Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

De studie werd financieel gesteund door het National Science Centre, Polen (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) en KNOW (leidend nationaal onderzoekscentrum) wetenschappelijk consortium "gezonde dieren veilig voedsel", besluit van het ministerie van Wetenschappen en hoger onderwijs No. 05-1/KNOW2/2015

1. cultuur onderhoud
<ol><li>Cultuur de P19 cellijn in onderhouds medium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium met 4.500 mg/L glucose aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden/mL penicilline en 100 eenheden/mL streptomycine). Incuberen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
</ol>2. subculturing cellen
<ol><li>Wanneer cellen ongeveer 80% samenloop bereiken, verwijdert u het verbruikte medium uit de celkweek kolven (oppervlakte 25 cm2).</li>
	<li>Was de cellen met 2 mL fosfaatgebufferde ...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor neurogenese met behulp van de P19 cellijn. Hoewel veel rapporten zijn gepubliceerd in dit verband, een gedetailleerde methodologie voor neurogenese inductie met behulp van P19 cellijn blijft onduidelijk. Bovendien gebruikten we een eenvoudige hoge glucose (4.500 mg/L) DMEM medium met 10% FBS voor het hele experiment. Dit liet ons toe om het neurogene experiment op een gebruiksvriendelijke manier uit te voeren en het gebruik van deze methode voor de toekomst uit te breiden.<...

Tijdens de embryonale ontwikkeling wordt een enkele cellaag omgezet in drie afzonderlijke kiem lagen1,2,3. Om de onderzoeksinspanningen van verschijnselen die zich in vivo voordoen te vergroten, is het genereren van driedimensionale aggregaten (embryonale lichamen) ontwikkeld als een handig model. Cellulaire aggregaten die op deze manier worden gevormd, kunnen worden blootgesteld aan verschillende aandoeningen die celdifferentiatie veroorzaken, die de ontwikkeling van het embryo4,5weerspiegelen. De P19 Murine embryonale carcinoom cellijn (P19 cellijn) wordt vaak gebruikt als een cellulaire model voor neurogenese studies in vitro6,7,8. De P19 cellijn vertoont typische pluripotente stamcel functies en kan zich onderscheiden in neuronen in de aanwezigheid van retinoïnezuur (RA) tijdens celaggregatie gevolgd door neuriet uitgroei onder aanhangers van voorwaarden. Bovendien is de ongedifferentieerde P19 cellijn ook in staat om spier-en cardiomyocyt-achtige cellen te vormen onder invloed van dimethylsulfoxide (DMSO)9,10,11,12.
Veel methoden13,14,15,16 zijn gemeld voor neuronale differentiatie, maar de methodologie is soms ingewikkeld en niet gemakkelijk te begrijpen door alleen het lezen van de beschrijvingen. Bijvoorbeeld, protocollen vereisen soms een combinatie van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met een mengsel van kalf serum (CS) en foetaal runderserum (FBS)13. Bovendien, media die worden gebruikt voor neuronale ontwikkeling zijn vaak samengesteld uit neurobasal en B27 supplementen13,14,15,16. Als zodanig, bestaande methoden bevatten complexiteit in hun voorbereiding en ons doel hier is om de protocollen te vereenvoudigen. In deze studie, we hebben aangetoond dat DMEM met FBS kan worden gebruikt voor het handhaven van de P19 cellijn (DMEM + 10% FBS) evenals voor neuronale ontwikkeling (DMEM + 5% FBS + RA). Deze vereenvoudigde methode voor neurogenese met behulp van de P19 cellijn stelt ons in staat om het moleculaire mechanisme van hoe neuronen worden ontwikkeld bestuderen. Bovendien, onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer wordt ook uitgevoerd met behulp van P19 cellijn17,18, en wij geloven dat de in deze studie ontwikkelde methode een rol zal spelen in het verhelderend moleculaire mechanismen in neuroontwikkelingsafwijkingen en neurodegeneratieve ziekten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

De P19 cellijn afgeleid van een muis embryo-afgeleid teratocarcinoom heeft de mogelijkheid om onderscheid te maken in de drie kiem lagen. In aanwezigheid van retinoïnezuur (RA), de suspensie gekweekte P19 cellijn wordt geïnduceerd om te differentiëren in neuronen. Dit fenomeen wordt uitgebreid onderzocht als een neurogenese-model in vitro. Daarom, de P19 cellijn is zeer nuttig voor moleculaire en cellulaire studies in verband met neurogenese. Echter, protocollen voor Neuronale Differentiatie van P19 cellijn beschreven in de literatuur zijn zeer complex. De methode die in deze studie is ontwikkeld, is eenvoudig en zal een rol spelen in het verhelderend zijn van de moleculaire mechanismen in neuroontwikkelingsafwijkingen en neurodegeneratieve ziekten.

Het vereenvoudigde schema van het protocol voor neurogenese inductie in P19 cellijn wordt weergegeven in Figuur 1. Om het karakter van de P19 cellijn in een ongedifferentieerde toestand en tijdens neurogenese te definiëren, werd de methode RT-PCR (reverse transcriptie-polymerase chain reaction) gebruikt. De ongedifferentieerde P19 cellijn uitgedrukt de pluripotentie genen zoals organische cation/carnitine transporter4 (Oct4) en nanog Homeobox (n...

Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

De P19 Mouse embryonale carcinoom cellijn (P19 cellijn) wordt veel gebruikt voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme van neurogenese met grote vereenvoudiging in vergelijking met in vivo analyse. Hier presenteren we een protocol voor retinoïnezuur-geïnduceerde neurogenese in de P19 cellijn.

Neurogenese met behulp van P19 embryonale carcinoom cellen

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

P19 cellijn is bekend te onderscheiden in neuronen. Echter, protocol voor neuron differentiatie van P19 cellijn zijn soms ingewikkeld. Deze methode stelt ons in staat om het neurogene experiment op een gebruiksvriendelijke manier uit te voeren en de mogelijkheid van het gebruik van P19-cellijn voor de toekomst uit te breiden.Om te beginnen, handhaven P19 cellen in onderhoud medium, bestaande uit DMEM, met 4,5 gram per liter glucose, aangevuld met 10% foetale runder serum, 100 eenheden per milliliter penicilline, en 100 eenheden per milliliter streptomycine. Incubeer de celcultuur in een 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide milieu totdat de cellen zijn ongeveer 80%confluent. Verwijder het gebruikte medium uit de celkweekkolf en was de cellen met twee milliliter calcium- en magnesiumvrije PBS.Voeg een milliliter van 0,25% trypsin-EDTA toe om de monolaag van de cellen volledig te bedekken en uit te broeden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee tot drie minuten. Controleer onder een microscoop of alle cellen los zijn. Resuspend de cellen in negen milliliter onderhoud medium om de trypsine te neutraliseren.Breng de cellen in een 15-milliliter buis en centrifuge op 200 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de cellen pellet. Dan, aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet. Resuspend de pellet in 10 milliliter vers onderhoudsmedium en gebruik een cel teller om het celnummer te bepalen volgens de instructies van de fabrikant.Zaad 20.000 cellen per vierkante centimeter in een nieuwe T-25 kolf en voeg tot 10 milliliter onderhoudsmedium toe. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee tot drie dagen. Om te beginnen trypsine spijsvertering, eerst langzaam aanzuigen van de supernatant en was de cellen met twee milliliter calcium en magnesium-vrije PBS.Voeg vervolgens een milliliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan de cellen en broed ze uit bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee tot drie minuten. Na de incubatie, om de trypsine te neutraliseren, de cellen opnieuw op te zetten in negen milliliter differentiatiemedium, bestaande uit DMEM met een hoog glucosegehalte en aangevuld met 5%foetaal runderserum, 100 eenheden per milliliter penicilline en 100 eenheden per milliliter streptomycine. Breng de cellen in een 15-milliliter buis en centrifuge op 200 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de cellen pellet.Dan, langzaam aspirate de supernatant en resuspend de pellet in een milliliter van verse differentiatie medium zonder RA. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen volgens de instructies van de fabrikant. Voor geaggregeerde generatie, beginnen met het toevoegen van 10 milliliter differentiatie medium, aangevuld met vijf microliter ra aan een 100-milliliter, niet-behandelde kweekschotel. Zaad een miljoen cellen in de kweekschaal en broed op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee dagen om de vorming van aggregaten te bevorderen.Na de incubatie, met een pipet van 10 milliliter, het medium met de aggregaten aanzuigen en overbrengen naar een buis van 15 milliliter bij kamertemperatuur. Wacht 1,5 minuten tot de aggregaten zich onderaan nestelen en gooi de supernatant weg. Voeg 10 milliliter vers differentiatiemedium toe, aangevuld met 0,5 micromolar RA. Zaad voorzichtig de aggregaten in een nieuwe 100-millimeter, niet-behandelde kweekschotel en incubbate bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee dagen.Gebruik om te beginnen een pipet van 10 milliliter om de celaggregaten over te brengen naar een buis van 15 milliliter. Wacht 1,5 minuten op kamertemperatuur voor de aggregaten te vestigen op de bodem en gooi de supernatant. Was de aggregaten met serum en antibioticavrije DMEM.Wacht tot celaggregaten zich onderaan vestigen, gooi de supernatant weg en voeg twee milliliter van 0,25% trypsin EDTA toe. Incubeer de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten, tikken om de twee minuten om de cellen in suspensie te houden. Voeg vervolgens vier milliliter onderhoudsmedium toe om de trypsineactiviteit en pipet 20 keer op en neer te stoppen met behulp van een pipet van één milliliter.Tot slot, centrifugeren de cellen op 200 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet in vijf milliliter onderhoud medium. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen en ga verder met het platbeteren van de cellen.Om cellen te plaat, eerst drie milliliter per put van onderhoud medium toe te voegen aan een zes-put cultuur plaat. Zaai vervolgens de cellen met een dichtheid van 500.000 per put. Broed de plaat uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Zaad de cellen op dekbril in een zes-put cultuurplaat. Wanneer ze 20% samenvloeiing bereiken, ga je over tot immunostaining met Anti-MAP2-antilichaam. Isoleer vervolgens RNA en voer reverse transcriptie PCR uit voor MAP2, NueN, OCT4, NANOG en een GAPDH.In deze studie wordt een vereenvoudigde methode voor neuronale differentiatie geïntroduceerd. De P19 cellijn is gekweekt in een niet-behandelde kweekschotel met 5%FBS en 0,5 micromolar RA. Na vier dagen worden de celaggregaten gescheiden met trypsine en de komende vier dagen op een aanhangende celkweekplaat gezaaid. De efficiëntie van deze methode wordt geëvalueerd door de vergelijking tussen RTPCR-analyse van de P19-cellijn in een ongedifferentieerde toestand en tijdens neurogenese.De resultaten tonen een snelle afname van de expressie van pluripotentiegenen, zoals Oct4 en NANOG, en upregulatie van neurnomale markergenen, zoals MAP2 en NeuN. Wij geloven dat de methode ontwikkeld in deze studie is eenvoudig en zal een rol spelen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen van neurogenese, evenals neurodegeneratieve ziekte.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis: een methode om de impact van hyperglycemie op neurogenese te beoordelen en de biodistributie van radiolabelde moleculen

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...