Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Lo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Centro nazionale di scienze, Polonia (n. di sovvenzione. UMO-2017/25/N/N/N-N/3/01886) e KNOW (Leading National Research Centre) Consorzio scientifico "Animale sano - Cibo sicuro", decisione del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore n. 05-1/KNOW2/2015

1. Manutenzione della cultura
<ol><li>Cultura la linea cellulare P19 in Maintenance Medium (il mezzo di Aquila modificato di Dulbecco con 4.500 mg/L di glucosio integrato con 10% FBS, 100 unità / mL penicillina e 100 unità / mL streptomicina). Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.</li>
</ol>2. Cellule sottocoltura
<ol><li>Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo esaurito dai flaconi di coltura cellulare (superficie 25 cm2).</l...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

Qui, descriviamo un semplice protocollo per la neurogenesi usando la linea cellulare P19. Anche se molti rapporti sono stati pubblicati a questo proposito, una metodologia dettagliata per l'induzione della neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 rimane poco chiara. Inoltre, abbiamo utilizzato un semplice mezzo DMEM ad alto glucosio (4.500 mg/L) con 10% FBS per l'intero esperimento. Questo ci ha permesso di eseguire l'esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere l'uso di questo metodo per il futuro.</...

Durante lo sviluppo embrionale, uno strato a cella singola viene trasformato in tre strati germinali separati1,2,3. Per aumentare le possibilità di ricerca dei fenomeni che si verificano in vivo, la generazione di aggregati tridimensionali (corpi embrionali) è stata sviluppata come un modello conveniente. Gli aggregati cellulari formati in questo modo possono essere esposti a varie condizioni causando differenziazione cellulare, che riflettono lo sviluppo dell'embrione4,5. La linea cellulare p19 murina carcinoma embrionale (linea cellulare P19) è comunemente usata come modello cellulare per studi di neurogenesi in vitro6,7,8. La linea cellulare P19 presenta le caratteristiche tipiche delle cellule staminali pluripotenti e può differenziarsi in neuroni in presenza di acido retinoico (RA) durante l'aggregazione cellulare seguita da escrescenza neurite in condizioni aderenti. Inoltre, la linea cellulare P19 indifferenziata è anche in grado di formare cellule muscolo-e cardiomiociti-come sotto l'influenza di solforo dimetilo (DMSO)9,10,11,12.
Molti metodi13,14,15,16 sono stati segnalati per la differenziazione neuronale, ma la metodologia è a volte complicata e non facile da comprendere leggendo solo le descrizioni. Ad esempio, i protocolli a volte richiedono una combinazione del mezzo DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco,minedante, integrato con una miscela di siero di vitello (CS) e siero bovino fetale (FBS)13. Inoltre, i media utilizzati per lo sviluppo neuronale sono spesso composti da Neurobasal e B27 integratori13,14,15,16. Come tale, i metodi esistenti contengono complessità nella loro preparazione e il nostro obiettivo qui è quello di semplificare i protocolli. In questo studio, abbiamo dimostrato che DMEM con FBS può essere utilizzato per mantenere la linea cellulare P19 (DMEM - 10% FBS) così come per lo sviluppo neuronale (DMEM - 5% FBS - RA). Questo metodo semplificato per la neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 ci permette di studiare il meccanismo molecolare di come vengono sviluppati i neuroni. Inoltre, la ricerca sulle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer è condotta anche utilizzando la linea cellulare P1917,18, e crediamo che il metodo sviluppato in questo studio giocherà un ruolo nel chiarire il meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

La linea cellulare P19 derivata da un teratocarcinoma derivato da un embrione di topo ha la capacità di differenziarsi nei tre strati germinali. In presenza di acido retinoico (RA), la linea cellulare P19 coltivata in sospensione è indotta a differenziarsi in neuroni. Questo fenomeno è ampiamente studiato come un modello di neurogenesi in vitro. Pertanto, la linea cellulare P19 è molto utile per gli studi molecolari e cellulari associati alla neurogenesi. Tuttavia, i protocolli per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 descritti nella letteratura sono molto complessi. Il metodo sviluppato in questo studio è semplice e giocherà un ruolo nel chiarire i meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.

Lo schema semplificato del protocollo per l'induzione della neurogenesi nella linea cellulare P19 è presentato nella Figura 1. Per definire il carattere della linea cellulare P19 in uno stato indifferenziato e durante la neurogenesi, è stato utilizzato il metodo RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). La linea cellulare P19 indifferenziata esprimeva i geni di pluripotenza come cation organica/carnitina trasportatore4 (Oct4) e Omeo...

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Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

La linea cellulare del carcinoma embrionale del topo P19 (linea cellulare P19) è ampiamente utilizzata per studiare il meccanismo molecolare della neurogenesi con grande semplificazione rispetto all'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo per la neurogenesi indotta da acido retinoico nella linea cellulare P19.

Neurogenesi con cellule carcinoma embrionale P19

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

La linea cellulare P19 è nota per differenziarsi in neuroni. Tuttavia, il protocollo per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 è talvolta complicato. Questo metodo ci consente di eseguire l'esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere la possibilità di utilizzare la linea cellulare P19 per il futuro.Per iniziare, mantenere le cellule P19 nel mezzo di manutenzione, composto da DMEM, con 4,5 grammi per litro di glucosio, integrato con siero bovino fetale al 10%, 100 unità per penicillina millilitro e 100 unità per streptomicina millilitro. Incubare la coltura cellulare in un ambiente di 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule non sono circa l'80% confluenti. Rimuovere il mezzo trascorso dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con due millilitri di calcio e PBS privo di magnesio.Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside-EDTA per coprire completamente il monostrato delle cellule e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due o tre minuti. Al microscopio, verificare se tutte le cellule sono staccate. Rimorsiva le cellule in nove millilitri di mezzo di manutenzione per neutralizzare la tripina.Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti per pellettare le cellule. Quindi, aspirare il supernatante senza disturbare il pellet. Resuspend il pellet in 10 millilitri di mezzo di manutenzione fresco e utilizzare un contatore di celle per determinare il numero di cella secondo le istruzioni del produttore.Seme 20.000 cellule per centimetro quadrato in un nuovo pallone T-25 e aggiungere fino a 10 millilitri di mezzo di manutenzione. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due o tre giorni. Per iniziare la digestione della tripsina, prima aspira lentamente il supernatante e lava le cellule con due millilitri di PBS privo di calcio e magnesio.Quindi, aggiungere un millilitro dello 0,25% di EDTA di tripside alle cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o tre minuti. Dopo l'incubazione, per neutralizzare la tripparina, rimescolare le cellule in nove millilitri di mezzo di differenziazione, composto da DMEM ad alto livello di glucosio e integrato con il 5% di siero bovino fetale, 100 unità per millilitro penicillina e 100 unità per millilitro streptomicina. Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti per pellettare le cellule.Quindi, aspirare lentamente il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di mezzo di differenziazione fresco senza RA. Utilizzare un contatore di celle per determinare il numero di cella in base alle istruzioni del produttore. Per la generazione aggregata, iniziare aggiungendo 10 millilitri di mezzo di differenziazione, integrati con cinque microlitri di RA a un piatto di coltura non trattato da 100 millilitri. Semina un milione di cellule nel piatto di coltura e incuba a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per due giorni al fine di promuovere la formazione aggregata.Dopo l'incubazione, con una pipetta da 10 millilitri, aspirare il mezzo contenente gli aggregati e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri a temperatura ambiente. Attendere 1,5 minuti affinché gli aggregati si sistemino sul fondo e poi scartano il supernatante. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di differenziazione fresco integrato con RA micromolare 0,5. Seminare delicatamente gli aggregati in un nuovo piatto da coltura non trattato da 100 millimetri e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due giorni.Per iniziare, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire gli aggregati cellulari in un tubo da 15 millilitri. Attendere 1,5 minuti a temperatura ambiente affinché gli aggregati si sistemino sul fondo e quindi scartare il supernatante. Lavare gli aggregati con siero e DMEM privo di antibiotici.Attendere che gli aggregati cellulari si sistemino nella parte inferiore, scartare il supernatante e aggiungere due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti, toccando ogni due minuti per mantenere le cellule in sospensione. Quindi, aggiungere quattro millilitri di mezzo di manutenzione per interrompere l'attività della tripina e pipettare su e giù 20 volte utilizzando una pipetta da un millilitro.Infine, centrifugare le cellule a 200 volte G e temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di manutenzione. Utilizzare un contatore di cella per determinare il numero di cella e procedere con la placcatura delle celle.Per piastrere le celle, aggiungere prima tre millilitri per pozzo di mezzo di manutenzione a una piastra di coltura a sei pozzi. Quindi, seminare le cellule ad una densità di 500.000 per pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Seminare le cellule su bicchieri di copertura in un piatto di coltura a sei pozzi. Quando raggiungono il 20% di confluenza, procedere all'immunostaining con anticorpo Anti-MAP2. Quindi, isolare l'RNA ed eseguire la trascrizione inversa PCR per MAP2, NueN, OCT4, NANOG e gapdh.In questo studio viene introdotto un metodo semplificato per la differenziazione neuronale. La linea cellulare P19 è coltivata in un piatto di coltura non trattato con RA 5%FBS e 0,5 micromolare. Dopo quattro giorni, gli aggregati cellulari vengono dissociati con tripina e seminati su una piastra di coltura cellulare aderente per i prossimi quattro giorni. L'efficienza di questo metodo viene valutata dal confronto tra l'analisi RTPCR della linea cellulare P19 in uno stato indifferenziato e durante la neurogenesi.I risultati mostrano una rapida diminuzione dell'espressione di geni a pluripotenza, come Oct4 e NANOG, e l'upregolazione di geni marcatori neurnomi, come MAP2 e NeuN. Crediamo che il metodo sviluppato in questo studio sia semplice e svolgerà un ruolo nello chiarire i meccanismi molecolari della neurogenesi, così come le malattie neurodegenerative.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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