Name: synthesis, characterization, and application of superparamagnetic iron oxide nanoprobes for extrapulmonary tuberculosis detection
Uploaded: 2020-02-16T12:00:00
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Gli autori sono grati per il sostegno finanziario da parte del Ministero dell'Economia Taiwan (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) per eseguire questo lavoro di ricerca. Questo manoscritto è stato curato da Wallace Academic Editing.

Tutto il protocollo relativo all'esperimento sugli animali segue le procedure operative standard per l'allevamento degli animali da laboratorio in conformità con i National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8a edizione, 2011) ed è approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
1. Sintesi di nanoparticelle SPIO
<ol><li>Preparare le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite dextran mescolando vigorosamente una mi...

<ol>
	<li>Small, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+tuberculosis+in+patients+with+advanced+human+immunodeficiency+virus+infection.">Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection.</a> New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).</li><li>Alvarez, S., McCabe, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+tuberculosis+revisited:+a+review+of+experience+at+Boston+City+and+other+hospitals.">Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals.</a> Medicine. 63, 25-55 (1984).</li><li>Ozbay, B., Uzun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+tuberculosis+in+high+prevalence+of+tuberculosis+and+low+prevalence+of+HIV.">Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV.</a> Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).</li><li>Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+extrapulmonary+tuberculosis+in+a+Danish+university+clinic.">Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic.</a> Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).</li><li>Steingart, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+commercial+serological+antibody+detection+tests+for+the+diagnosis+of+extrapulmonary+tuberculosis.">A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.</a> Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).</li><li>Liao, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+performance+of+an+enzyme-linked+immunospot+assay+for+interferon-gamma+in+extrapulmonary+tuberculosis+varies+between+different+sites+of+disease.">Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease.</a> Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+usefulness+of+a+T-cell+based+assay+for+extrapulmonary+tuberculosis.">Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis.</a> Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+usefulness+of+a+T-cell-based+assay+for+extrapulmonary+tuberculosis+in+immunocompromised+patients.">Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients.</a> The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).</li><li>Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review:+T-cell-based+assays+for+the+diagnosis+of+latent+tuberculosis+infection:+an+update.">Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update.</a> Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).</li><li>Kobashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+T+cell-based+assay+in+the+diagnosis+of+extrapulmonary+tuberculosis.">Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.</a> Respirology. 14, 276-281 (2009).</li><li>Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+tuberculosis+epididymo-orchitis+by+INNO-LiPA+Rif+TB+and+QuantiFERON-TB+Gold+In+Tube+tests:+case+report.">Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).</li><li>Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculous+meningitis+by+polymerase+chain+reaction+(PCR).">Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR).</a> Neurology. 40, 1617 (1990).</li><li>Bhigjee, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+tuberculous+meningitis:+clinical+and+laboratory+parameters.">Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters.</a> International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).</li><li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+cells:+labelling+proteins+with+fluorophores.">Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).</li><li>Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging.">Molecular imaging.</a> Radiology. 219, 316-333 (2001).</li><li>Gupta, A. K., Gupta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+surface+engineering+of+iron+oxide+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).</li><li>Talelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+encapsulated+in+biodegradable+thermosensitive+polymeric+micelles:+toward+a+targeted+nanomedicine+suitable+for+image-guided+drug+delivery.">Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery.</a> Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+toxicity+and+kinetic+study+of+Cy5.5-conjugated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+by+optical+imaging.">Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).</li><li>Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles.">Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).</li><li>Chen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+folic+acid-PEG+nanoparticles+for+noninvasive+imaging+of+folate+receptor+by+MRI.">Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).</li><li>Chen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Herceptin-dextran+iron+oxide+nanoparticles+for+noninvasive+imaging+of+HER2/neu+receptors+using+MRI.">Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).</li><li>Weissleder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+superparamagnetic+iron+oxide:+an+intravenous+contrast+agent+for+assessing+lymph+nodes+with+MR+imaging.">Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging.</a> Radiology. 175, 494-498 (1990).</li><li>Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+a+significant+source+of+type+1+cytokines+during+mycobacterial+infection.">Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).</li><li>Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+different+strengths+of+carbol+fuchsin+in+Ziehl-Neelsen+staining+for+detecting+acid-fast+bacilli.">Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).</li><li>Woods, A. E., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).</li><li>Lee, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-paramagnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+use+in+extrapulmonary+tuberculosis+diagnosis.">Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).</li><li>Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+bacteria+using+core-shell+nanoparticles+and+an+NMR-filter+system.">Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popcorn-shaped+magnetic+core-plasmonic+shell+multifunctional+nanoparticles+for+the+targeted+magnetic+separation+and+enrichment,+label-free+SERS+imaging,+and+photothermal+destruction+of+multidrug-resistant+bacteria.">Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria.</a> Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).</li><li>Nishie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+human+monocytic+cellular+activity+using+superparamagnetic+iron+oxide.">In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).</li><li>von Zur Muhlen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superparamagnetic+iron+oxide+binding+and+uptake+as+imaged+by+magnetic+resonance+is+mediated+by+the+integrin+receptor+Mac-1+(CD11b/CD18):+implications+on+imaging+of+atherosclerotic+plaques.">Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques.</a> Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).</li></ol>

Analogamente agli studi pertinenti, i nostri risultati relativi alle nanosinde SPIO-MtbsAb hanno dimostrato una specificità significativa per Mtb27,28. Il granuloma sottocutaneo Mtb è stato trovato 1 mese dopo l'iniezione di TB nei modelli murini. Le tipiche scoperte dell'istoologia granulomatosa della TB includevano l'infiltrazione dei linfociti, la presenza di macrofagi epiteliaidi e la neovascolarizzazione. I bacilli acido-veloci sono stati sparsi nelle lesi...

A livello globale, la tubercolosi extrapolmonare (ETB) rappresenta una percentuale significativa di casi di tubercolosi (TB). Tuttavia, la diagnosi di ETB è spesso mancata o ritardata a causa della sua presentazione clinica insidiosa e delle scarse prestazioni sui test diagnostici; I falsi risultati includono squali esatti negativi per bacilli acido-veloce, mancanza di tessuto granulomatoso sulla istopatologia, o fallimento della cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Rispetto ai casi tipici, ETB si verifica meno frequentemente e comporta poca liberazione del Bacilli Mtb. Inoltre, di solito è localizzato in siti di difficile accesso, come linfonodi, pleura e aree osteoarticolari1. Pertanto, le procedure invasive per l'ottenimento di adeguati campioni clinici, che rendono la conferma batteriologica rischiosa e difficile, sono essenziali2,3,4.
I test di rilevamento degli anticorpi disponibili in commercio per l'ETB sono inaffidabili per il rilevamento clinico a causa della loro vasta gamma di sensibilità (0,00-1,00) e della specificità (0,59-1,00) per tutti i siti extrapolmonari combinati5. I saggi dell'immunospot indicizzato all'enzima (ELISPOT) per l'interferone-z, la proteina filtrante della coltura (CFP) e il bersaglio antigenico venoso precoce (ESAT) sono stati utilizzati per diagnosticare la tubercolosi e latb attiva. Tuttavia, i risultati variano tra diversi siti di malattia per la diagnosi di ETB6,7,8. Inoltre, la PPD cutanea (derivata della proteina purificata) e QuantiFERON-TB hanno spesso fornito risultati falsi negativi9. QuantiFERON-TB-2G è un saggio di reattività immunitaria del sangue intero, che non richiede un campione dall'organo interessato e questo può essere uno strumento diagnostico alternativo6,10,11. Altri metodi diagnostici tipicamente utilizzati per la meningite da TB, come la reazione a catena della polimerasi, sono ancora troppo insensibili per escludere con fiducia la diagnosi clinica12,13. Questi test convenzionali dimostrano informazioni diagnostiche insufficienti per scoprire il sito di infezione extrapolmonare. Pertanto, sono richieste clinicamente nuove modalità diagnostiche.
L'imaging molecolare mira a progettare nuovi strumenti in grado di vagliare direttamente specifici obiettivi molecolari dei processi di malattia in vivo14,15. L'ossido di ferro superparamagnetico (SPIO), un agente di contrasto NMR ponderato T2, può migliorare significativamente la specificità e la sensibilità dell'imaging a risonanza magnetica (MR) (MRI)16,17. Questa nuova modalità di imaging funzionale può disegnare con precisione i cambiamenti dei tessuti a livello molecolare attraverso interazioni ligando-recettore. In questo studio, è stata sintetizzata una nuova sonda di imaging molecolare, che comprende nanoparticelle SPIO, per coniugare con l'anticorpo superficiale Mtb (MtbsAb) per la diagnosi di ETB. Le nanosondpio SPIO sono minimamente invasive per tessuti e corpi in esame18,19. Inoltre, queste nanosonde possono dimostrare immagini REM precise a basse concentrazioni a causa delle loro proprietà paramagnetiche. Inoltre, le nanosonda SPIO appaiono suscitare reazioni meno allergiche perché la presenza di ioni di ferro fa parte della fisiologia normale. In questo caso, la sensibilità e la specificità delle nanosonde SPIO-MtbsAb rivolte a ETB sono state valutate sia nei modelli cellulari che in quelli animali. I risultati hanno dimostrato che le nanosonda erano applicabili come agenti di imaging ultrasensibili per la diagnosi di ETB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hydroxybenzotriazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran(T-40)</td>
			<td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epichlorohydrin, 2,2&#39;-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride hexahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferrous chloride tetrahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human monocytic THP-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M. bovis BCG</td>
			<td>Pasteur M&#233;rieux</td>
			<td>Connaught strain; ImmuCyst Aventis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI</td>
			<td>GE medical Systems</td>
			<td>3.0-T, Signa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR relaxometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NMS-120 Minispec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-300</td>
			<td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25</td>
			<td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off</td>
			<td>Spectrum Laboratories Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb</td>
			<td>Acris Antibodies GmbH</td>
			<td>BP2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2000 EX II</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, characterization, and application of superparamagnetic iron oxide nanoprobes for extrapulmonary tuberculosis detection

Una sonda di imaging molecolare composta da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO) e anticorpo superficiale Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) è stata sintetizzata per migliorare la sensibilità all'imaging per la tubercolosi extrapolmonare (ETB). Un nanosonda SPIO è stato sintetizzato e coniugato con MtbsAb. La nanosonda SPIO-MtbsAb purificata è stata caratterizzata utilizzando TEM e NMR. Per determinare la capacità di targeting della sonda, le nanosonda SPIO-MtbsAb sono state incubate con Mtb per analisi di imaging in vitro e iniettate nei topi inoculati da Mtb per l'indagine in vivo con risonanza magnetica (MR). La riduzione del miglioramento del contrasto sulla risonanza magnetica (MRI) delle cellule Mtb e THP1 ha mostrato proporzionale alla concentrazione di nanosonda SPIO-MtbsAb. Dopo 30 minuti di iniezione di nanosonda SPIO-MtbsAb per via endovenosa in topi infettati da Mtb, l'intensità del segnale del sito di granulomatous è stata migliorata di 14 volte nelle immagini MR ponderate T2 rispetto a quella dei topi che ricevono l'iniezione PBS. Le nanosonda MtbsAb possono essere utilizzate come nuova modalità per il rilevamento ETB.

Sintesi e caratterizzazione della nanosonda SPIO-MtbsAb Le nanoparticelle SPIO sono state progettate per coniugare con MtbsAb. Il dextran stabilizzato sulla superficie delle nanoparticelle SPIO è stato collegato tramite epichlorohydrin. Le nanoparticelle SPIO sono state successivamente incorporate con EDBE per attivare i gruppi funzionali dell'ammine primario alle estremità del dextran. SA è stata poi coniugata per formare SPIO-EDBE-SA. Le nanosonda SPIO-MtbsAb si sono formate nel passaggio finale ...

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Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Per migliorare i test diagnostici sierologici per gli antigeni della tubercolosi Mycobacterium, abbiamo sviluppato nanosondie di ossido di ferro superparamagnetico per rilevare la tubercolosi extrapolmonare.

Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

A livello globale, la diagnosi di tubercolosi extrapolmonare è spesso ritardata, in quanto richiede un intervento chirurgico per la conferma a causa di presentazioni cliniche non specifiche e di scarse prestazioni nei test diagnostici. Per migliorare i test diagnostici sierologici per gli antigeni Mycobacterium tuberculosis, abbiamo sviluppato nanoprobenne di ossido di ferro super-paramagnetico per rilevare la tubercolosi extrapolmonare. Le nanoprobiche TB-SPIO possono fornire precise immagini di risonanza magnetica a basse concentrazioni a causa delle loro proprietà paramagnetiche senza indurre alcuna risposta autoimmune.Le nanoprobenne TB-SPIO consentono il targeting e il rilevamento dell'infezione da tubercolosi di Mycobacterium. Possono anche essere applicati come agente di contrasto per la risonanza teste per l'individuazione di altre malattie. Assicurati di studiare attentamente il protocollo prima di tentare il protocollo, poiché ogni parte dell'esperimento utilizza una tecnologia di base specifica.La dimostrazione visiva del metodo può aiutare gli alunni a capire come implementare il processo, specialmente per alcuni degli esperimenti più complicati. Per preparare nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran, combinare vigorosamente cinque millilitri di dextran T40 con 45 milligrammi di cloruro ferrico acquoso esaidrato e 32 milligrammi di soluzioni di tetraidrato di cloruro ferroso a temperatura ambiente. Aggiungere rapidamente 10 millilitri di idrossido di ammonio e utilizzare una barra di agitazione per mescolare la sospensione nera risultante per un'ora a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione di agitazione, centrifugare la soluzione e rimuovere gli aggregati. Per separare i prodotti SPIO finali dal Dextran T40 non legato, caricare l'intera miscela di reazione di cinque millilitri in una colonna cromatografica di filtrazione del gel di 2,5 per 33 centimetri ed elutare il dextran con 0,1 molare di acetato di sodio e 0,15 molare di soluzione tampone di cloruro di sodio. Quindi, raccogliere le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran purificate nel volume del vuoto e saggiare gli eluati della colonna per ferro ed estran a 330 e 490 nanometri secondo protocolli standard.Per creare anticorpi superficiali Mycobacterium tuberculosis coniugati con SPIO, sintetizzare prima l'anidride spio-edbe-succinica mescolando 10 millilitri di una soluzione alcalina di SPIO-EBDE con un grammo di anidride succinica per 24 ore a temperatura ambiente. Il giorno successivo, utilizzare da 12.000 a 4.000 tubi molecolari a membrana porosa tagliati a peso molecolare per dializzare la soluzione con cambi di 26 ore di due litri di acqua distillata per cambio. Dopo l'ultima modifica, aggiungere 100 microlitri della soluzione risultante a 400 microlitri di 4,5 milligrammi per millilitri TB anticorpo superficiale, seguito dall'aggiunta di 1-idrossibenzotriazolo e benzotriazolo-1-yloxy tripyrrolidinofosphonium esafluorofosfato come catalizzatori a temperatura ambiente per 24 ore con agitazione.Separare le soluzioni dall'anticorpo non legato attraverso la cromatografia di filtrazione del gel utilizzando PBS come tampone. Per determinare la dimensione media delle particelle, la morfologia e la distribuzione delle dimensioni, far cadere la dispersione composita su una griglia di rame a 200 maglie e asciugare ad aria il campione a temperatura ambiente prima di caricare su un microscopio elettronico a trasmissione per l'imaging a 100 kilovolt. Per misurare i valori del tempo di rilassamento delle nanoprobe, usate un rilassantometro a risonanza magnetica nucleare a 20 megahertz e 37 gradi Celsius più o meno un grado.Per l'imaging cellulare pulsato con nanosoperforma, coltivare prima monociti THP-1 umani secondo protocolli standard di coltura cellulare. Quando le cellule hanno raggiunto lo stadio appropriato di attivazione, preincubare uno per 10 ai sette monociti con una per 10 alla sesta unità di formazione della colonia di Mycobacterium bovis BCG per un'ora. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in tubi di microcentrifugo da un millilitro e aggiungere due millimolari di SPIO Mycobacterium tuberculosis nanoprobes coniugate con anticorpi superficiali a ciascun tubo per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 200 microlitri di mezzo fresco. Quindi, scansionare i campioni usando una sequenza di impulsi eco gradiente veloce attraverso la risonanza magnetica 3.0-T per determinare la specificità e la sensibilità delle nanoprobe. Per inoculare animali da esperimento con M.bovis BCG, ricostituire prima il vaccino licofilizzato o lo stock batterico nel mezzo di Sauton e diluire la soluzione di stock ricostituita con soluzione salina.Successivamente, caricare 100 microlitri della soluzione in una siringa da un millilitro per animale e iniettare l'intero volume di batteri intradermally nella pelle scapolare dorsale sinistra o destra di ciascun topo. Per la risonanza magnetica in vivo di animali vivi iniettati da nanoprobe, acquisire immagini di spin-eco veloce ponderate T2 di ciascun animale sperimentale anestetizzato prima di iniettare due nanomolari di sonde anticorpali SPIO-TB sospese in 200 microlitri di soluzione salina nella vena di coda di ciascun topo. Quindi, immagine degli animali immediatamente dopo l'iniezione e ogni cinque minuti per i successivi 30 minuti.Al termine della sessione di imaging, analizzare quantitativamente tutte le immagini di risonanza magnetica utilizzando l'intensità del segnale come misura delle regioni definite di interesse in posizioni comparabili di un centro granuloma M.tuberculosis e del muscolo posteriore adiacente a un'area granulomatica. Quindi, utilizzare la formula per calcolare i miglioramenti relativi del segnale utilizzando la misurazione dell'intensità del segnale prima e da zero a tre ore dopo l'iniezione degli agenti di contrasto. Un mese dopo l'inoculazione, raccogliere il tessuto dal sito di inoculazione intradermica di ogni animale e macchiare le macchie di paraffina fissa formalina da cinque a 10 micrometri di spessore con ematossilina ed eosina, macchie di Ziehl-Neelsen per i batteri acido-veloci e blu di Berlino per il ferro ferrico.L'imaging a microscopia elettronica a trasmissione delle nanoprobe anticorpali superficiali SPIO-TB rivela che le nanoprobe mostrano un aspetto ben disperso con una dimensione media di 3,8 più o meno 0,4 nanometri per nucleo. M.bovis BCG e ceppo batterico acido-veloce possono essere rilevati attraverso la colorazione Ziehl-Neelsen. Dopo l'isolamento e la coltura con sonde contenenti ferro ferrico, i batteri possono essere identificati attraverso la colorazione blu di Berlino.Il grado di puntamento della TBC delle nanoprobe anticorpali superficiali SPIO-TB può essere determinato attraverso la risonanza magnetica ponderata T2 come indicato da una diminuzione dell'intensità del segnale in presenza delle nanoprobe che si verifica in modo dipendente dalla concentrazione. Negli animali iniettati da nanoprobe, il miglioramento ponderato T2 della riduzione del segnale nelle aree di M.tuberculosis granulomatis è circa 14 volte superiore a quello dei siti di controllo. Un mese dopo l'infezione, un granuloma sottocutaneo organizzato può essere osservato nei topi C57 black 6 iniettati con nanoprobe con nuova vascolarizzazione del sangue e aggregati di macrofagi linfociti ed epitelioidi noti all'interno di queste lesioni.L'espressione positiva di M.tuberculosis si osserva anche nelle aree granulomatose con bacilli acido-veloci che macchiano positivi nel sito di lesione. Il blu di Berlino, una macchia positiva in ferro ferrico, può anche essere usato per determinare la sensibilità delle sonde alla TBC. Per l'immagine di risonanza magnetica in vivo della vita, gli animali iniettati da nanoprobe acquisiscono l'immagine di spin-echo veloce ponderata in T2 di ogni animale sperimentale anestetizzato prima di iniettare le sonde anticorpali SPIO-TB. Ora che abbiamo stabilito la tecnica SOP per rilevare la tubercolosi extrapolmonare, questi anticorpi possono essere usati per diagnosticare specificamente la tubercolosi extrapolmonare.

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