Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

وحظيت الدراسة بدعم مالي من المركز الوطني للعلوم في بولندا (منحة رقم. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) وKNOW (مركز البحوث الوطنية الرائدة) الاتحاد العلمي "صحة الحيوان - الغذاء الآمن"، قرار وزارة العلوم والتعليم العالي رقم 05-1/KNOW2/2015

1. صيانة الثقافة
<ol><li>ثقافة خط الخلية P19 في صيانة المتوسطة (دولبكو تعديل النسر المتوسطة مع 4500 ملغ / لتر من الجلوكوز تستكمل مع 10٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين و 100 وحدة / مل ستربيميتوسين). حضانة في 37 درجة مئوية و5٪ CO 2.</li>
</ol>2. الخلايا الفرعية
<ol><li>عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ تقر?...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط لتكوين الأعصاب باستخدام خط الخلية P19. على الرغم من أن العديد من التقارير قد نشرت في هذا الصدد، لا تزال منهجية مفصلة للتحريض تكوين الأعصاب باستخدام خط الخلية P19 غير واضحة. وعلاوة على ذلك، استخدمنا الجلوكوز عالية بسيطة (4500 ملغ / لتر) DMEM المتوسطة مع 10٪ FBS للتجربة بأكم?...

أثناء النمو الجنيني، يتم تحويل طبقة خليةواحدة إلى ثلاث طبقات جرثومية منفصلة 1،2،3. ولزيادة إمكانيات البحث عن الظواهر التي تحدث في الجسم الحي، تم تطوير توليد المجاميع ثلاثية الأبعاد (الأجسام الجنينية) كنموذج ملائم. المجاميع الخلوية التي تتشكل بهذه الطريقة يمكن أن تتعرض لظروف مختلفة تسبب تمايز الخلايا، والتي تعكس تطور الجنين4،5. يستخدم خط الخلايا السرطانية الجنينية P19 murine (خط الخلية P19) عادة كنموذج خلوي لدراسات تكوين الأعصاب في المختبر6و7و8. يعرض خط الخلية P19 ميزات الخلايا الجذعية متعددة القوى النموذجية ويمكن أن تميز في الخلايا العصبية في وجود حمض الريتينويك (RA) أثناء تجميع الخلايا تليها نمو النيورايت في ظل ظروف الالتزام. وعلاوة على ذلك، فإن خط الخلية P19 غير المتمايزة قادر أيضا على تشكيل خلايا تشبه العضلات وعضلة القلب تحت تأثير كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)9،10،11،12.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من الطرق13،14،15،16 للتمايز العصبية ، ولكن المنهجية معقدة في بعض الأحيان وليس من السهل فهمها من خلال قراءة الأوصاف فقط. على سبيل المثال، تتطلب البروتوكولات في بعض الأحيان مزيجًا من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco (DMEM) المكمّل بمزيج من مصل العجل (CS) ومصل البقر الجنيني (FBS)13. وعلاوة على ذلك، غالبا ما تتكون وسائل الإعلام المستخدمة لتطوير الخلايا العصبية من المكملات العصبية وB2713،14،15،16. وعلى هذا النحو، فإن الأساليب القائمة تنطوي على تعقيد في إعدادها، وهدفنا هنا هو تبسيط البروتوكولات. في هذه الدراسة، أظهرنا أن DMEM مع FBS يمكن استخدامها للحفاظ على خط الخلية P19 (DMEM + 10٪ FBS) وكذلك لتطوير الخلايا العصبية (DMEM + 5٪ FBS + RA). هذه الطريقة المبسطة للتكوين العصبي باستخدام خط الخلية P19 يسمح لنا لدراسة الآلية الجزيئية لكيفية تطوير الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء البحوث على الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أيضا باستخدام خط الخلية P1917،18، ونعتقد أن الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة سوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية في تشوهات النمو العصبي والأمراض العصبية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

خط الخلية P19 المستمدة من سرطان التراتوسرطان الفأر المستمدة من الأجنة لديه القدرة على التمييز في الطبقات الجرثومية الثلاث. في وجود حمض الريتينويك (RA)، يتم حث خط الخلية P19 المعلق المستزرع للتمييز في الخلايا العصبية. يتم التحقيق في هذه الظاهرة على نطاق واسع كنموذج تكوين الأعصاب في المختبر. ولذلك، فإن خط الخلية P19 مفيد جدا للدراسات الجزيئية والخلوية المرتبطة تكوين الأعصاب. ومع ذلك، بروتوكولات للتمايز العصبية من خط الخلية P19 الموصوفة في الأدب معقدة جداً. الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة بسيطة وسوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية في تشوهات النمو العصبي والأمراض العصبية التنكسية.

وترد في الشكل 1المخطط المبسط للبروتوكول الخاص بتحريض تكوين الأعصاب في خط الخلية P19. من أجل تحديد طابع خط الخلية P19 في حالة غير متمايزة وخلال تكوين الأعصاب، تم استخدام طريقة RT-PCR (النسخ العكسي-polymerase) طريقة التفاعل المتسلسل. وأعرب خط الخلية P19 غير المتمايزة عن ...

Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

يستخدم خط الخلايا السرطانية الجنينية P19 (خط الخلية P19) على نطاق واسع لدراسة الآلية الجزيئية للتكوين العصبي مع تبسيط كبير بالمقارنة مع تحليل في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول ًا للتكوين العصبي الناجم عن حمض الريتينويك في خط الخلية P19.

تكوين الأعصاب باستخدام خلايا سرطان الجنين P19

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

ومن المعروف P19 خط الخلية للتمييز في الخلايا العصبية. ومع ذلك، بروتوكول لتمايز الخلايا العصبية من خط الخلية P19 معقدة في بعض الأحيان. هذه الطريقة تسمح لنا لأداء تجربة neurogenic بطريقة سهلة الاستعمال وتوسيع إمكانية استخدام خط الخلية P19 للمستقبل.للبدء، والحفاظ على الخلايا P19 في وسط الصيانة، وتتألف من DMEM، مع 4.5 غرام لكل لتر من الجلوكوز، تستكمل مع مصل الأبقار الجنين 10٪، 100 وحدة لكل المليلتر البنسلين، و 100 وحدة لكل ملليلتر الستريبتوميسين. احتضان ثقافة الخلية في بيئة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الخلايا هي ما يقرب من 80٪ التقاء. إزالة المتوسطة المستهلكة من قارورة ثقافة الخلية وغسل الخلايا مع ملليلتر اثنين من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني.إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين-EDTA لتغطية تماما أحادية من الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. تحت المجهر، تحقق لمعرفة ما إذا كانت جميع الخلايا منفصلة. resuspend الخلايا في تسعة ملليلتر من متوسطة الصيانة من أجل تحييد التربسين.نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لبيده الخلايا. ثم، pirate الماكر دون إزعاج بيليه. resuspend بيليه في 10 ملليلتر من وسط الصيانة الطازجة واستخدام عداد الخلية لتحديد رقم الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.بذور 20،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قارورة T-25 جديدة وإضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من متوسط الصيانة. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. لبدء عملية الهضم التربسين، أول التعرق ببطء supernatant وغسل الخلايا مع مليلتر اثنين من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني.ثم، إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين EDTA إلى الخلايا واحتضان لهم في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد الحضانة، لتحييد التربسين، resuspend الخلايا في تسعة ملليلتر من التمايز المتوسطة، وتتألف من DMEM مع مستوى الجلوكوز عالية ومكملة مع مصل الأبقار الجنين 5٪، 100 وحدة لكل المليلتر البنسلين، و 100 وحدة لكل ملليلتر ستريبتوميسين. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لبيده الخلايا.ثم, ببطء التعرق وssuspend بيليه في ملليلتر واحد من التمايز المتوسطة الطازجة دون RA. استخدم عداد خلية لتحديد رقم الخلية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. لتوليد المجموع، تبدأ بإضافة 10 ملليلتر من التمايز المتوسطة، تستكمل مع خمسة ميكرولترات من RA إلى 100 ملليلتر، طبق الثقافة غير المعالجة. بذور مليون خلية في طبق الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين من أجل تعزيز تشكيل الكلي.بعد الحضانة ، مع ماصة 10 ملليلتر ، pirate المتوسطة التي تحتوي على المجاميع ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة. انتظر لمدة 1.5 دقيقة للمجاميع لتستقر في الأسفل ثم تجاهل supernatant. إضافة 10 ملليلتر من التمايز الطازج المتوسطة تستكمل مع 0.5 RA ميكرومولار. بذور بلطف المجاميع في جديد 100 ملليمتر، طبق ثقافة غير المعالجة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين.للبدء، استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل مجاميع الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر. انتظر لمدة 1.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للمجاميع ليستقر في الجزء السفلي ثم تجاهل supernatant. غسل المجاميع مع الدم والمضادات الحيوية خالية DMEM.انتظر مجاميع الخلايا لتستقر في الأسفل، وتخلص من المابير، ثم أضف ميليلترين من 0.25٪ تريبسين EDTA. احتضان الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، والتنصت كل دقيقتين للحفاظ على الخلايا في التعليق. ثم، إضافة أربعة ملليلتر من متوسط الصيانة من أجل وقف نشاط التربسين والماصة صعودا وهبوطا 20 مرة باستخدام ماصة ملليلتر واحد.وأخيرا، الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إزالة نابير و resuspend بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من وسط الصيانة. استخدام عداد خلية لتحديد رقم الخلية والمضي قدما في طلاء الخلايا.إلى خلايا لوحة، أولا إضافة ثلاثة ملليلتر في بئر من متوسطة الصيانة إلى لوحة ثقافة ستة بئر. ثم، بذور الخلايا في كثافة 500،000 في البئر. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بذور الخلايا على غطاء النظارات في لوحة ثقافة ستة بئر. عندما تصل إلى التقاء 20٪، انتقل إلى المناعة مع الأجسام المضادة MAP2. ثم، عزل RNA، وتنفيذ النسخ العكسي PCR لـ MAP2، NueN، OCT4، NANOG، و GAPDH.في هذه الدراسة، يتم إدخال طريقة مبسطة للتمايز العصبي. يتم استزراع خط الخلايا P19 في طبق ثقافة غير معالج مع 5٪ FBS و 0.5 RA ميكرومولار. بعد أربعة أيام، يتم فصل مجاميع الخلية مع التربسين وبذر على لوحة ثقافة الخلية الملتزمة للأيام الأربعة المقبلة. يتم تقييم كفاءة هذا الأسلوب من خلال المقارنة بين تحليل RTPCR لخط الخلية P19 في حالة غير متمايزة وأثناء تولد الخلايا العصبية.تظهر النتائج انخفاضًا سريعًا في التعبير عن جينات القدرة المتعددة، مثل Oct4 و NANOG، وتراكم جينات العلامات النوراومية، مثل MAP2 وNN. ونحن نعتقد أن الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة بسيطة وسوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية لنشوء الخلايا العصبية، فضلا عن الأمراض العصبية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسات ما بعد الولادة تكوين الخلايا العصبية

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

نماذج الحادة والمزمنة من ارتفاع السكر في الدم في الزرد: وهناك طريقة لتقييم تأثير ارتفاع السكر في الدم على الخلايا العصبية و بيوديستريبوتيون من راديولابيلد الجزيئات

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...