Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
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El estudio fue apoyado financieramente por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia (concesión no. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) y KNOW (Leading National Research Centre) Consorcio Científico "Animal Saludable - Alimentos Seguros", decisión del Ministerio de Ciencia y Educación Superior No 05-1/KNOW2/2015

1. Mantenimiento de la cultura
<ol><li>Cultivo de la línea celular P19 en medio de mantenimiento (medio eagle modificado de Dulbecco con 4.500 mg/L de glucosa complementada con 10% FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 100 unidades/ml de estreptocina). Incubar a 37oC y 5% CO2.</li>
</ol>2. Células de cultivo sub-cultivo
<ol><li>Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, retire el medio gastado de los matraces de cultivo celular (área de superficie 25 cm<su...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

Aquí, describimos un protocolo simple para la neurogénesis usando la línea celular P19. Aunque se han publicado muchos informes a este respecto, una metodología detallada para la inducción de la neurogénesis utilizando la línea celular P19 sigue sin estar clara. Además, utilizamos un medio DMEM simple de glucosa alta (4.500 mg/L) con 10% DE FBS para todo el experimento. Esto nos permitió realizar el experimento neurogénico de una manera fácil de usar y ampliar el uso de este método para el futuro.
<p clas...

Durante el desarrollo embrionario, una sola capa celular se transforma en tres capas de gérmenes separadas1,2,3. Para aumentar las posibilidades de investigación de los fenómenos que ocurren in vivo, la generación de agregados tridimensionales (cuerpos embrionarios) se ha desarrollado como un modelo conveniente. Los agregados celulares formados de esta manera pueden ser expuestos a diversas condiciones que causan diferenciación celular, que reflejan el desarrollo del embrión4,5. La línea celular de carcinoma embrionario de murine P19 (línea celular P19) se utiliza comúnmente como modelo celular para estudios de neurogénesis in vitro6,7,8. La línea celular P19 presenta características típicas de células madre pluripotentes y puede diferenciarse en neuronas en presencia de ácido retinoico (RA) durante la agregación celular seguida de un crecimiento de neurita en condiciones adherentes. Además, la línea celular P19 indiferenciada también es capaz de formar células similares a los músculos y cardiomiocitos bajo la influencia de dimetil sulfóxido (DMSO)9,10,11,12.
Muchos métodos13,14,15,16 se han reportado para la diferenciación neuronal, pero la metodología a veces es complicada y no es fácil de entender sólo leyendo las descripciones. Por ejemplo, los protocolos a veces requieren una combinación del medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco complementado con una mezcla de suero de ternero (CS) y suero bovino fetal (FBS)13. Por otra parte, los medios utilizados para el desarrollo neuronal se componen a menudo de Neurobasal y B27 suplementos13,14,15,16. Como tal, los métodos existentes contienen complejidad en su preparación y nuestro objetivo aquí es simplificar los protocolos. En este estudio, demostramos que DMEM con FBS se puede utilizar para mantener la línea celular P19 (DMEM + 10% FBS) así como para el desarrollo neuronal (DMEM + 5% FBS + RA). Este método simplificado para la neurogénesis utilizando la línea celular P19 nos permite estudiar el mecanismo molecular de cómo se desarrollan las neuronas. Por otra parte, la investigación sobre enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer también se lleva a cabo utilizando P19 célula según la línea17,18, y creemos que el método desarrollado en este estudio desempeñará un papel en el esclarecimiento de la mecanismos moleculares en anomalías del neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

La línea celular P19 derivada de un teratocarcinoma derivado del embrión de ratón tiene la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales. En presencia de ácido retinoico (RA), la línea celular P19 cultivada en suspensión se induce a diferenciarse en las neuronas. Este fenómeno se investiga ampliamente como un modelo de neurogénesis in vitro. Por lo tanto, la línea celular P19 es muy útil para estudios moleculares y celulares asociados con la neurogénesis. Sin embargo, los protocolos para la diferenciación neuronal de la línea celular P19 descrita en la literatura son muy complejos. El método desarrollado en este estudio es sencillo y desempeñará un papel en la esclarecimiento de los mecanismos moleculares en anomalías del neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas.

El esquema simplificado de protocolo para la inducción de la neurogénesis en la línea celular P19 se presenta en la Figura1. Para definir el carácter de la línea celular P19 en un estado indiferenciado y durante la neurogénesis, se utilizó el método RT-PCR (reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa). La línea celular P19 indiferenciada expresaba los genes de la pluripotencia como el transportador orgánico catión/carnitina4 (Oct4)...

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Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

La línea celular de carcinoma embrionario de ratón P19 (línea celular P19) es ampliamente utilizada para estudiar el mecanismo molecular de la neurogénesis con gran simplificación en comparación con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo para la neurogénesis inducida por ácido retinoico en la línea celular P19.

Neurogénesis con células de carcinoma embrionario P19

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

La línea celular P19 se sabe que se diferencia en neuronas. Sin embargo, el protocolo para la diferenciación de neuronas de la línea celular P19 a veces es complicado. Este método nos permite realizar el experimento neurogénico de una manera fácil de usar y ampliar la posibilidad del uso de la línea celular P19 para el futuro.Para empezar, mantener las células P19 en medio de mantenimiento, compuestas de DMEM, con 4,5 gramos por litro de glucosa, complementadas con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por cuacilitalitro y 100 unidades por etillita mililitro. Incubar el cultivo celular en un ambiente de 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono hasta que las células sean aproximadamente 80%confluentes. Retire el medio gastado del matraz de cultivo celular y lave las células con dos mililitros de CALCIO y PBS libre de magnesio.Añadir un mililitro de 0.25%trypsin-EDTA para cubrir completamente la monocapa de las células e incubar a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante dos a tres minutos. Bajo un microscopio, compruebe si todas las células están desprendidas. Resuspender las células en nueve mililitros de medio de mantenimiento con el fin de neutralizar la tripina.Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos para peletizar las células. A continuación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de mantenimiento fresco y utilizar un contador de células para determinar el número de celda de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Semilla 20.000 células por centímetro cuadrado en un nuevo matraz T-25 y suman hasta 10 mililitros de medio de mantenimiento. Incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante dos o tres días. Para comenzar la digestión de la trippsina, primero aspira lentamente el sobrenadante y lava las células con dos mililitros de calcio y PBS libre de magnesio.Luego, agrega un mililitro de 0.25%trypsin EDTA a las células e incubarlas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante dos a tres minutos. Después de la incubación, para neutralizar la tripina, resuspender las células en nueve mililitros de medio de diferenciación, compuesto de DMEM con alto nivel de glucosa y complementado con 5% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina, y 100 unidades por estreptomicina mililitro. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos para peletizar las células.Luego, aspira lentamente el sobrenadante y resuspenda el pellet en un mililitro de medio de diferenciación fresco sin RA. Utilice un contador de celdas para determinar el número de celda de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la generación agregada, comience agregando 10 mililitros de medio de diferenciación, complementados con cinco microlitros de RA a un plato de cultivo no tratado de 100 mililitros. Siembra un millón de células en el plato de cultivo e incuba a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante dos días con el fin de promover la formación de agregados.Después de la incubación, con una pipeta de 10 mililitros, aspirar el medio que contiene los agregados y transferirlo a un tubo de 15 mililitros a temperatura ambiente. Espere 1,5 minutos para que los agregados se asienten en la parte inferior y, a continuación, deseche el sobrenadante. Añadir 10 mililitros de medio de diferenciación fresco complementado con 0,5 micromolarES RA. Siembra suavemente los agregados en un nuevo plato de cultivo no tratado de 100 milímetros e incuba a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos días.Para comenzar, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir los agregados celulares a un tubo de 15 mililitros. Espere 1,5 minutos a temperatura ambiente para que los agregados se asienten en la parte inferior y luego deseche el sobrenadante. Lave los agregados con suero y DMEM libre de antibióticos.Espere a que los agregados de celda se asienten en la parte inferior, deseche el sobrenadante y agregue dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 grados celsius durante 10 minutos, tocando cada dos minutos para mantener las células en suspensión. A continuación, añada cuatro mililitros de medio de mantenimiento para detener la actividad de la trippsina y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 20 veces utilizando una pipeta de un mililitro.Finalmente, centrifugar las células a 200 veces G y temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en cinco mililitros de medio de mantenimiento. Utilice un contador de celdas para determinar el número de celda y proceder con el recubrimiento de las celdas.A las celdas de la placa, primero agregue tres mililitros por pozo de medio de mantenimiento a una placa de cultivo de seis pozos. Luego, siembra las células a una densidad de 500.000 por pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.Siembra las células de los vasos de cubierta en una placa de cultivo de seis pozos. Cuando alcancen el 20% de confluencia, proceda a la inmunomancha con anticuerpos Anti-MAP2. A continuación, aísle el ARN y realice la transcripción inversa PCR para MAP2, NueN, OCT4, NANOG y un GAPDH.En este estudio, se introduce un método simplificado para la diferenciación neuronal. La línea celular P19 se cultiva en un plato de cultivo no tratado con 5% FBS y 0.5 RA micromolar. Después de cuatro días, los agregados celulares se disoccian con tripina y se siembran en una placa de cultivo celular adherente durante los próximos cuatro días. La eficiencia de este método se evalúa mediante la comparación entre el análisis RTPCR de la línea celular P19 en un estado indiferenciado y durante la neurogénesis.Los resultados muestran una rápida disminución de la expresión de genes de pluripotencia, como Oct4 y NANOG, y una regulación ascendente de genes marcadores neurnomales, como MAP2 y NeuN. Creemos que el método desarrollado en este estudio es simple y desempeñará un papel en el esclarecimiento de los mecanismos moleculares de la neurogénesis, así como la enfermedad neurodegenerativa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Culturas organotípicos rebanada de Estudios de Postnatal neurogénesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...