Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Исследование было финансово поддержано Национальным научным центром, Польша (грант нет. УМО-2017/25/N/N/N/01886) и KNOW (Ведущий национальный исследовательский центр) Научный консорциум "Здоровое животное - безопасная пища", решение Министерства науки и высшего образования No 05-1/KNOW2/2015

1. Содержание культуры
<ol><li>Культура P19 клеточной линии в обслуживании среднего (Dulbecco в модифицированной среде Eagle с 4500 мг / л глюкозы дополнены 10% FBS, 100 единиц / мл пенициллин и 100 единиц / мЛ streptomycin). Инкубировать при 37 градусахПо кв. м и 5% CO 2.</li>
</ol>2. Подкультинговые клетки</...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

Здесь мы описываем простой протокол нейрогенеза с использованием линии клеток P19. Хотя многие доклады были опубликованы в этой связи, подробная методология индукции нейрогенеза с использованием линии клеток P19 остается неясным. Кроме того, мы использовали простой высокий уровень глюк?...

Во время эмбрионального развития одноклеточный слой превращается в три отдельных слоя зародыша1,2,3. Для расширения возможностей исследований явлений, происходящих в vivo, в качестве удобной модели были разработаны генерации трехмерных агрегатов (эмбриональных тел). Сотовые агрегаты, образующиеся таким образом, могут подвергаться воздействию различных условий, вызывающих дифференциацию клеток, которые отражают развитие эмбриона4,5. P19 murine эмбриональной линии клеток карциномы (P19 клеточной линии) обычно используется в качестве клеточной модели для нейрогенеза исследований в пробирке6,7,8. Линия клеток P19 демонстрирует типичные плюрипотентные черты стволовых клеток и может дифференцироваться в нейроны в присутствии ретинойной кислоты (РА) во время агрегации клеток, а затем невритовый рост в условиях адепта. Кроме того, недифференцированная линия клеток P19 также способна формировать мышечно-и кардиомиоцитоподобные клетки под воздействием диметилсульфида (ДМСО)9,10,11,12.
Многие методы13,14,15,16 были зарегистрированы для нейронной дифференциации, но методология иногда сложна и не легко понять, только читая описания. Например, протоколы иногда требуют комбинации Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) среды дополнены смесью сыворотки икры (CS) и сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS)13. Кроме того, средства массовой информации, используемые для развития нейронов часто состоят из Neurobasal и B27 добавки13,14,15,16. Таким образом, существующие методы содержат сложность в их подготовке, и наша цель здесь заключается в упрощении протоколов. В этом исследовании мы продемонстрировали, что DMEM с FBS может быть использован для поддержания линии клеток P19 (DMEM и 10% FBS), а также для развития нейронов (DMEM 5% FBS и RA). Этот упрощенный метод нейрогенеза с использованием линии клеток P19 позволяет нам изучать молекулярный механизм развития нейронов. Кроме того, исследования нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера также проводится с использованием P19 клеточной линии17,18, и мы считаем, что метод, разработанный в этом исследовании будет играть определенную роль в выяснении молекулярные механизмы при нейроразвитиях и нейродегенеративных заболеваниях.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

Линия клеток P19, полученная из тератокарциномы эмбриона, полученного из эмбриона мыши, имеет способность дифференцироваться в три слоя микробов. При наличии ретинойной кислоты (РА), суспензия культивируемая линия клеток P19 индуцируется, чтобы дифференцироваться в нейроны. Это явление широко исследуется как модель нейрогенеза in vitro. Таким образом, линия клеток P19 очень полезна для молекулярных и клеточных исследований, связанных с нейрогенезом. Тем не менее, протоколы для нейрональной дифференциации линии клеток P19, описанные в литературе, очень сложны. Метод, разработанный в этом исследовании, прост и будет играть определенную роль в выяснении молекулярных механизмов в нейроразвития аномалий и нейродегенеративных заболеваний.

Упрощенная схема протокола индукции нейрогенеза в линии клеток P19 представлена на рисунке 1. Для определения характера клеточной линии P19 в недифференцированном состоянии и во время нейрогенеза был использован метод RT-PCR (обратная транскрипция-полимер...

Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Линия эмбриональной карциномы P19 мыши (линия клеток P19) широко используется для изучения молекулярного механизма нейрогенеза с большим упрощением по сравнению с анализом in vivo. Здесь мы представляем протокол для ретинойной кислоты индуцированного нейрогенеза в линии клеток P19.

Нейрогенез с использованием P19 эмбриональных клеток карциномы

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

P19 клеточной линии, как известно, дифференцироваться в нейроны. Тем не менее, протокол для дифференциации нейронов линии клеток P19 иногда сложны. Этот метод позволяет нам выполнять нейрогенный эксперимент в удобной для пользователя манере и расширить возможность использования линии клеток P19 в будущем.Для начала, поддерживать P19 клеток в поддержании среды, состоящей из DMEM, с 4,5 граммов на литр глюкозы, дополняется 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 единиц на миллилитр пенициллина, и 100 единиц на миллилитр стрептомицина. Инкубировать клеточной культуры в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа окружающей среды, пока клетки примерно 80%confluent. Удалите отлаченную среду из колбы клеточной культуры и промыть клетки двумя миллилитров кальция и магния свободной PBS.Добавьте один миллилитр 0,25%трипсина-ЭДТА, чтобы полностью покрыть монослой клеток и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение двух-трех минут. Под микроскопом, проверьте, если все клетки отделены. Resuspend клетки в 9 миллилитров средства обслуживания для того чтобы нейтрализовать трипсин.Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 200 Г и комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Затем, аспирировать супернатант, не нарушая гранулы. Повторное использование гранул в 10 миллилитров свежей среды технического обслуживания и использовать счетчик ячейки, чтобы определить номер ячейки в соответствии с инструкциями производителя.Семя 20 000 ячеек на квадратный сантиметр в новой колбе Т-25 и добавить до 10 миллилитров среды обслуживания. Инкубация при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение двух-трех дней. Чтобы начать пищеварение трипсина, сначала медленно аспирировать супернатант и мыть клетки с двумя миллилитров кальция и магния свободной PBS.Затем добавьте один миллилитр 0,25%трипсина EDTA в клетки и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение двух-трех минут. После инкубации, чтобы нейтрализовать трипсин, повторно почерпните клетки в девяти миллилитров дифференциации среды, состоящий из DMEM с высоким уровнем глюкозы и дополнен 5%fetal бычьей сыворотки, 100 единиц на миллилитр пенициллина, и 100 единиц на миллилитр стрептомицин. Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 200 Г и комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки.Затем, медленно аспирировать супернатант и повторно гранулы в один миллилитр свежей дифференциации среды без РА. Используйте счетчик ячеек для определения номера ячейки в соответствии с инструкциями производителя. Для агрегатного поколения начните с добавления 10 миллилитров дифференциации среды, дополненной пятью микролитров РА, к 100-миллилитровому, необработанному культуре блюда. Семя один миллион клеток в культуре блюдо и инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение двух дней, с тем чтобы способствовать совокупному образованию.После инкубации, с 10-миллилитровой пипеткой, аспирировать среды, содержащие агрегаты и передать его в 15-миллилитровую трубку при комнатной температуре. Подождите 1,5 минуты, пока агрегаты оседают внизу, а затем отбросьте супернатант. Добавьте 10 миллилитров свежей дифференциации среды, дополненной 0,5 микромолярной РА. Аккуратно посеять агрегаты в новом 100-миллиметровом, необработанном культуре блюда и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение двух дней.Для начала используйте 10-миллилитровую пипетку для переноса агрегатов клеток в 15-миллилитровую трубку. Подождите 1,5 минуты при комнатной температуре для агрегатов, чтобы поселиться в нижней части, а затем отказаться от супернатанта. Вымойте агрегаты сывороткой и без антибиотиков DMEM.Подождите, пока клеточные агрегаты оседают внизу, отбросьте супернатант и добавьте два миллилитров 0,25%трипсина EDTA. Инкубировать трубку в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, нажав каждые две минуты, чтобы держать клетки в подвеске. Затем добавьте четыре миллилитров среды технического обслуживания, чтобы остановить активность трипсина и пипетки вверх и вниз 20 раз с помощью одноми миллилитровой пипетки.Наконец, центрифуга клеток в 200 раз G и комнатной температуры в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно наполнить клеточные гранулы в пяти миллилитров среды обслуживания. Используйте счетчик ячеек, чтобы определить номер ячейки и приступить к облицовке ячеек.Чтобы пластины клеток, сначала добавить три миллилитров на колодец обслуживания среды до шести хорошо культуры пластины. Затем посеять клетки при плотности 500 000 на колодец. Инкубировать пластину при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе.Семя клетки на крышку очки в шесть хорошо культуры пластины. Когда они достигнут 20%слияния, приступить к иммуностимулятора с анти-MAP2 антитела. Затем изолируйте РНК и выполните обратную транскрипцию ПЦР для MAP2, NueN, OCT4, NANOG и GAPDH.В этом исследовании вводится упрощенный метод дифференциации нейронов. Линия клеток P19 культурируется в необработавом блюде культуры с 5%FBS и 0,5 микромолярем РА. Через четыре дня клеточные агрегаты разобщены трипсином и посеяны на пластине культуры клеток в течение следующих четырех дней. Эффективность этого метода оценивается путем сравнения анализа RTPCR клеточной линии P19 в недифференцированном состоянии и во время нейрогенеза.Результаты показывают быстрое снижение экспрессии генов плюрипотенции, таких как Oct4 и NANOG, и upregulation генов нейрномальных маркеров, таких как MAP2 и NeuN. Мы считаем, что метод, разработанный в этом исследовании прост и будет играть определенную роль в выяснении молекулярных механизмов нейрогенеза, а также нейродегенеративных заболеваний.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Органотипической срез культуры для изучения постнатального нейрогенеза

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Отслеживание клеток в GFP-трансгенной данио рерио Использование системы Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Острые и хронические модели гипергликемии у рыбок данио: метод оценки влияния гипергликемии на нейрогенез и биораспределение радиоактивно меченых молекул

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...