Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Cette recherche a été financée par le programme de centre de recherche de Pioneer (2011-0027921), de programmes de recherche sciences fondamentales (2015R1C1A1A02036887 et 2016R1A2B4014795-NRF) par le National Research Foundation of Korea financé par le ministère de la Science, TIC & Avenir de planification et par une subvention de la Corée Health Technology R & D Project à travers la Corée santé industrie développement Institut (KHIDI), financé par le ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (HI15C1540).

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles de Konkuk University.
1. Agarose sel ponts entre la Solution de bain et l’électrode de référence Ag/AgCl
Remarque : Agarose 3M KCl ponts salins sont produites comme précédemment décrit12 avec des variations mineures.
<ol><li>Formation de ponts<ol>
<li>Courber les tubes capillaires de verre feu pour former une U-forme le cas échéant. Le di...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4-mediated+endothelial+Ca2++influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress.">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li><li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension.">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2++channel+via+enhancement+of+Ca2+-induced+Ca2++release+in+rat+ventricular+myocytes.">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li><li>Kim, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. 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A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

Dans cette étude, nous avons démontré une méthode pour mesurer la véritable concentration Cl– dans la couche stationnaire adjacente à l’électrode de référence Ag/AgCl en déterminant le potentiel de jonction liquide métallique avec une pipette de patch clamp ouvert remplie d’une haute KCl concentration. La variation de concentration Cl– dans la couche limite peut entraîner un changement de potentiel de jonction lors du passage du statique à des conditions de flux de fluide. Simpl...

Écoulement de fluide est un important signal environnemental qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide et cisaillement fluide force dépendant vasculaire remodelage et développement1,2, 3,4,5. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement du fluide force de cisaillement ne sont pas totalement comprises, on croit que régulation débit liquide de blocage de canal ionique critique contribue aux réponses induites par écoulement fluide5 , 6 , 7 , 8. par exemple, l’activation de l’endothélium redresseur entrant Kir2.1 et Ca2 +-activé K+ (KCa2.3, KCNN3) canaux après l’influx de Ca2 + par l’écoulement du fluide a été suggéré de contribuer au fluide vasodilatation induite par le flux de6,7,8. Par conséquent, de nombreux canaux ioniques, canaux spécialement activés mécaniquement ou - inhibés, ont été étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec le patch clamp technique6,9,10 , 11. Toutefois, selon le protocole expérimental effectué au cours de l’enregistrement patch clamp, résultats et interprétation des données sur les flux de fluides-règlements des canaux ioniques peuvent être erronée10,11.
Une source d’artefacts d’induite par le flux de fluide dans l’enregistrement patch-clamp est de la jonction éventuelle entre le fluide de baignoire et d’électrode Ag/AgCl référence11. On croit généralement que la jonction liquide/métal potentielle entre le bain fluide et électrode Ag/AgCl est constante que la concentration en Cl– du bain liquide est maintenue constante, compte tenu de la réaction chimique entre la solution de trempage et électrode Ag/AgCl pour être :
AG + Cl–↔ AgCl + électron (e–) (équation 1)
Toutefois, dans un cas où la réaction électrochimique globale entre la solution de trempage et l’électrode de référence Ag/AgCl (équation 1) procède de gauche à droite, la concentration en Cl– le liquide de bain adjacente à l’Ag/AgCl référence électrode (couche limite stationnaire12,13,14,15) peut être beaucoup plus faible que dans la majeure partie de la solution, de baignade, à moins que suffisamment transport par convection est assurée. En utilisant une électrode Ag/AgCl vieux ou non idéales avec chloration insuffisante de l’Ag peut augmenter ce risque. Cet artefact axés sur les flux de fluide à l’électrode de référence, en fait, peut être exclu en plaçant simplement un pont d’agarose-sel classique entre le fluide de la baignade et la référence électrode, étant donné que l’artefact est issu des altérations en véritable Cl– concentration d’adjacente à électrode Ag/AgCl11. Le protocole présenté dans la présente étude décrit comment empêcher les changements potentiels de jonction axés sur les flux et mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire.
Après avoir placé un gel d’agarose pont de KCl entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl, il y a un autre facteur crucial qui devrait être considéré : tout comme la référence électrode Ag/AgCl agit comme une électrode Cl– , les canaux ioniques peuvent également fonctionner comme une électrode sélective des ions. La situation d’une couche limite stationnaire entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl se présente pendant le mouvement des ions entre les solutions extracellulaires et intracellulaires par le biais de canaux ioniques membranaires. Cela implique que l’attention doit être utilisé lors de l’interprétation de la réglementation des ions canaux par l’écoulement du fluide. Tel que mentionné dans notre précédente étude11, le mouvement des ions à travers une solution dans laquelle existe un gradient électrochimique peut se produire par l’intermédiaire de trois mécanismes distincts : diffusion, migration et convection, où la diffusion est le mouvement induite par le gradient de concentration, la migration est le mouvement conduit par gradient électrique et convection est le mouvement par le biais de flux de fluide. Parmi ces mécanismes de trois transport, mode convection qui contribue le plus à la circulation des ions11 (> 1 000 fois supérieures à la diffusion ou de la migration sous paramètres habituels patch clamp). Celui-ci constitue la base théorique de pourquoi jonction éventuelle entre le fluide de la baignade et électrode de référence Ag/AgCl peut très sous différentes conditions statiques et les flux de fluide11.
Selon l’hypothèse proposée plus haut, certains effets facilitateur de débit des fluides sur le canal ionique actuel peuvent être déduites de la convection restauration des concentrations en ion réelle adjacentes à l’entrée du canal à la surface de la membrane (couche limite stationnaire) 10. dans ce cas, les effets d’induite par le flux de fluide sur les courants des canaux ioniques ont simplement découler d’événements électrochimiques, pas de la régulation des processus de blocage de canal ionique. Une idée similaire a été précédemment suggérée par Barry et ses collègues12,13,14,15 basée sur des considérations théoriques rigoureuses et des preuves expérimentales, également connu sous le nom de la couche stationnaire ou effet numéro de transport. Si certains canaux ioniques ont suffisamment la conductance monocanal et assez longtemps ouverte-le temps de fournir des taux de transport suffisante par tous les canaux (un plus rapide taux de transport dans la membrane que dans la surface de la membrane stationnaire), un effet couche limite peuvent survenir . Ainsi, le transport par convection-dépendante peut contribuer à éventuelles facilitations induite par fluide-flux d’ion actuel10,12,13,14,15.
Dans cette étude, nous insistons sur l’importance d’utiliser une gélose ou agarose sel-pont alors qu’il étudie la régulation induite par fluide-flux des courants ioniques. Nous fournissons également une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire adjacente aux Ag/AgCl référence électrode et membrane canaux ioniques. En outre, l’interprétation théorique de fluide modulation induite par le flux des courants des canaux ioniques (c.-à-d., hypothèse de convection ou effet numéro de transport couche stationnaire) peut fournir des indications précieuses pour la conception et l’interprétation des études sur la force de cisaillement-règlement des canaux ioniques. Selon l’effet numéro de la transport couche limite stationnaire, nous prédisons que les courants des canaux ioniques à travers tous les types de canaux ioniques membranaires peuvent être facilitées par l’écoulement du fluide, indépendamment de leur sensibilité biologique à force de cisaillement du fluide, mais seulement si les canaux ioniques ont suffisamment monocanal conductance et ouvert long-temps. Densités de courant plus élevées ion channel peut augmenter l’effet de la couche limite stationnaire à la surface de la membrane cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

Écoulement de fluide est un stimulus environnemental important qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement fluide/shear force ne sont pas totalement comprises, régulation débit liquide de blocage de canal ionique peut contribuer critique. Par conséquent, écoulement fluide/shear force sensibilité des canaux ioniques a été étudiée en utilisant la technique du patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, les résultats et l’interprétation des données peuvent être erronées. Ici, nous présentons des preuves expérimentales et théoriques en erreurs de flux de fluide et fournir des méthodes pour l’estimation et la prévention et la correction de ces erreurs. Changements de potentiel entre l’électrode de référence Ag/AgCl et bain liquide de jonction ont été mesurées avec une pipette ouverte remplie de 3M KCl. écoulement de fluide pourrait alors déplacement le mV potentielle d’environ 7 jonction liquide/métal. À l’inverse, en mesurant le décalage de tension induit par l’écoulement du fluide, nous avons estimé la concentration en ions dans la couche limite stationnaire. À l’état statique, les concentrations d’ions real adjacentes à l’Ag/AgCl référence électrode ion canal d’entrée à la surface de la membrane cellulaire peuvent atteindre le plus bas aussi environ 30 % de ce débit. Placer un gel d’agarose 3M pont de KCl entre l’électrode de référence et fluide de baignade peut avoir empêché ce problème de jonction potentielle changeant. Toutefois, l’effet de la couche stationnaire adjacente à la surface de la membrane cellulaire ne pourrait pas fixée de cette manière. Ici, nous fournissons une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire avec une pipette ouverte patch clamp, mettant l’accent sur l’importance d’utiliser un gel d’agarose sel-pont alors qu’il étudiait les fluide régulation induite par l’écoulement de courants ioniques. Par conséquent, cette approche novatrice, qui prenne en considération les véritables concentrations des ions dans la couche limite stationnaire, peut fournir des observations utiles sur le plan expérimental et interprétation des données liées à la réglementation de la contrainte de cisaillement fluide des canaux ioniques .

Germes entiers dépendants de la tension type L Ca2 + (VDCCL) courants des canaux ont été enregistrées dans les myocytes artériels mésentérique de rat enzymatiquement dispersés, comme décrit précédemment11. Les myocytes artériels ont été dialysées avec une solution de la pipette Cs-riches dans une configuration de nystatine perforé avec la solution de trempage d’exempt de cations divalents pour faciliter l’écoulement du cou...

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Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Canaux ioniques Mécanosensibles est souvent étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec enregistrement patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, l’issue sur le flux de fluides-règlements des canaux ioniques peut être erronée. Ici, nous fournissons des méthodes pour prévenir et corriger ces erreurs avec une base théorique.

Mesure de la Concentration en ions dans la couche limite stationnaire avec la Pipette ouverte Patch-Clamp : incidences sur le contrôle des canaux ioniques par Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Cette soumission peut aider à répondre à des questions clés dans la sphère électro-physiologique, comme le flux de fluide dans seulement les règlements des canaux iion. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut estimer la concentration réelle d’ion dans la couche limite non siffrée de la surface de la membrane pour l’interprétation des données liées à la régulation du débit fluide des canaux imitants. Pour commencer cette procédure, pliez le tube capillaire en verre feu pour former une forme en U.Le diamètre intérieur du capillaire doit être suffisamment grand pour réduire la résistance aux séries lors de l’enregistrement de grands courants ion. Ensuite, dissoudre trois grammes d’agarose en 100 millilitres de chlorure de potassium trois molaires, et le placer sur une plaque chaude entre 90 et 100 degrés Celsius. Ensuite, chargez le pont avec l’agarose de chlorure de potassium, en immergeant le pont de verre dans la solution.Conservez-le toute la nuit à température ambiante pour que l’agarose se mœure et durcisse. Le lendemain, creusez soigneusement le pont en verre chargé de chlorure de potassium agarose du sel d’agarose durci. Conserver le pont dans une bouteille à col large de chlorure de potassium trois molaire au réfrigérateur.Dans cette procédure, placez un récipient chargé de solution de bain, au-dessus de la chambre patch-clamp. Ensuite, remplissez la chambre patch-clamp avec la solution de bain en aspirant le tube. Pour arrêter le flux de liquide, couper le tube sur le côté du récipient, pour bloquer le flux de liquide.Puis couper le tube sur le côté aspiration pour arrêter l’aspiration en même temps. C’est l’état de contrôle stationnaire. Pour appliquer la force de cisaillement d’écoulement fluide, ouvrez les deux tubes sur le récipient et les côtés d’aspiration en même temps.Avant ou après l’application de la force de cisaillement du flux fluide sur la cellule, calculer le débit en millilitre par minute en mesurant la diminution du volume de liquide sur une période donnée. Pour mesurer les changements dans le potentiel de jonction liquide-métal, préparez une solution saline physiologique-salée normale pour la chambre de bain, et comparez-les en l’absence et la présence du pont de chlorure de potassium d’agar. Ensuite, placez une pipette de patch contenant la solution de chlorure de potassium de trois molaire dans la chambre, pour réduire au minimum le décalage potentiel de jonction entre la pipette et les solutions de bain.Réglez ensuite l’amplificateur de pince de tension au mode de pince actuel. Après avoir annulé le potentiel initial de compensation, mesurez les changements de tension induits par la variation des débits. Pour vérifier que les changements de tension sont des potentiels de jonction liquide-métal, réexaminez l’effet du flux de liquide sur le potentiel de jonction, en utilisant le pont de sel agarose entre la solution de bain et l’électrode de référence.Avec les résultats des changements dans le potentiel de jonction liquide-métal, dessiner les relations de taux de débit potentiel de la fonction, et estimer la valeur saturante du changement potentiel de jonction par le débit supra-fluide. Ensuite, modifiez la concentration de chlorure dans le liquide de bain et dessinez la relation de concentration potentielle de chlorure de jonction. Notez que le taux de liquide doit être constant, et suffisamment élevé pour empêcher la diminution de la concentration de chlorure à celle de l’électrode de référence au chlorure argenté-argent adjacente.À partir des deux courbes de relation, estimer les changements dans la concentration de chlorure par rapport au changement potentiel de jonction mesuré. Des courants de VDCC-L ont été enregistrés dans les myocytes artériaux mesenteric de rat enzymatically dispersés, avec l’enregistrement perforé de patch-clamp de nystatin. Avec le pont de chlorure de potassium agarose, le potentiel de jonction entre l’électrode de référence et les solutions de bain pourrait être réduit au minimum, et le flux de fluide a augmenté la tension du courant VDCC-L indépendamment.Toutefois, lorsque l’électrode de référence au chlorure argenté-argent a été directement reliée au liquide de bain, sans pont de chlorure de potassium agarose, la relation IV en présence de flux de liquide s’est déplacée vers la droite, par rapport à celle des courants VDCC-L dans un état statique. L’augmentation induite par le flux de liquide des courants kerr 2.1, qui ont été enregistrés dans les cellules leucémiques basophiles de rat avec le pont d’agarose, peut être expliquée par l’effet de couche non siffrée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans la sur-électrophysie.C’est donc pour la régulation du flux de fluide dans les courants du canal iion. En termes de phénomènes électrochimiques, dans la couche limite non siffrée à la surface de la membrane cellulaire.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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