Name: synthesis, characterization, and application of superparamagnetic iron oxide nanoprobes for extrapulmonary tuberculosis detection
Uploaded: 2020-02-16T12:00:00
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Los autores están agradecidos por el apoyo financiero del Ministerio de Economía de Taiwán (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) para realizar este trabajo de investigación. Este manuscrito fue editado por Wallace Academic Editing.

Todo protocolo relativo al experimento con animales sigue los procedimientos operativos estándar para la cría de animales de laboratorio de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición, 2011) y está aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
1. Síntesis de nanopartículas SPIO
<ol><li>Preparar nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubiertas de dextran agitando vigorosam...

<ol>
	<li>Small, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+tuberculosis+in+patients+with+advanced+human+immunodeficiency+virus+infection.">Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection.</a> New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).</li><li>Alvarez, S., McCabe, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+tuberculosis+revisited:+a+review+of+experience+at+Boston+City+and+other+hospitals.">Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals.</a> Medicine. 63, 25-55 (1984).</li><li>Ozbay, B., Uzun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+tuberculosis+in+high+prevalence+of+tuberculosis+and+low+prevalence+of+HIV.">Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV.</a> Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).</li><li>Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+extrapulmonary+tuberculosis+in+a+Danish+university+clinic.">Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic.</a> Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).</li><li>Steingart, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+commercial+serological+antibody+detection+tests+for+the+diagnosis+of+extrapulmonary+tuberculosis.">A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.</a> Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).</li><li>Liao, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+performance+of+an+enzyme-linked+immunospot+assay+for+interferon-gamma+in+extrapulmonary+tuberculosis+varies+between+different+sites+of+disease.">Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease.</a> Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+usefulness+of+a+T-cell+based+assay+for+extrapulmonary+tuberculosis.">Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis.</a> Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+usefulness+of+a+T-cell-based+assay+for+extrapulmonary+tuberculosis+in+immunocompromised+patients.">Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients.</a> The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).</li><li>Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review:+T-cell-based+assays+for+the+diagnosis+of+latent+tuberculosis+infection:+an+update.">Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update.</a> Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).</li><li>Kobashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+T+cell-based+assay+in+the+diagnosis+of+extrapulmonary+tuberculosis.">Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis.</a> Respirology. 14, 276-281 (2009).</li><li>Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+tuberculosis+epididymo-orchitis+by+INNO-LiPA+Rif+TB+and+QuantiFERON-TB+Gold+In+Tube+tests:+case+report.">Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).</li><li>Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculous+meningitis+by+polymerase+chain+reaction+(PCR).">Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR).</a> Neurology. 40, 1617 (1990).</li><li>Bhigjee, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+tuberculous+meningitis:+clinical+and+laboratory+parameters.">Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters.</a> International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).</li><li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+cells:+labelling+proteins+with+fluorophores.">Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).</li><li>Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging.">Molecular imaging.</a> Radiology. 219, 316-333 (2001).</li><li>Gupta, A. K., Gupta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+surface+engineering+of+iron+oxide+nanoparticles+for+biomedical+applications.">Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).</li><li>Talelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+encapsulated+in+biodegradable+thermosensitive+polymeric+micelles:+toward+a+targeted+nanomedicine+suitable+for+image-guided+drug+delivery.">Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery.</a> Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+toxicity+and+kinetic+study+of+Cy5.5-conjugated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+by+optical+imaging.">Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).</li><li>Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles.">Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).</li><li>Chen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+folic+acid-PEG+nanoparticles+for+noninvasive+imaging+of+folate+receptor+by+MRI.">Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).</li><li>Chen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Herceptin-dextran+iron+oxide+nanoparticles+for+noninvasive+imaging+of+HER2/neu+receptors+using+MRI.">Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).</li><li>Weissleder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+superparamagnetic+iron+oxide:+an+intravenous+contrast+agent+for+assessing+lymph+nodes+with+MR+imaging.">Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging.</a> Radiology. 175, 494-498 (1990).</li><li>Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+a+significant+source+of+type+1+cytokines+during+mycobacterial+infection.">Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).</li><li>Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+different+strengths+of+carbol+fuchsin+in+Ziehl-Neelsen+staining+for+detecting+acid-fast+bacilli.">Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).</li><li>Woods, A. E., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).</li><li>Lee, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-paramagnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+use+in+extrapulmonary+tuberculosis+diagnosis.">Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).</li><li>Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+bacteria+using+core-shell+nanoparticles+and+an+NMR-filter+system.">Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popcorn-shaped+magnetic+core-plasmonic+shell+multifunctional+nanoparticles+for+the+targeted+magnetic+separation+and+enrichment,+label-free+SERS+imaging,+and+photothermal+destruction+of+multidrug-resistant+bacteria.">Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria.</a> Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).</li><li>Nishie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+human+monocytic+cellular+activity+using+superparamagnetic+iron+oxide.">In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).</li><li>von Zur Muhlen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superparamagnetic+iron+oxide+binding+and+uptake+as+imaged+by+magnetic+resonance+is+mediated+by+the+integrin+receptor+Mac-1+(CD11b/CD18):+implications+on+imaging+of+atherosclerotic+plaques.">Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques.</a> Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).</li></ol>

Al igual que en estudios relevantes, nuestros hallazgos sobre nanosondas SPIO-MtbsAb demostraron una especificidad significativa para Mtb27,28. El granuloma subcutáneo de Mtb se encontró 1 mes después de la inyección de tuberculosis en los modelos de ratón. Los hallazgos típicos de la histología granulomatosa de tuberculosis incluyeron infiltración de linfocitos, presencia de macrófagos epitelioides y neovascularización. Los bacilos ácidos rápidos se ...

A nivel mundial, la tuberculosis extrapulmonar representa una proporción significativa de los casos de tuberculosis (TB). Sin embargo, el diagnóstico de ETB a menudo se olvida o se retrasa debido a su insidiosa presentación clínica y el bajo rendimiento en las pruebas diagnósticas; los resultados falsos incluyen frotis de esputo negativos para bacilos ácidos rápidos, falta de tejido granulomatoso en histopatología o falta de cultivo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). En relación con los casos típicos, la ETB ocurre con menos frecuencia e implica poca liberación de los bacilos de Mtb. Además, generalmente se localiza en sitios de difícil acceso, como ganglios linfáticos, pleura y áreas osteoarticulares1. Así, los procedimientos invasivos para la obtención de muestras clínicas adecuadas, lo que hace que la confirmación bacteriológica sea arriesgante y difícil, son esenciales2,3,4.
Las pruebas de detección de anticuerpos disponibles comercialmente para la ETB no son fiables para la detección clínica debido a su amplia gama de sensibilidad (0,00-1,00) y especificidad (0,59-1,00) para todos los sitios extrapulmonares combinados5. Los ensayos de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT) para el interferón, la proteína filtrada de cultivo (CFP) y el objetivo antigénico del secretor temprano (ESAT) se han utilizado para diagnosticar la tuberculosis latente y activa. Sin embargo, los resultados varían entre diferentes sitios de la enfermedad para el diagnóstico de ETB6,7,8. Además, la piel PPD (derivado de proteína purificada) y QuantiFERON-TB con frecuencia proporcionaron resultados falsos negativos9. QuantiFERON-TB-2G es un ensayo de reactividad inmune de sangre completa, que no requiere una muestra del órgano afectado y puede ser una herramienta de diagnóstico alternativa6,10,11. Otros métodos de diagnóstico utilizados normalmente para la meningitis por tuberculosis, como la reacción en cadena de la polimerasa, siguen siendo demasiado insensibles a excluir con confianza el diagnóstico clínico12,13. Estas pruebas convencionales demuestran información diagnóstica insuficiente para descubrir el sitio de infección extrapulmonar. Por lo tanto, se requieren clínicamente nuevas modalidades de diagnóstico.
La imagen molecular tiene como objetivo diseñar nuevas herramientas que puedan examinar directamente objetivos moleculares específicos de los procesos de la enfermedad in vivo14,15. El óxido de hierro superparamagnético (SPIO), un agente de contraste de RMN ponderado por T2, puede mejorar significativamente la especificidad y sensibilidad de la resonancia magnética (RM)16,17. Esta nueva modalidad de imagen funcional puede esbozar con precisión los cambios de tejido a nivel molecular a través de interacciones ligando-receptor. En este estudio, se sintetizó una nueva sonda de imágenes moleculares, que comprende nanopartículas SPIO, para conjugar con el anticuerpo de superficie Mtb (MtbsAb) para el diagnóstico de ETB. Las nanosondas SPIO son mínimamente invasivas para los tejidos y cuerpos bajo examen18,19. Además, estas nanosondas pueden demostrar imágenes mr precisas a bajas concentraciones debido a sus propiedades paramagnéticas. Además, las nanosondas SPIO aparecen que son menos alérgicas porque la presencia de iones de hierro es parte de la fisiología normal. Aquí, la sensibilidad y especificidad de las nanosondas SPIO-MtbsAb dirigidas a ETB se evaluaron tanto en modelos celulares como animales. Los resultados demostraron que las nano sondas eran aplicables como agentes de imágenes ultrasensibles para el diagnóstico de ETB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hydroxybenzotriazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextran(T-40)</td>
			<td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epichlorohydrin, 2,2&#39;-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride hexahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferrous chloride tetrahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human monocytic THP-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M. bovis BCG</td>
			<td>Pasteur M&#233;rieux</td>
			<td>Connaught strain; ImmuCyst Aventis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI</td>
			<td>GE medical Systems</td>
			<td>3.0-T, Signa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR relaxometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NMS-120 Minispec</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-300</td>
			<td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25</td>
			<td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off</td>
			<td>Spectrum Laboratories Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb</td>
			<td>Acris Antibodies GmbH</td>
			<td>BP2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2000 EX II</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis, characterization, and application of superparamagnetic iron oxide nanoprobes for extrapulmonary tuberculosis detection

Se sintetizó una sonda de imagen molecular compuesta por nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) y anticuerpos superficiales de Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) para mejorar la sensibilidad a la toma de imágenes para la tuberculosis extrapulmonar (ETB). Una nanosonda SPIO fue sintetizada y conjugada con MtbsAb. La nanosonda sPIO-MtbsAb purificada se caracterizó utilizando TEM y NMR. Para determinar la capacidad de focalización de la sonda, las nanosondas SPIO-MtbsAb se incubaron con Mtb para ensayos de imágenes in vitro y se inyectaron en ratones inoculados por Mtb para la investigación in vivo con resonancia magnética (RM). La reducción de la mejora del contraste en la resonancia magnética (RM) de las células Mtb y THP1 mostró proporcional a la concentración de nanosondas SPIO-MtbsAb. Después de 30 minutos de inyección intravenosa de nanosondas SPIO-MtbsAb en ratones infectados por Mtb, la intensidad de la señal del sitio granulomatoso se mejoró por 14 veces en las imágenes de RM ponderadas por T2 en comparación con la de los ratones que recibieron inyección de PBS. Las nanosondas MtbsAb se pueden utilizar como una modalidad novedosa para la detección de ETB.

Síntesis y caracterización de nanosondas SPIO-MtbsAb Las nanopartículas SPIO fueron diseñadas para conjugar con MtbsAb. El dextran estabilizado en la superficie de las nanopartículas SPIO fue reticulado por epiclorohydrin. Posteriormente se incorporaron nanopartículas SPIO con EDBE para activar grupos funcionales de amina primaria en los extremos de la dextran. SA fue conjugada para formar SPIO-EDBE-SA. Las nanosondas SPIO-MtbsAb se formaron en el último paso a través de la conjugación de Mtb...

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Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Para mejorar las pruebas diagnósticas serológicas de antígenos de Mycobacterium tuberculosis, desarrollamos nanosondas de óxido de hierro superparamagnético para detectar la tuberculosis extrapulmonar.

Síntesis, caracterización y aplicación de nanosondas de óxido de hierro superparamagnético sin empleo para la detección de tuberculosis extrapulmonar

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

A nivel mundial, el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar a menudo se retrasa, ya que requiere una intervención quirúrgica para la confirmación debido a una presentación clínica no específica y un bajo rendimiento en las pruebas diagnósticas. Para mejorar las pruebas diagnósticas serológicas de los antígenos De Mycobacterium tuberculosis, hemos desarrollado nanosondas de óxido de hierro superparamagnéticas para detectar tuberculosis extrapulmonar. Las nano sondas TB-SPIO pueden proporcionar imágenes precisas de resonancia magnética a bajas concentraciones debido a sus propiedades paramagnéticas sin inducir ninguna respuesta autoinmune.Las nanosondas TB-SPIO permiten la focalización y detección de la infección por Mycobacterium tuberculosis. También se pueden aplicar como agente de contraste de RMN para la detección de otras enfermedades. Asegúrese de estudiar el protocolo cuidadosamente antes de intentar el protocolo, ya que cada parte del experimento utiliza una tecnología de núcleo específica.La demostración visual del método puede ayudar a los alumnos a entender cómo implementar el proceso, especialmente para algunos de los experimentos más complicados. Para preparar nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubierto de dextrano, combine vigorosamente cinco mililitros de dextrano T40 con 45 miligramos de cloruro férrico acuoso hexahidrato y 32 miligramos de soluciones tetrahidratos de cloruro ferroso a temperatura ambiente. Agregue rápidamente 10 mililitros de hidróxido de amonio y utilice una barra de agitación para agitar la suspensión negra resultante durante una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación de agitación, centrifugar la solución y retirar los agregados. Para separar los productos SPIO finales del dextrano T40 sin ataduras, cargue toda la mezcla de reacción de cinco mililitros en una columna de cromatografía de filtración de gel de 2,5 por 33 centímetros y eluda el dextrán con 0,1 molar de acetato de sodio y 0,15 molares de solución tampón de cloruro sódico. A continuación, recoja las nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubiertas de dextrano purificadas en el volumen vacío y ensaye la columna para hierro y dextrán a 330 y 490 nanómetros de acuerdo con los protocolos estándar.Para crear anticuerpos superficiales conjugados con SPIO Mycobacterium tuberculosis, primero sintetice el anhídrido succínico SPIO-EDBE mezclando 10 mililitros de una solución alcalina de SPIO-EBDE con un gramo de anhídrido succínico durante 24 horas a temperatura ambiente. Al día siguiente, utilice un tubo de membrana porosa molecular de 12.000 a 4.000 peso molecular para marcar la solución con cambios de 26 horas de dos litros de agua destilada por cambio. Después del último cambio, añadir 100 microlitros de la solución resultante a 400 microlitros de 4,5 miligramos por mililitrofers TB anticuerpo de superficie, seguido de la adición de 1-hidroxibenzotriazol y benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinophosphonium hefluorxaophosphate as catalysts at room temperature for 24 hours with stirring.Separe las soluciones del anticuerpo no enlazado a través de la cromatografía de filtración de gel utilizando PBS como tampón. Para determinar el tamaño medio de partícula, la morfología y la distribución del tamaño, suelte la dispersión compuesta en una rejilla de cobre de 200 mallas y seque la muestra al aire a temperatura ambiente antes de cargarla en un microscopio electrónico de transmisión para obtener imágenes a 100 kilovoltas. Para medir los valores de tiempo de relajación de las nano sondas, utilice un relajanteómetro de resonancia magnética nuclear a 20 megahercios y 37 grados Centígrados más o menos un grado.Para las imágenes celulares pulsadas por nanosondas, primero cultive monocitos humanos de THP-1 de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular. Cuando las células han alcanzado la etapa apropiada de activación, preincubate una vez 10 a los siete monocitos con una por 10 a las sextas unidades formadoras de colonias de Mycobacterium bovis BCG durante una hora. Al final de la incubación, transfiera las células a tubos de microcentrífuga de un mililitro y agregue dos mililitros de nanosondas conjugadas con anticuerpos conjugados con anticuerpos de superficie SPIO Mycobacterium tuberculosis a cada tubo para una incubación de una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 200 microlitros de medio fresco. A continuación, escanee las muestras utilizando una secuencia de pulsos de eco de gradiente rápido a través de imágenes de resonancia magnética de 3.0-T para determinar la especificidad y sensibilidad de las nanosondas. Para inocular animales experimentales con M.bovis BCG, primero reconstituya la vacuna liofilizada o el stock bacteriano en el medio de Sauton y diluya la solución reconstituida con solución salina.A continuación, cargue 100 microlitros de la solución en una jeringa de un mililitro por animal e inyecte todo el volumen de bacterias intradérmicamente en la piel escapulosa dorsal izquierda o derecha de cada ratón. Para la resonancia magnética in vivo de animales vivos inyectados con nanosaldades, adquiera imágenes basales de eco de giro rápido ponderadas en T2 de cada animal experimental anestesiado antes de inyectar dos nanomolares de sondas de anticuerpos SPIO-TB suspendidas en 200 microlitros de solución salina en la vena de la cola de cada ratón. A continuación, vuelva a hacer la imagen de los animales inmediatamente después de la inyección y cada cinco minutos durante los siguientes 30 minutos.Al final de la sesión de imágenes, analice cuantitativamente todas las imágenes de resonancia magnética utilizando la intensidad de la señal como medida de las regiones definidas de interés en lugares comparables de un centro de granuloma M.tuberculosis y el músculo posterior adyacente a un área de granulomatis. A continuación, utilice la fórmula para calcular las mejoras relativas de la señal utilizando la medición de intensidad de la señal antes y de cero a tres horas después de la inyección de los agentes de contraste. Un mes después de la inoculación, recoger el tejido del sitio de inoculación intradérmica de cada animal y manchar las muestras de tejido de cinco a 10 micras de espesor incrustadas en formalina con hematoxilina y eosina, manchas de Ziehl-Neelsen para bacterias ácidas y rápidas, y azul de Berlín para hierro férrico.Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de nanosondas de anticuerpos superficiales SPIO-TB revelan que las nanosondas presentan un aspecto bien disperso con un tamaño promedio de 3,8 más o menos 0,4 nanómetros por núcleo. M.bovis BCG y la cepa bacteriana ácida rápida se pueden detectar a través de la tinción de Ziehl-Neelsen. Después del aislamiento y el cultivo con sondas que contienen hierro férrico, las bacterias se pueden identificar a través de la tinción azul de Berlín.El grado de focalización de la tuberculosis de las nano sondas de anticuerpos superficiales SPIO-TB se puede determinar mediante imágenes de resonancia magnética ponderadas por T2, tal como se indica mediante una disminución de la intensidad de la señal en presencia de las nanosondas que se producen de manera dependiente de la concentración. En los animales con inyección de nanosonda, la mejora ponderada por T2 de la reducción de la señal en las zonas de M.tuberculosis granulomatis es aproximadamente 14 veces mayor que la de los sitios de control. Un mes después de la infección, se puede observar un granuloma subcutáneo organizado en ratones C57 negros C57 con nueva vascularización sanguínea y agregados de macrófagos linfocitos y epiteloides observados dentro de estas lesiones.La expresión positiva de M.tuberculosis también se observa en las áreas granulomatosas con tinción de bacilos ácido-rápido positiva positiva en el sitio de la lesión. El azul berlineso, una mancha positiva de hierro férrico, también se puede utilizar para determinar la sensibilidad de las sondas a la tuberculosis. Para la resonancia magnética in vivo de la vida, los animales inyectados con nanopiro adquieren la imagen basal de eco de giro rápido ponderada en T2 de cada animal experimental anestesiado antes de inyectar las sondas de anticuerpos SPIO-TB. Ahora que hemos establecido la técnica SOP para detectar la tuberculosis extrapulmonar, estos anticuerpos se pueden utilizar para diagnosticar específicamente la tuberculosis extrapulmonar.

Research

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Medicine

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