Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

هذا البحث كان يدعمها "العلم بحوث البرامج الأساسية" (2015R1C1A1A02036887 وجبهة الخلاص الوطني-2016R1A2B4014795) من خلال "مؤسسة البحوث الوطنية كوريا" تموله وزارة العلوم، تكنولوجيا المعلومات والاتصالات "برنامج مركز بحوث رائدة" (2011-0027921)، "تخطيط المستقبل"، ومنحة من كوريا الصحة التكنولوجيا والتطوير د المشروع من خلال معهد التنمية الصناعة (خيدي) كوريا الصحة، تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (HI15C1540).

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة كونكوك المؤسسية.
1-[اغروس] الملح الجسور بين حل حمام وقطب مرجعي Ag/AgCl
ملاحظة: [اغروس] 3 م بوكل تنتج الملح الجسور كما سبق وصف12 مع وجود اختلافات طفيفة.
<ol><li>تشكيل الجسور<ol>
<li>ثني الأنابيب ?...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+mechanically+activated+ion+channel,+is+required+for+vascular+development+in+mice.">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li><li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4-mediated+endothelial+Ca2++influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress.">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li><li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension.">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2++channel+via+enhancement+of+Ca2+-induced+Ca2++release+in+rat+ventricular+myocytes.">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K++current+by+convectively+restoring+[K+]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585 (2016).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena.">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2++channel+activation+in+vascular+myocytes.">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li><li>. A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

وفي هذه الدراسة، أثبتنا طريقة لقياس تركيز Cl– الحقيقية في طبقة أونستيريد المتاخمة للقطب مرجع Ag/AgCl بتحديد تقاطع السائل المعدنية المحتملة مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة مليئة بوكل عالية التركيز. يمكن أن يؤدي التغيير في تركيز Cl– في طبقة الحدود تحولاً إمكانات تقاطع عند التبديل من ثا...

تدفق السائل هو جديلة بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية والقص السائل تعتمد على قوة الأوعية الدموية يعيد البناء والتنمية1،2، 3،،من45. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل ليست مفهومة تماما، هو يعتقد أن السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة قد تسهم حاسمة في الاستجابات الناجمة عن تدفق السوائل5 , 6 , 7 , 8. على سبيل المثال، تنشيط مقوم إلى الداخل بطانية Kir2.1 و Ca2 +-تنشيط ك+ (2.3 كالمرجع المصدق، KCNN3) القنوات بعد قد اقترح Ca2 + تدفق بتدفق السوائل للمساهمة في السوائل توسع الأوعية الناجمة عن تدفق6،،من78. لذلك، العديد من القنوات الأيونية، قنوات خاصة تنشيط ميكانيكيا أو-تحول دون، وقد درست من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع التصحيح-المشبك تقنية6،،من910 , 11-ومع ذلك، تبعاً للبروتوكول التجريبية التي يتم إجراؤها أثناء تسجيل التصحيح المشبك، النتائج وتفسير البيانات المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون يمكن أن تكون الخاطئة10،11.
مصدر واحد من التحف التي يسببها تدفق السائل في تسجيل التصحيح-المشبك من مفترق الطرق المحتملة بين السوائل حمام و القطب مرجع Ag/AgCl11. ويعتقد عموما أن تقاطع السائل/المعادن المحتملة بين سائل الاستحمام والقطب Ag/AgCl ثابت كما أن تركيز Cl– من سائل الاستحمام تظل ثابتة، النظر في الاستجابة الكيميائية بين الحل الاستحمام وقطب Ag/AgCl لتكون:
Ag + Cl–↔ AgCl + إلكترون (e–) (المعادلة 1)
ومع ذلك، في حالة حيث رد فعل الكهروكيميائية عموما بين حل الاستحمام والقطب مرجع Ag/AgCl (المعادلة 1) ينطلق من اليسار إلى اليمين، تركيز Cl– من سائل الاستحمام المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي (طبقة الحدود أونستيريد12،13،،من1415) قد تكون أقل بكثير من ذلك في الجزء الأكبر من الاستحمام الحل، ما لم تضمن ما يكفي النقل كونفيكشونال. استخدام قطب Ag/AgCl القديمة أو غير المثالية مع عدم كفاية كلورة Ag قد يزيد هذا خطر. ويمكن استبعاد هذه الأداة المتعلقة بتدفق السوائل في مسرى الإشارة، في الواقع، بمجرد وضع جسر [اغروس]-الملح تقليدية بين سائل الاستحمام ومرجع القطب، قطعة أثرية مبنية على التعديلات في Cl الحقيقي– تركيز المتاخمة ل القطب Ag/AgCl11. البروتوكول الواردة في هذه الدراسة، توضح هذه المقالة كيفية منع التغييرات المحتملة المتصلة بتدفق مفرق وقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيريد.
بعد وضع [اغروس] بوكل جسر بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl، هناك عامل حاسم آخر ينبغي النظر فيه: قطب Ag/AgCl فقط كالمرجع أعمال مثل قطب Cl– ، قنوات أيون أيضا يمكن أن تعمل مثل قطب الأيوني انتقائي. تنشأ حالة طبقة الحدود أونستيريد بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl أثناء حركة الأيونات بين الحلول خارج الخلية وداخل الخلية عن طريق قنوات أيون الغشاء. وهذا يعني أنه ينبغي توخي الحذر عند تفسير اللائحة لايون القنوات بتدفق السائل. كما نوقش في أعمالنا السابقة دراسة11، حركة الأيونات من خلال حل موجود تدرج الكهروكيميائية التي يمكن أن تحدث عن طريق ثلاث آليات متميزة: نشر، والهجرة، والحمل الحراري، حيث يتم نشر الحركة الناجمة عن الانحدار تركيز، الهجرة هي حركة يقودها التدرج الكهربائية، والحمل الحراري هو الحركة من خلال تدفق السائل. بين هذه الآليات النقل الثلاثة، يساهم الوضع الحراري معظمها إلى حركة أيونات11 (000 1 > مرة أكبر من نشرها أو الهجرة ضمن إعدادات التصحيح-المشبك المعتاد). وهذا يشكل الأساس النظري للسبب في مفرق المحتملة بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl يمكن جداً تحت ظروف ثابتة وتدفق السوائل المختلفة11.
حسب الفرضية المقترحة أعلاه، يمكن الاستدلال بعض الآثار مسهل لتدفق السوائل على قناة أيون الحالية من إعادة الحمل الحراري بتركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لمدخل القناة على سطح غشاء (طبقة الحدود أونستيريد) 10. في هذه الحالة، الآثار الناجمة عن تدفق السائل على أيون قناة التيارات نشأت من أحداث الكهروكيميائية، ليس من تنظيم أيون قناة النابضة ببساطة. واقترح باري والزملاء12،13،،من1415 استناداً إلى اعتبارات نظرية صارمة والأدلة التجريبية، والمعروف أيضا طبقة أونستيريد سابقا فكرة مماثلة أو تأثير عدد النقل. إذا كان بعض القنوات أيون كافية قد تنشأ الموصلية قناة واحدة وطويلة بما يكفي فتح الوقت لتوفير معدلات النقل كافية من خلال القنوات (أسرع معدل نقل في الغشاء من سطح غشاء أونستيريد،) تأثير طبقة الحدود . وهكذا، يمكن أن يسهم النقل الحراري-تعتمد على التسهيلات التي يسببها تدفق السائل في نهاية المطاف لايون الحالية10،،من1213،،من1415.
في هذه الدراسة، ونشدد على أهمية استخدام أجار أو [اغروس] الملح-جسر أثناء دراسة تنظيم التيارات أيون الناجم عن تدفق السائل. كما نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في أونستيريد الطبقة الحدودية المتاخمة لقنوات أيون Ag/AgCl القطب والغشاء مرجع. وعلاوة على ذلك، تفسير نظري للتحوير السوائل الناجم عن تدفق التيارات قناة أيون (أي فرضية الحراري أو تأثير طبقة أونستيريد النقل رقم) يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تصميم وتفسير الدراسات في القص القوة-تنظيم قنوات أيون. وفقا لتأثير طبقة الحدود أونستيريد رقم النقل، ونتوقع أن أيون قناة التيارات من خلال جميع أنواع غشاء أيون قنوات يمكن أن تيسره تدفق السوائل، مستقلة عن الحساسية البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل، ولكن فقط إذا قنوات أيون لها كافية قناة واحدة الموصلية وفتح-منذ وقت طويل. قد تزيد من أعلى الكثافات الحالية قناة أيون تأثير طبقة الحدود أونستيريد على سطح غشاء الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

تدفق السائل هو حافز بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية إلى قوة تدفق السائل/الإمالة ليست مفهومة تماما، قد تساهم السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة خطيرة. ولذلك، درست حساسية قوة تدفق السائل/القص قنوات أيون استخدام تقنية المشبك التصحيح. ومع ذلك، اعتماداً على البروتوكول التجريبي، والنتائج وتفسير البيانات يمكن الخاطئة. وهنا نقدم الأدلة التجريبية والنظرية للأخطاء المتعلقة بتدفق السوائل، وتوفير أساليب لتقدير ومنع وتصحيح هذه الأخطاء. التغييرات في مفرق المحتملة بين القطب مرجع Ag/AgCl وسوائل الاستحمام قيست مع ماصة مفتوحة مليئة 3 م بوكل. يمكن تدفق السائل ثم تحول mV تقاطع السائل/المعادن المحتملة إلى حوالي 7. على العكس من ذلك، عن طريق قياس الجهد التحول الناجم عن تدفق السوائل، قمنا بتقدير تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيريد. في حالة ثابتة، يمكن أن تصل إلى تركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي أو أيون قناة المدخل على سطح غشاء الخلية منخفضة حوالي 30% من أن في حالة تدفق. وضع [اغروس] 3 م بوكل جسر بين مسرى السائل ومرجع الاستحمام قد حالت هذه المشكلة من مفرق التحول المحتملة. ومع ذلك، يمكن أن لا ثابتة تأثير الطبقة أونستيريد متجاورة على سطح غشاء الخلية بهذه الطريقة. هنا، نحن نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة، مؤكدا على أهمية استخدام ملح على [اغروس]-جسر أثناء دراسة تنظيم السوائل الناجم عن تدفق التيارات أيون. ولذلك، هذا النهج المبتكر، الذي يأخذ في الاعتبار الحقيقي تركيزات الأيونات في طبقة الحدود أونستيريد، قد توفر نظرة مفيدة على التصميم التجريبي وتفسير البيانات المتصلة بتنظيم السوائل القص إجهاد قنوات أيون .

وسجلت الخلية كلها تعتمد على الجهد Ca L من نوع2 + قناة (فدككل) التيارات في myocytes الشرياني المساريقي العلوي الفئران انزيماتيكالي مشتتة، كما هو موضح سابقا11. وقد دياليزيد myocytes الشرياني مع حل ماصة Cs غنية تحت التكوين مثقوبة النيستاتين مع الحل divalent الاستحم?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

غالباً ما تتم دراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع تسجيل التصحيح-المشبك. مع ذلك، يمكن النتائج المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون تبعاً للبروتوكول التجريبي، والخاطئة. هنا، نحن نقدم طرق لمنع وتصحيح مثل هذه الأخطاء مع أساس نظري.

قياس تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك التصحيح مفتوحة: تدفق الآثار في السيطرة على قنوات أيون بالسوائل

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

يمكن أن يساعد هذا الطرح في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الكهربائي الفسيولوجي، مثل تدفق السوائل في لوائح القنوات الأيونية فقط. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقدير التركيز الأيوني الفعلي في طبقة الحدود غير ثنائية من سطح الغشاء لتفسير البيانات المتعلقة بتنظيم تدفق السوائل للقنوات الأيونية. لبدء هذا الإجراء، ثني أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجي النار لتشكيل شكل U.يجب أن يكون القطر الداخلي للشعر الشعري كبيرًا بما يكفي لتقليل مقاومة السلسلة عند تسجيل التيارات الأيونية الكبيرة. بعد ذلك، قم بحل ثلاثة غرامات من الأاغروز في 100 ملليلتر من كلوريد البوتاسيوم ثلاثي المولر، ووضعها على صفيحة ساخنة بين 90 و 100 درجة مئوية. ثم، تحميل الجسر مع كلوريد البوتاسيوم agarose، عن طريق غمر الجسر الزجاجي في الحل.يبقيه بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لأغاروز لتعيين وتصلب. في اليوم التالي، قم بحفر جسر أغاروز كلوريد البوتاسيوم المحملة بكلوريد من ملح agarose المتصلب. تخزين الجسر في زجاجة واسعة العنق من كلوريد البوتاسيوم ثلاثة المولار في الثلاجة.في هذا الإجراء، ضع حاوية محملة بمحلول الاستحمام، فوق حجرة المشبك. المقبل، ملء غرفة التصحيح المشبك مع حل الاستحمام عن طريق شفط الأنبوب. لوقف تدفق السوائل، مقطع الأنبوب على جانب الحاوية، لمنع تدفق السوائل.ثم مقطع الأنبوب في الجانب شفط لوقف الشفط في نفس الوقت. هذه هي حالة التحكم الثابتة. لتطبيق تدفق السوائل قوة القص، وفتح كلا الأنابيب على جانبي الحاوية والشفط في نفس الوقت.قبل أو بعد تطبيق تدفق السائل قوة القص إلى الخلية، وحساب معدل التدفق في المليلتر في الدقيقة الواحدة عن طريق قياس الانخفاض في حجم السوائل على مدى وقت معين. لقياس التغيرات في إمكانات تقاطع المعادن السائلة، وإعداد المالحة الفسيولوجية الطبيعية لغرفة الاستحمام، ومقارنتها في غياب وجود جسر كلوريد البوتاسيوم أجار. بعد ذلك، ضع ماصة التصحيح التي تحتوي على محلول كلوريد البوتاسيوم ثلاثة المولر في الغرفة، لتقليل التحول المحتمل تقاطع بين الماصات وحلول الاستحمام.ثم تعيين مضخم الجهد المشبك إلى وضع المشبك الحالي. بعد إبطال إمكانات الإزاحة الأولية، قم بقياس التغيرات في الجهد الناتج عن اختلاف معدلات التدفق. للتحقق من أن التغيرات في الجهد الكهربائي هي إمكانات تقاطع المعادن السائلة، إعادة النظر في تأثير تدفق السوائل على إمكانية تقاطع، وذلك باستخدام جسر الملح agarose بين محلول الحمام والأقطاب المرجعية.مع نتائج التغيرات في إمكانات تقاطع المعادن السائلة، رسم الدالة المحتملة علاقات معدل التدفق، وتقدير القيمة المشبعة من التحول المحتملة الوصلة من قبل معدل التدفق فوق السوائل. ثم، تغيير تركيز كلوريد في سائل الاستحمام، ورسم وصلة احتمالية علاقة تركيز كلوريد. لاحظ أن معدل السائل يجب أن يكون ثابتاً، وعالياً بما فيه الكفاية لمنع انخفاض تركيز الكلوريد إلى القطب المرجعي للكلوريد الفضي والفضي المجاور.من منحنيات العلاقة اثنين، تقدير التغيرات في تركيز كلوريد من التحول المحتمل الوصلة قياس. تم تسجيل التيارات VDCC-L في الفئران المنتشرة الأنزيمية mesenteric myocytes الشرايين، مع تسجيل nystatin مثقب التصحيح المشبك. مع جسر كلوريد البوتاسيوم agarose، يمكن تقليل إمكانات التقاطع بين القطب المرجعي وحلول الاستحمام، وزيادة تدفق السوائل الجهد VDCC-L الحالي بشكل مستقل.ومع ذلك، عندما كان القطب المرجعي للكلوريد الفضي والفضة متصلاً مباشرة بسائل الاستحمام، دون جسر كلوريد البوتاسيوم agarose، تحولت العلاقة IV في وجود تدفق السوائل إلى اليمين، مقارنة بتلك التيارات VDCC-L في ظل حالة ثابتة. يمكن تفسير الزيادة الناجمة عن تدفق السوائل من تيارات كير 2.1 ، والتي تم تسجيلها في خلايا سرطان الدم القاعدي للفئران مع جسر agarose ، بتأثير الطبقة غير المنتهكة. بعد تطويره، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في أكثر من علم وظائف الأعضاء الكهربائية.لذلك هو لتنظيم تدفق السوائل في التيارات قناة أيون. من حيث الظواهر الكهروكيميائية، في طبقة الحدود غير ثنائية في سطح غشاء الخلية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

التصحيح تسجيلات المشبك على سليمة الظهرية جذر العقد من الجرذان الكبار

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

إعداد منتجات الأسماك المخمرة عالية الجودة

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

فحص الجليكوزيلاز Uracil-DNA بواسطة تحليل الطيف الكتلي للامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...