lípidos. Cambio de la frecuencia, así como las grabaciones de disipación, a los niveles vistos con la bicapa solamente (Comparar pasos 2 y 4 en la figura 2A y 2B), indicando que AnxA2 enlace es totalmente dependiente de Ca2 + y que la película de lípidos se mantiene intacta.
AnxA2, como más de las anexinas, depende de los lípidos cargados negativamente como PS Esto se ve claramente cuando aparece está ausente en la bicapa lipídica (figura 3). Figura 3 A muestra la grabación de la curva de frecuencia yB figura 3muestra los cambios de disipación. Nota que la frecuencia cambia a una línea base estable a-25 Hz, pero la disipación no es alterada (figura 3B [paso 2]), indicativo de una formación adecuada de la bicapa. Sin embargo, no hay cambios en la frecuencia (figura 3A) o disipación (figura 3B) se observan después de la adición de AnxA2 en presencia de Ca2 + (Figura 3A y 3B [paso 3]) o el EGTA (figura 3A y 3B [paso 4]), como AnxA2 no puede interactuar con la película lipídica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg"> Figura 1 : Modelo de gráfica de flujo experimental de. Este flujo de trabajo muestra la absorción de la vesícula a la superficie del sensor hidrofílico (paso 1), la fusión de vesículas, ruptura conduce a la formación de SLB (paso 2) y el Ca2 +-dependiente de adsorción (paso 3) y dependiente de la EGTA desorción de AnxA2 (paso 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg"> Figura 2 : Ejemplar grabación. Estos paneles muestran (A) el dependiente del tiempo de monitoreo de la frecuencia de resonancia de armónicos 7 y (B) la disipación de los cambios de los sensores de cuarzo durante la medición. La aplicación de los liposomas causa un rápido descenso en la línea base de frecuencia, mientras que la línea de base de disipación aumenta (paso 1). La estabilización de las líneas de base indica la formación de la bicapa (paso 2). El AnxA2 (200 nM) adsorción (en presencia de Ca2 +) en la bicapa lipídica que contiene COP agrega masa sin cambiar significativamente la disipación, lo que indica que la película de lípidos no es perturbada (paso 3). La recuperación de la referencia de frecuencia en Ca2 + quelación con EGTA indica la desorción total de la proteína (paso 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg"> Figura 3 : Experimento de control negativo, demostrando que AnxA2 no enlazar a SLBs en la ausencia de contaminantes orgánicos persistentes. Estos paneles muestran la adición de liposomas y la formación de SLB (pasos 1 y 2). No hay cambios en la frecuencia (A) o (B) disipación son evidentes después de la adición de AnxA2 (paso 3, 200 nM, en presencia de Ca2 +) o EGTA (paso 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Composición</td>
			<td>ΔΔF/Hz después de la formación de SLBs</td>
			<td>ΔΔD * 10-6 después de la formación de SLB</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPS (80: 20)</td>
			<td>26.3 ± 0,2</td>
			<td>0,26 ± 0,03</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/PI (4,5) P2 (95: 5)</td>
			<td>26.5 ± 0,5</td>
			<td>0.31 ± 0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPS/Chol (60: 20: 20)</td>
			<td>29.2 ± 0,2</td>
			<td>0.45 ± 0.09</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (60: 17: 3:20)</td>
			<td>29.6 ± 0.6</td>
			<td>0.43 ± 0.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>POPC/DOPC/POPS/PI (4,5) P2/Chol (37: 20: 20: 3:20)</td>
			<td>29,4 ± 0.4</td>
			<td>± 0.39 0.14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: datos de composición y formación de lípidos de la SLB 7 .

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Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Aquí, presentamos un protocolo experimental que se puede emplear para determinar las afinidades de Unión y modo de interacción de etiqueta-libre fosfolípido-proteína anexina A2 con bicapas de sólido apoyo inmovilizados (SLB) midiendo simultáneamente la absorción de masa y las propiedades viscoelásticas de la proteína anexina A2.

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Este método puede ayudar a estudiar las direcciones de las proteínas con membranas lipídicas. En nuestro caso, utilícelo para analizar la unión dependiente del calcio de las anexoínas a los fosfolípidos cargados negativamente. Las principales ventajas de esta técnica son que es libre de etiquetas, sensible, cuantitativa, y que las interacciones se pueden observar en tiempo real.Permitiendo así el análisis directo de resultados reales. Esta técnica también se puede aplicar a otros sistemas, como la interacción de conjuntos de micromoléculas más complejos o incluso celdas. Utilice soluciones claras de cinco lípidos militrolares como se describe en el protocolo de texto.Combine los lípidos disueltos en la proporción molar deseada en tubos de vidrio de 10 mililitros. Evaporar los disolventes orgánicos utilizando una corriente seca de nitrógeno. Deje la mezcla de lípidos en un sistema de liofilización de alto vacío durante tres horas para eliminar cualquier rastro residual de los disolventes.Ahora, resuspender la película de lípidos en un mililitro de tampón de citrato. Incubar la suspensión de lípidos a 60 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua, vórticándolo vigorosamente cada cinco minutos. Esta temperatura es de alrededor de 10 grados Celsius por encima de la temperatura de transición de fase del lípido de fusión más alto en la mezcla.Mientras tanto, precalentar el extrusor equipado con una membrana de policarbonato de 50 nanómetros de diámetro poro por encima de la temperatura de transición durante 30 minutos. Cargue la suspensión de vesícula multilamelar en el extrusor precalentado. Pase suavemente la mezcla 31 veces a través de la membrana de policarbonato para formar pequeñas vesículas unilamelares o SUVs.Mantenga la temperatura por encima de la temperatura de transición. Transfiera la suspensión SUV a un recipiente de reacción de plástico de dos mililitros y añada el tampón de citrato para llevar el volumen final a dos mililitros. Incubar cuatro sensores insertados en un soporte de politetrafluoroetileno en una solución 2%SDS durante al menos 30 minutos.A continuación, lavarlos extensamente con agua ultra pura para eliminar por completo el SDS y probarlos utilizando una corriente de argón seco o nitrógeno. Utilice un sistema de limpieza por plasma para eliminar por completo cualquier contaminante. Para ello, inserte los sensores secos en la cámara de limpieza de plasma, evacúe la cámara y eléjela tres veces con oxígeno.A continuación, encienda el limpiador de plasma. Utilice vacío, alta potencia de radiofrecuencia y 10 minutos de tiempo de proceso. Después de la limpieza, apague la máquina y saque los sensores.Acose cuidadosamente los sensores de plasma limpiado en las cuatro cámaras de flujo utilizando pinzas. Evite cualquier presión o torsión de las cámaras y tubos que puedan causar fugas. Enjuague el sistema con búfer de citrato en el modo de flujo abierto durante 10 minutos.Inicie el programa. Comience a registrar cualquier cambio en la frecuencia y la disipación del primer tono fundamental y los matices utilizando el software hasta que las líneas de base de frecuencia y disipación sean estables. Cuando las líneas base sean estables, aplique la suspensión SUV en el tampón de citrato.Con un recipiente de reacción, retire 1,5 mililitros del volumen muerto y, a continuación, cierre el sistema en el modo de flujo de bucle. Registre el cambio de disipación de frecuencia durante otros 10 minutos. Cuando el SLB es estable, equilibre el sistema con un tampón de funcionamiento a las concentraciones de calcio requeridas en un modo de flujo abierto durante 40 minutos.Agregue la proteína al tampón de funcionamiento que contiene calcio. Realice la aplicación de la proteína en un modo de flujo de bucle hasta que se alcance un estado estable de equilibrio. Ahora, disociar la proteína unida quelando iones de calcio con cinco EGTA milimétricas en el tampón de funcionamiento en modo de flujo abierto.Regenere el sistema de microbalance con 50 mililitros de agua doble destilada en un modo de flujo abierto continuo. Retire los tubos del recipiente de agua y deje que el sistema se seque. Retire cuidadosamente el sensor de cristal y límpielo con una solución 2%SDS utilizando el soporte de politetrafluoroetileno.Seque las partes visibles del interior del módulo de flujo donde se colocó el sensor. Aquí se muestra la grabación de la curva de frecuencia y los cambios de disipación. La caída prominente en la frecuencia sobre la adición de los liposomas, indica su absorción porque las vesículas llenas de tampón no son rígidas sino viscoelásticas, la disipación aumenta.Posteriormente, las vesículas coalestes se rompen. La liberación concomitante del tampón dentro de las vesículas disminuye la masa adsorbida hasta que se alcanza una meseta estable. La unión del Anexo A2 a los lípidos añade masa como se ve en el claro cambio de frecuencia, pero no interfiere con la estructura bicaplada como se indica por el único pequeño cambio en la disipación.Cuando el agente quelante elimina el iones de calcio, EGTA, Annexin A2 se disocia de la película lipídica. La frecuencia y las grabaciones de disipación cambian a los niveles observados con la bicaplaz que sólo indican que la unión del Anexo A2 depende totalmente del ion de calcio y que la película lipídica permanece intacta. Aquí se muestra un experimento representativo de control negativo.Cuando la fosfatidilserina está ausente, no hay cambios en la frecuencia o la disipación son evidentes después de la adición de La anexo A2 en presencia del ion de calcio. Al intentar este procedimiento, es importante asegurar la formación adecuada de la bicacapa. Utilice los liposomas inmediatamente, de lo contrario las vesículas pequeñas se fusionarán en las más grandes con menos tensión superficial que puede conducir a una línea de base inestable.Después de este procedimiento, se puede realizar una descripción cuantitativa de una interacción de proteína de membrana con el fin de responder a preguntas adicionales como la unión cooperativa versus no cooperativa.

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