Name: neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Çalışma mali Ulusal Bilim Merkezi, Polonya tarafından destekleniyordu (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) ve KNOW (lider Ulusal Araştırma Merkezi) bilimsel konsorsiyum "sağlıklı hayvan-güvenli gıda", bilim ve yüksek Eğitim Bakanlığı kararı No. 05-1/KNOW2/2015

1. kültür Bakımı
<ol><li>Kültür P19 hücre hattı bakım ortamı (Dulbecco modifiye kartal orta ile 4.500 mg/L glikoz ile tamamlayıcı 10% FBS, 100 birimler/mL penisilin ve 100 birimleri/mL streptomisin). 37 °C ve% 5 CO2' de Inküye.</li>
</ol>2. alt-kültür hücreleri
<ol><li>Hücreler yaklaşık% 80 konfluence ulaştığında, harcanan ortamı hücre kültürü flsorından çıkarın (yüzey alanı 25 cm2).</li>
	<li>Hücreleri 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) il...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

Burada, P19 hücre hattını kullanarak nörojenez için basit bir protokol açıklanmaktadır. Bu konuda birçok rapor yayınlanmasına rağmen, P19 hücre hattını kullanarak nörojenez indüksiyon için ayrıntılı bir metodoloji belirsiz kalır. Dahası, biz tüm deney için 10% FBS ile basit bir yüksek glikoz (4.500 mg/L) DMEM orta kullanılmıştır. Bu bize Kullanıcı dostu bir şekilde nörojenik deney yapmak ve gelecek için bu yöntemin kullanımını genişletmek için izin verdi.
<p class="jove_conten...

Embriyonal gelişim sırasında, tek bir hücre tabakası üç ayrı germ katmanına dönüştürülür1,2,3. İn vivo oluşan olayların araştırma olanaklarını artırmak için, üç boyutlu toplamları (embriyonik organları) nesil uygun bir model olarak geliştirilmiştir. Bu şekilde oluşan hücresel agregalar, embriyo4,5' in gelişimini yansıtan hücre farklılaşmasına neden olan çeşitli koşullara maruz kalabilirler. P19 murine embriyonik karsinom hücre hattı (P19 hücre hattı) yaygın olarak kullanılan bir hücresel model olarak nörojenez çalışmaları için vitro6,7,8. P19 hücre hattı, tipik pluripotent kök hücre özelliklerini sergiler ve hücre toplama sırasında retinoik asit (RA) varlığında nöronların içine yapışabilir koşullar altında nörit gelişiminin ardından ayırt edebilirsiniz. Dahası, farklılaşılmış P19 hücre hattı da dimetil sülfoxid (DMSO)9,10,11,12etkisi altında kas ve kardiyomiyosit benzeri hücreler şekillendirme yeteneğine sahiptir.
Birçok yöntem13,14,15,16 nöronal farklılaşma için bildirilmiştir, ancak metodoloji bazen karmaşık ve sadece açıklamaları okuyarak kavramak kolay değil. Örneğin, protokoller bazen buzağı serum (CS) ve fetal sığır serumu (FBS)13karışımı Ile tamamlayıcı Dulbecco modifiye kartal Orta (dmem) orta bir kombinasyonu gerektirir. Dahası, nöronal gelişim için kullanılan medya genellikle nörobasal ve B27 takviyeleri oluşur13,14,15,16. Bu nedenle, mevcut yöntemler onların hazırlanması karmaşıklık içerir ve burada amacımız protokolleri basitleştirmek için. Bu çalışmada, biz FBS ile DMEM P19 hücre hattı (DMEM + 10% FBS) yanı sıra nöronal gelişim için (DMEM + 5% FBS + RA) korumak için kullanılabilir olduğunu göstermiştir. P19 hücre hattını kullanarak nörogenezi için bu Basitleştirilmiş Yöntem bize nöronların nasıl geliştirildiğini moleküler mekanizması çalışma sağlar. Dahası, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar üzerinde araştırma da P19 hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilir17,18, ve biz bu çalışmada geliştirilen Yöntem aydınlatılmasına bir rol oynayacaktır inanıyoruz nörogelişimsel anomalilerde ve nörodejeneratif hastalıklarda moleküler mekanizmalar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

Bir fare embriyo türevi teratokarsinoma türetilen P19 hücre hattı üç mikrop katmanları ayırt etme yeteneğine sahiptir. Retinoik asit (RA) varlığında, süspansiyon kültürlü P19 hücre hattı nöronlara ayırt etmek için indüklenir. Bu fenomen bir nörojenez modeli olarak yaygın olarak incelenmiştir. Bu nedenle, P19 hücre hattı neurogenesis ile ilişkili moleküler ve hücresel çalışmalar için çok yararlıdır. Ancak literatürde açıklanan P19 hücre hattının nöronal farklılaşması için protokoller çok karmaşıktır. Bu çalışmada geliştirilen Yöntem basittir ve nörogelişimsel anomalilerde ve nörodejeneratif hastalıklarda moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına bir rol oynayacak.

P19 hücre hattında nörojenez indüksiyon için protokol Basitleştirilmiş şeması Şekil 1' de sunulmaktadır. P19 hücre satırının karakterini ayırt edilemez bir durumda ve nörogenezi sırasında tanımlamak için, RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi kullanılmıştır. Farklılaşılmış P19 hücre hattı, organik Kyon/karnitin transporter4 (Oct4) ve Nanog Homeobox (Nanog) gibi pluripotency genlerin...

Watch this Scientific Journal Video about Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells at JoVE.com

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

P19 fare embriyonik karsinom hücre hattı (P19 hücre hattı) yaygın olarak büyük basitleştirme ile nörojenez moleküler mekanizmasını incelemek için kullanılan in vivo analizi ile karşılaştırıldığında. Burada, P19 hücre hattında retinoik asit kaynaklı nörogenezi için bir protokol sunuyoruz.

Nörojenez P19 embriyonal karsinom hücrelerini kullanarak

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

P19 hücre hattı nöronlar ayırt bilinmektedir. Ancak, P19 hücre hattının nöron farklılaşması için protokol bazen karmaşık. Bu yöntem, nörojenik deneyi kullanıcı dostu bir şekilde gerçekleştirmemize ve P19 hücre hattının gelecek için kullanım olasılığını genişletmemize olanak sağlar.Başlamak için, bakım orta P19 hücreleri korumak, DMEM oluşan, glikoz litre başına 4.5 gram, ile takviye 10%fetal sığır serumu, mililitre penisilin başına 100 birim, ve mililitre streptomisin başına 100 birim. Hücreler yaklaşık% 80 konakıcı olana kadar 37 derece santigrat ve% 5 karbondioksit ortamında hücre kültürü kuluçka. Hücre kültürü şişesinden harcanan orta çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın.Hücrelerin monotabakasını tamamen kapsayacak şekilde %0,25 tripsin-EDTA'nın bir mililitresini ekleyin ve 2-3 dakika boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Mikroskop altında, tüm hücrelerin ayrılıp ayrılmadın mı kontrol edin. Tripsini nötralize etmek için dokuz mililitre bakım aracındaki hücreleri yeniden askıya alın.Hücreleri 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj içine 200 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri pelet için aktarın. Sonra, pelet rahatsız etmeden supernatant aspire. Peleti 10 mililitre taze bakım ortamında yeniden askıya alın ve hücre numarasını üreticinin talimatlarına göre belirlemek için bir hücre sayacı kullanın.Yeni bir T-25 şişesinde santimetre kare başına 20,000 hücre tohumlayın ve 10 mililitreye kadar bakım ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede kuluçka ya da %5 karbondioksit le 2-3 gün boyunca. Tripsin sindirimine başlamak için, önce süpernatantı yavaşça aspire edin ve hücreleri iki mililitre kalsiyum ve magnezyumsuz PBS ile yıkayın.Daha sonra hücrelere bir mililitre 0.25 tripsin EDTA ekleyin ve 2-3 dakika boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le inkübedin. Kuluçka dan sonra, tripsin nötralize etmek için, farklılaşma ortamının dokuz mililitre hücreleri resuspend, yüksek glikoz düzeyi ile DMEM oluşan ve% 5 fetal sığır serumu ile takviye, mililitre penisilin başına 100 adet, ve mililitre streptomisin başına 100 adet. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüj içine 200 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri pelet için aktarın.Daha sonra, yavaş yavaş supernatant aspire ve RA olmadan taze farklılaşma orta bir mililitre pelet resuspend. Hücre numarasını üreticinin talimatlarına göre belirlemek için bir hücre sayacı kullanın. Toplam nesil için, 100 mililitrelik, tedavi edilmeyen kültür yemeğine beş mikrolitre RA ile takviye edilmiş 10 mililitre farklılaştırma ortamı ekleyerek başlayın. Tohum kültür çanak bir milyon hücre ve kuluçka 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit iki gün boyunca amacıyla toplam oluşumunu teşvik etmek.Kuluçkadan sonra, 10 mililitrelik pipetle, agregaları içeren ortamı aspire edin ve oda sıcaklığında 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Agregaların en alta yerleşmesi için 1,5 dakika bekleyin ve sonra supernatant atın. 0,5 mikromolar RA ile desteklenen taze farklılaşma orta 10 mililitre ekleyin. Agregaları 100 milimetrelik yeni bir kültür yemeğine yavaşça tohumlayın ve iki gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Başlamak için, hücre agregalarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Agregalar alt yerleşmek ve daha sonra supernatant atmak için oda sıcaklığında 1,5 dakika bekleyin. Agregaları serum ve antibiyotiksiz DMEM ile yıkayın.Hücre agregalarının en alta yerleşmesini bekleyin, supernatant'ı atın ve %0,25 tripsin EDTA'nın iki mililitresini ekleyin. Tüpü 37 derecede 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın, hücreleri süspansiyonda tutmak için her iki dakikada bir dokunun. Daha sonra, bir mililitrelik pipet kullanarak tripsin aktivitesini ve pipeti 20 kez yukarı ve aşağı durdurmak için dört mililitre bakım ortamı ekleyin.Son olarak, hücreleri 200 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj. Supernatant çıkarın ve bakım orta beş mililitre hücre pelet resuspend. Hücre numarasını belirlemek ve hücreleri kaplamaya devam etmek için bir hücre sayacı kullanın.Plaka hücreleri için, ilk altı iyi bir kültür plakabakım orta kuyu başına üç mililitre ekleyin. Sonra, iyi başına 500, 000 yoğunluğunda hücreleri tohum. Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Altı kuyulu bir kültür tabağına kapak gözlük hücreleri tohum. %20 birleştiğinde Anti-MAP2 antikorile immünolemeye devam edin. Daha sonra, RNA'yı yalıtın ve MAP2, NueN, OCT4, NANOG ve GAPDH için ters transkripsiyon PCR gerçekleştirin.Bu çalışmada nöronal farklılaşma için basitleştirilmiş bir yöntem sunulmuştur. P19 hücre hattı% 5 FBS ve 0.5 mikromolar RA ile tedavi edilmeyen bir kültür çanak kültürlü. Dört gün sonra, hücre agregaları tripsin ile ayrıştırılır ve sonraki dört gün boyunca bir yapışkan hücre kültür plakası üzerinde tohumlanır. Bu yöntemin etkinliği, farklılaşmamış bir durumda ve nörogenez sırasında P19 hücre hattının RTPCR analizi arasındaki karşılaştırma ile değerlendirilir.Sonuçlar pluripotency genlerin ekspresyonunda hızlı bir düşüş göstermektedir, Ekim 4 ve NANOG gibi, ve nörnomal marker genlerin upregulation, MAP2 ve NeuN gibi. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin basit olduğuna ve nörogenezin moleküler mekanizmalarının yanı sıra nörodejeneratif hastalıkların aydınlatılaç bir rol oynayacağına inanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Zebra basımında Akut ve Kronik Hiperglisemi Modelleri: Hipergliseminin Nörogenez Üzerindeki Etkisini ve Radyoaktif Etiketli Moleküllerin Biyo Dağılımını Değerlendiren Bir Yöntem

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...