Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
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अध्ययन वित्तीय राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड द्वारा समर्थित किया गया था (नहीं अनुदान. UMO-2017/25/N/N/N/N/N/N/N/01886) और KNOW (लीडिंग नेशनल रिसर्च सेंटर) वैज्ञानिक कंसोर्टियम "स्वस्थ पशु - सुरक्षित खाद्य", विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय का निर्णय संख्या 05-1/

1. संस्कृति रखरखाव
<ol><li>रखरखाव माध्यम में P19 सेल लाइन संस्कृति (Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम के साथ 4,500 मिलीग्राम /L ग्लूकोज के साथ पूरक 10% FBS, 100 इकाइयों / 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट ।</li>
</ol>2. उप...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

यहाँ, हम Neurogenesis के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन P19 सेल लाइन का उपयोग कर. हालांकि इस संबंध में कई रिपोर्टों को प्रकाशित किया गया है, P19 सेल लाइन का उपयोग कर neurogenesis प्रेरण के लिए एक विस्तृत पद्धति स्पष्ट नहीं है. ?...

भ्रूणीय विकास के दौरान एकल कोशिका परत को तीन अलग -अलग रोगाणु परतों1,2,3में परिवर्तित कर दिया जाता है . विवो में होने वाली परिघटनाओं की अनुसंधान संभावनाओं को बढ़ाने के लिए त्रि-आयामी समुच्चयों (भ्रूण निकायों) का उत्पादन एक सुविधाजनक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है। इस प्रकार से बनने वाले कोशिकीय समुच्चयों को विभिन्न स्थितियों से अवगत कराया जा सकता है जिससे कोशिका विभेदन उत्पन्न होता है जो भ्रूण4,5के विकास को प्रतिबिंबित करती है. P19 murine भ्रूण कार्सिनोमा सेल लाइन (P19 सेल लाइन) आमतौर पर इन विट्रो6,7,8में neurogenesis अध्ययन के लिए एक सेलुलर मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है. P19 सेल लाइन ठेठ pluripotent स्टेम सेल सुविधाओं को दर्शाती है और रेटिनोइक एसिड की उपस्थिति में न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं (आरए) सेल एकत्रीकरण के दौरान पालन शर्तों के तहत neurite outgrowth द्वारा पीछा किया. इसके अलावा, अलग-अलग पी 19 सेल लाइन डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ)9,10,11,12के प्रभाव में मांसपेशियों और कार्डियोमायोसाइट जैसी कोशिकाओं को बनाने में भी सक्षम है।
कई तरीकों13,14,15,16 न्यूरॉन भेदभाव के लिए सूचित किया गया है, लेकिन पद्धति कभी कभी जटिल है और केवल विवरण पढ़ने से समझ में आसान नहीं है. उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल कभी कभी है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मध्यम बछड़ा सीरम (सीएस) और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)13के मिश्रण के साथ पूरक का एक संयोजन की आवश्यकता है. इसके अलावा, न्यूरोनल विकास के लिए इस्तेमाल किया मीडिया अक्सर neurobasal और B27 की खुराक से बना रहे हैं13,14,15,16. जैसे, मौजूदा तरीकों में उनकी तैयारी में जटिलता होती है और हमारा लक्ष्य यहाँ प्रोटोकॉल को सरल बनाना है। इस अध्ययन में, हम प्रदर्शन किया है कि FBS के साथ DMEM P19 सेल लाइन को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जा सकता (DMEM + 10% FBS) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन विकास के लिए (DMEM + 5% FBS + आरए). P19 सेल लाइन का उपयोग neurogenesis के लिए यह सरलीकृत विधि हमें कैसे न्यूरॉन्स विकसित कर रहे हैं की आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों पर अनुसंधान भी P19 सेल लाइन का उपयोग कर आयोजित किया जाता है17,18, और हमें विश्वास है कि इस अध्ययन में विकसित विधि स्पष्ट करने में एक भूमिका निभानी होगी neurodevelopmental असामान्यताओं और neurodegenerative रोगों में आणविक तंत्र.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

एक माउस भ्रूण व्युत्पन्न teratocarcinoma से व्युत्पन्न P19 सेल लाइन तीन रोगाणु परतों में अंतर करने की क्षमता है. रेटिनोइक एसिड (आरए) की उपस्थिति में, निलंबन सुसंस्कृत P19 सेल लाइन न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है। इस घटना को बड़े पैमाने पर इन विट्रो में एक neurogenesis मॉडल के रूप में जांच की है. इसलिए, P19 सेल लाइन आणविक और सेलुलर neurogenesis के साथ जुड़े अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है. तथापि, साहित्य में वर्णित P19 कोशिका रेखा के न्यूरोनल विभेदन के लिए प्रोटोकॉल बहुत जटिल हैं। इस अध्ययन में विकसित विधि सरल कर रहे हैं और neurodevelopmental असामान्यताएं और neurodegenerative रोगों में आणविक तंत्र स्पष्ट करने में एक भूमिका निभानी होगी.

पी 19 सेल लाइन में तंत्रिकाजनन प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल की सरलीकृत योजना चित्र 1में प्रस्तुत की गई है। एक अलग अलग राज्य में और neurogenesis के दौरान P19 सेल लाइन के चरित्र को परिभाषित करने के ...

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Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

P19 माउस भ्रूण कार्सिनोमा सेल लाइन (P19 सेल लाइन) व्यापक रूप से vivo विश्लेषण की तुलना में महान सरलीकरण के साथ neurogenesis के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ, हम P19 सेल लाइन में रेटिनोइक एसिड प्रेरित neurogenesis के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

न्यूरोजेनेसिस पी 19 भ्रूण कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

P19 सेल लाइन न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, P19 सेल लाइन के न्यूरॉन भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल कभी-कभी जटिल होते हैं। यह विधि हमें उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से न्यूरोजेनिक प्रयोग करने और भविष्य के लिए पी 19 सेल लाइन के उपयोग की संभावना का विस्तार करने की अनुमति देती है।शुरू करने के लिए, रखरखाव माध्यम में P19 कोशिकाओं को बनाए रखें, जिसमें डीएमईएम शामिल है, जिसमें ग्लूकोज के प्रति लीटर 4.5 ग्राम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 इकाइयों प्रति मिलीलीटर पेनिसिलिन, और 100 इकाइयों प्रति मिलीलीटर स्ट्रेप्टॉमीसिन के साथ पूरक है। कोशिकाओं को लगभग 80% कॉन्फ्ल्यूंट होने तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण में सेल संस्कृति को इनक्यूबेट करें। सेल कल्चर फ्लास्क से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस के दो मिलीलीटर से धोएं।कोशिकाओं के मोनोलेयर को पूरी तरह से कवर करने और दो से तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करने के लिए 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का एक मिलीलीटर जोड़ें। एक माइक्रोस्कोप के तहत, यह देखने के लिए जांचें कि क्या सभी कोशिकाएं अलग हैं। ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए रखरखाव माध्यम के नौ मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कोशिकाओं को 200 गुना जी और कमरे के तापमान पर 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। फिर, पैलेट को परेशान किए बिना अधिनाट करें। ताजा रखरखाव माध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल नंबर निर्धारित करने के लिए सेल काउंटर का उपयोग करें।बीज 20, 000 कोशिकाओं प्रति वर्ग सेंटीमीटर एक नया टी-25 फ्लास्क में और रखरखाव माध्यम के 10 मिलीलीटर तक जोड़ें । दो से तीन दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5 फीसद कार्बन डाई ऑक्साइड पर इनक्यूबेट। ट्राइप्सिन पाचन शुरू करने के लिए, सबसे पहले धीरे-धीरे सुपरनेट को एस्पिएरेट करें और कोशिकाओं को कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त पीबीएस के दो मिलीलीटर से धोएं।फिर, कोशिकाओं में 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए का एक मिलीलीटर जोड़ें और उन्हें दो से तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए, सात मिलीलीटर विभेदन माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, जिसमें उच्च ग्लूकोज स्तर के साथ डीएमईएम शामिल है और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 इकाइयों प्रति मिलीलीटर पेनिसिलिन, और 100 इकाइयों प्रति मिलीलीटर स्ट्रेप्टॉमीसिन के साथ पूरक है। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कोशिकाओं को 200 गुना जी और कमरे के तापमान पर 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें।फिर, धीरे-धीरे सुपरनेट को एस्पिरेट करें और आरए के बिना ताजा विभेदन माध्यम के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल नंबर निर्धारित करने के लिए सेल काउंटर का उपयोग करें। कुल पीढ़ी के लिए, 10 मिलीलीटर विभेदन माध्यम जोड़कर शुरू करें, 100 मिलीलीटर, गैर-उपचारित संस्कृति पकवान में आरए के पांच माइक्रोलीटर के साथ पूरक करें। कुल गठन को बढ़ावा देने के लिए दो दिनों के लिए संस्कृति पकवान और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर १,०,० कोशिकाओं बीज ।इनक्यूबेशन के बाद, 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ, समुच्चय युक्त माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे कमरे के तापमान पर 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। नीचे बसने के लिए समुच्चय के लिए 1.5 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर सुपरनैंट को त्यागें। 0.5 माइक्रोमोलर आरए के साथ ताजा विभेदन माध्यम पूरक के 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे से एक नया १०० मिलीमीटर, गैर इलाज संस्कृति पकवान और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो दिनों के लिए इनक्यूबेट में समुच्चय बीज ।शुरू करने के लिए, सेल को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 10-मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। नीचे बसने के लिए समुच्चय के लिए कमरे के तापमान पर 1.5 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर सुपरनैंट को त्यागें। सीरम और एंटीबायोटिक मुक्त डीएमईएम के साथ समुच्चय को धोएं।नीचे बसने के लिए सेल समुच्चय की प्रतीक्षा करें, सुपरनैट को त्यागें, और 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ें। 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में ट्यूब इनक्यूबेट, हर दो मिनट दोहन के लिए निलंबन में कोशिकाओं को रखने के लिए । फिर, ट्राइपसिन गतिविधि को रोकने के लिए रखरखाव माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें और एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके 20 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।अंत में, 200 गुना जी और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट निकालें और मेंटेनेंस मीडियम के पांच मिलीलीटर में सेल पेलेट को रीसस्ट करें। सेल नंबर निर्धारित करने और कोशिकाओं को चढ़ाना के साथ आगे बढ़ने के लिए एक सेल काउंटर का उपयोग करें।प्लेट कोशिकाओं के लिए, पहले एक छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के लिए रखरखाव माध्यम के अच्छी तरह से प्रति तीन मिलीलीटर जोड़ें । फिर, कोशिकाओं को 500, 000 प्रति कुएं के घनत्व पर बीज करें। थाली को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें।एक छह अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में कवर चश्मे पर कोशिकाओं बीज । जब वे 20% संगम तक पहुंचते हैं, तो एंटी-MAP2 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसदात करने के लिए आगे बढ़ें। फिर, आरएनए को अलग करें, और MAP2, NueN, OCT4, NANOG और एक GAPDH के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर करें।इस अध्ययन में, न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक सरलीकृत विधि शुरू की गई है। P19 सेल लाइन 5% FBS और 0.5 माइक्रोमोलर आरए के साथ एक गैर-इलाज संस्कृति पकवान में सुसंस्कृत है। चार दिनों के बाद, सेल समुच्चय को ट्राइप्सिन के साथ अलग किया जाता है और अगले चार दिनों के लिए एक अनुयायी सेल संस्कृति प्लेट पर वरीयता प्राप्त होता है। इस विधि की दक्षता का मूल्यांकन पी 19 सेल लाइन के आरटीपीसीआर विश्लेषण के बीच तुलना द्वारा एक अविभेदित राज्य में और न्यूरोजेनेसिस के दौरान किया जाता है।परिणाम Oct4 और NANOG जैसे pluripotency जीन की अभिव्यक्ति की तेजी से कमी दिखाते हैं, और MAP2 और NeuN जैसे न्यूनोमल मार्कर जीन के अपरेगुलेशन । हमारा मानना है कि इस अध्ययन में विकसित विधि सरल है और न्यूरोजेनेसिस के आणविक तंत्र, साथ ही न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग को स्पष्ट करने में एक भूमिका निभाएगी।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन के लिए Organotypic स्लाइस संस्कृति

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish Photoconvertible PSmOrange प्रणाली का प्रयोग में कोशिकाओं की ट्रैकिंग

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

माउस एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन के एक transposon प्रणाली का प्रयोग

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Zebrafish में हाइपरग्लेसेमिया के तीव्र और क्रोनिक मॉडल: न्यूरोजेनेसिस पर हाइपरग्लेसेमिया के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विधि और रेडियोलैलेबेड अणुओं के बायोडायविस्ट्रीशन

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

क्षैतिज पूरे माउंट: मोटा, तीन आयामी ऊतक के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 और Laminin एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कंकाल मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं की पहचान

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

पराबैंगनी-सी (यूवी-सी) क्षति के जवाब में प्राथमिक माउस नेत्र सतह कोशिकाओं/स्टेम सेल में ऑक्सीडेटिव क्षति का आकलन

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...