Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Studien stöddes ekonomiskt av National Science Centre, Polen (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3 nätters/01886) och KNOW (ledande nationellt forskningscentrum) vetenskapligt konsortium "hälsosamma djur säkra livsmedel", beslut av ministeriet för vetenskap och högre utbildning nr. 05-1/KNOW2/2015

1. underhåll av kulturen
<ol><li>Odla P19 cellinjer i underhålls medium (Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medium med 4 500 mg/L glukos kompletterat med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin och 100 enheter/mL streptomycin). Inkubera vid 37 ° c och 5% CO2.</li>
</ol>2. subculturering av celler
<ol><li>När cellerna når cirka 80% Confluence, ta bort det förbrukade mediet från cell odlings flaskans kolvar (yta 25 cm2).</li>
	<li>Tvätta cellerna med 2 mL fosfatbuffrad salt...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

Här beskriver vi ett enkelt protokoll för neurogenes med hjälp av P19-celllinjen. Även om många rapporter har publicerats i detta avseende, en detaljerad metod för neurogenes induktion med P19 cellinjer är fortfarande oklart. Dessutom utnyttjade vi en enkel hög glukos (4 500 mg/L) DMEM medium med 10% FBS för hela experimentet. Detta tillät oss att utföra det neurogena experimentet på ett användarvänligt sätt och utöka användningen av denna metod för framtiden.
De mest kritisk...

Under embryonal utveckling, ett enda cellskikt omvandlas till tre separata bakterie skikt1,2,3. För att öka forskningsmöjligheterna för fenomen som inträffar in vivo har generering av tredimensionella aggregat (embryonala kroppar) utvecklats som en praktisk modell. Cellulära aggregat bildas på detta sätt kan utsättas för olika förhållanden som orsakar celldifferentiering, som återspeglar utvecklingen av embryot4,5. Den P19 murina embryonal carcinoma cell linje (P19 cellinjer) används ofta som en cellulär modell för neurogenes studier in vitro-6,7,8. Den P19 cellinjer uppvisar typiska pluripotenta stamceller funktioner och kan differentiera till nervceller i närvaro av retinoinsyra (RA) under cell aggregering följt av neurit utväxt under anhängare villkor. Dessutom, den odifferentierade P19 cell linjen är också kapabel att bilda muskel-och kardiomyocyte-liknande celler under påverkan av dimetylsulfoxid (DMSO)9,10,11,12.
Många metoder13,14,15,16 har rapporterats för neuronala differentiering, men metoden är ibland komplicerat och inte lätt att förstå genom att bara läsa beskrivningarna. Till exempel, protokoll kräver ibland en kombination av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) medium kompletteras med en blandning av kalv serum (CS) och foster bovint serum (FBS)13. Dessutom, medier som används för neuronala utveckling består ofta av neurobasal och B27 kosttillskott13,14,15,16. Som sådan, befintliga metoder innehåller komplexitet i deras beredning och vårt mål här är att förenkla protokollen. I denna studie, vi visade att DMEM med FBS kan utnyttjas för att upprätthålla P19 cellinjer (DMEM + 10% FBS) samt för neuronala utveckling (DMEM + 5% FBS + RA). Denna förenklade metod för neurogenes med hjälp av P19 cellinjer ger oss möjlighet att studera den molekylära mekanismen för hur neuroner utvecklas. Dessutom bedrivs även forskning om neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom med hjälp av P19 cell linje17,18, och vi anser att den metod som utvecklats i denna studie kommer att spela en roll i att belysa molekylära mekanismer i neurologiska utvecklingsstörningar och neurodegenerativa sjukdomar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

Den P19 cellinjer härrör från en mus embryo-derived teratocarcinom har förmågan att differentiera till de tre bakterie lagren. I närvaro av retinoinsyra syra (RA), den suspension odlade P19 cellinjer induceras för att differentiera till nervceller. Detta fenomen utreds utförligt som en neurogenes modell in vitro. Därför, den P19 cellinjer är mycket användbart för molekylära och cellulära studier i samband med neurogenes. Emellertid, protokoll för neuronala differentiering av P19 cellinjer som beskrivs i litteraturen är mycket komplexa. Den metod som utvecklats i denna studie är enkel och kommer att spela en roll i att belysa de molekylära mekanismerna i neurologiska utvecklingsstörningar och neurodegenerativa sjukdomar.

Den förenklade systematiken i protokollet för neurogenes induktion i P19 cellinjer presenteras i figur 1. För att definiera teckenet av den P19 cellen fodrar i ett odifferentierat påstå, och under Neurogenesis användes den RT-PCR (omvänd Transkription-Polymerase kedjar reaktion) metoden. Den odifferentierade P19 cellinaden uttryckte pluripotens gener såsom organisk katjon/karnitin transporter4 (Oct4) och nanog Hedgehog (nanog). Neuro...

Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Den P19 mus embryonal carcinoma cellinjer (P19 cellinjer) används ofta för att studera den molekylära mekanismen för neurogenes med stor förenkling jämfört med in vivo analys. Här presenterar vi ett protokoll för retinoinsyra syra-inducerad neurogenes i P19 cell linjen.

Neurogenes med P19 embryonala cancerceller

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

P19 cellinje är känd för att differentiera till nervceller. Protokollet för neuron differentiering av P19 cellinje är dock ibland komplicerade. Denna metod gör det möjligt för oss att utföra det neurogena experimentet på ett användarvänligt sätt och utöka möjligheten till användningen av P19 cellinje för framtiden.Till att börja, underhålla P19 celler i underhåll medium, som består av DMEM, med 4,5 gram per liter glukos, kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum, 100 enheter per milliliter penicillin, och 100 enheter per milliliter streptomycin. Inkubera cellkulturen i en 37 grader Celsius och 5%koldioxid miljö tills cellerna är ungefär 80%konfluenta. Ta bort det förbrukade mediet från cellodlingskolven och tvätta cellerna med två milliliter kalcium och magnesiumfri PBS.Tillsätt en milliliter på 0,25%trypsin-EDTA för att helt täcka monolayer av cellerna och inkubera i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i två till tre minuter. Under ett mikroskop, kontrollera om alla celler är lösslösa. Resuspend cellerna i nio milliliter underhållsmedium för att neutralisera trypsin.Överför cellerna i ett 15-milliliterrör och centrifug vid 200 gånger G och rumstemperatur i fem minuter för att pelleta cellerna. Därefter aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Resuspend pelleten i 10 milliliter av färskt underhåll medium och använda en cellräknare för att bestämma cellens nummer enligt tillverkarens anvisningar.Frö 20, 000 celler per kvadratcentimeter i en ny T-25 kolv och lägg till upp till 10 milliliter underhållsmedium. Inkubera i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i två till tre dagar. Till att börja trypsin matsmältning, först långsamt aspirera supernatanten och tvätta cellerna med två milliliter kalcium och magnesiumfri PBS.Tillsätt sedan en milliliter på 0,25%trypsin EDTA till cellerna och inkubera dem i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i två till tre minuter. Efter inkubationen, att neutralisera trypsin, resuspend cellerna i nio milliliter av differentiering medium, består av DMEM med hög glukosnivå och kompletteras med 5%fetala nötkreatur serum, 100 enheter per milliliter penicillin och 100 enheter per milliliter streptomycin. Överför cellerna i ett 15-milliliterrör och centrifug vid 200 gånger G och rumstemperatur i fem minuter för att pelleta cellerna.Därefter aspirera långsamt supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter av nytt differentieringsmedium utan RA. Använd en cellräknare för att bestämma cellnumret enligt tillverkarens anvisningar. För aggregerad generation, börja med att lägga till 10 milliliter differentieringsmedium, kompletterat med fem mikroliter av RA till en 100-milliliter, icke-behandlad odlingsskål. Utsäde en miljon celler i odlingsrätten och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i två dagar för att främja aggregerad bildning.Efter inkubationen, med en 10-milliliter pipet, aspirera mediet som innehåller aggregaten och överföra det till ett 15-milliliter rör vid rumstemperatur. Vänta i 1,5 minuter för aggregaten att bosätta sig i botten och sedan kasta supernatanten. Tillsätt 10 milliliter färskt differentieringsmedium kompletterat med 0,5 mikromolar RA. Försiktigt utsäde aggregaten i en ny 100-millimeters, icke-behandlad kultur skålen och inkubera på 37 grader Celsius och 5%koldioxid i två dagar.Till att börja med, använd en 10-milliliter pipetter för att överföra cellen aggregat till en 15-milliliter rör. Vänta i 1,5 minuter i rumstemperatur för aggregaten att bosätta sig i botten och sedan kasta supernatanten. Tvätta aggregaten med serum och antibiotikafri DMEM.Vänta på att cellaggregaten ska lägga sig längst ner, kasta supernatanten och lägg till två milliliter på 0,25 %trypsin EDTA. Inkubera röret i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i 10 minuter, knacka varannan minut för att hålla cellerna i suspension. Lägg sedan till fyra milliliter underhållsmedium för att stoppa trypsinaktiviteten och pipetten upp och ner 20 gånger med en en milliliterpipett.Slutligen centrifug cellerna vid 200 gånger G och rumstemperatur i fem minuter. Ta bort supernatanten och resuspend cellpelleten i fem milliliter underhållsmedium. Använd en cellräknare för att bestämma cellnumret och fortsätt med att plätering av cellerna.Till plåtceller, tillsätt först tre milliliter per brunn av underhållsmedium till en sex-brunns odlingsplatta. Sedan, utsäde cellerna vid en densitet av 500, 000 per brunn. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Utsäde cellerna på täckglas i en sex-väl kultur tallrik. När de når 20%sammanflödet, fortsätt till immunfärgning med Anti-MAP2 antikropp. Sedan isolerar du RNA, och utför omvänd transkription PCR för MAP2, NueN, OCT4, NANOG och en GAPDH.I denna studie införs en förenklad metod för neuronal differentiering. P19-celllinjen odlas i en icke-behandlad odlingsskål med 5%FBS och 0,5 mikromolar RA. Efter fyra dagar, cellen aggregat separeras med trypsin och sådd på en anhängare cell kultur plattan för de kommande fyra dagarna. Effektiviteten hos denna metod utvärderas genom jämförelsen mellan RTPCR-analys av P19-cellinjen i ett odifferentierat tillstånd och under neurogenes.Resultaten visar en snabb minskning av uttryck av pluripotency gener, såsom Oct4 och NANOG, och uppreglering av neurnomal markör gener, såsom MAP2 och NeuN. Vi tror att den metod som utvecklats i denna studie är enkel och kommer att spela en roll i att belysa de molekylära mekanismerna för neurogenes, liksom neurodegenerativa sjukdom.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Organotypic Slice kulturer för Studier av Födsel Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akuta och kroniska modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metod för att bedöma effekterna av hyperglykemi på neurogenes och biodistribution av radiomärkta molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...