Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מרכז מחקר חלוץ (2011-0027921), על ידי יסוד מדע תוכניות מחקר (2015R1C1A1A02036887 ו- NRF-2016R1A2B4014795) דרך נבחרת מחקר קרן של קוריאה במימון משרד המדע, תקשוב & תכנון העתיד, על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), אשר ממומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (HI15C1540).

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדי של אוניברסיטת Konkuk.
1. Agarose מלח גשרים בין פתרון אמבט Ag/AgCl הפניה אלקטרודה
הערה: Agarose 3 מ' אשלגן כלורי, מלח גשרים מיוצרים כאמור תיאר12 עם הבדלים קלים.
<ol><li>היווצרות גשרים<ol>
<li>כיפוף צינורות נימי זכוכית אש כדי ליצור ?...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+mechanically+activated+ion+channel,+is+required+for+vascular+development+in+mice.">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li><li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4-mediated+endothelial+Ca2++influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress.">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li><li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension.">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2++channel+via+enhancement+of+Ca2+-induced+Ca2++release+in+rat+ventricular+myocytes.">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K++current+by+convectively+restoring+[K+]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585 (2016).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena.">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2++channel+activation+in+vascular+myocytes.">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li><li>. A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

במחקר זה, הפגנו שיטה למדידת ריכוז Cl– אמיתי בשכבה unstirred הסמוך האלקטרודה הפניה Ag/AgCl על-ידי קביעת לצומת נוזלי-מטאל פוטנציאלי עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ מלא של אשלגן גבוהה ריכוז. משמרת של צומת פוטנציאל השינוי בריכוז Cl– בשכבת הגבול יכול לגרום כאשר מחליפים מ סטטי ותנאים של זרימת נוזל....

זרימת נוזל זה הסימן סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזל נוזל הטיה תלויי-כוח וסקולרית שיפוץ ופיתוח1,2, 3,4,5. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, הוא האמין כי תקנה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating עשוי לתרום באופן ביקורתי תגובות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל5 , 6 , 7 , 8. לדוגמה, הפעלת המתקן פנימה אנדותל Kir2.1 ו- Ca2 +-activated K+ (KCa2.3, KCNN3) ערוצי לאחר Ca2 + זרם על ידי זרימת נוזל כבר הציע לתרום נוזל זרימה-induced vasodilation6,7,8. לכן, רבים תעלות יונים, ערוצי במיוחד מופעל מכנית או - עכבות, נחקרו מבחינת זרימת נוזל/הטיה רגישות כוח עם9,10 6,טכניקה תיקון-קלאמפ , 11. עם זאת, בהתאם פרוטוקול נסיוני שבוצעה במהלך תיקון-קלאמפ הקלטה, תוצאות ופרשנות של הנתונים על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים10,11.
מקור אחד של חפצים הנוצרות על-ידי זרימת נוזל בהקלטה תיקון-קלאמפ היא מצומת פוטנציאלי בין נוזל אמבטיה Ag/AgCl הפניה אלקטרודה11. בדרך כלל הוא האמין כי הצומת נוזלי/מטאל פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl אלקטרודה היא קבועה כמו ריכוז Cl– של נוזל רחצה נשמרת יציבה, שוקל את התגובה הכימית בין הפתרון רחצה Ag/AgCl אלקטרודה להיות:
Ag + Cl–↔ AgCl + אלקטרון (e–) (משוואה 1)
עם זאת, במקרה שבו התגובה הכוללת אלקטרוכימי בין פתרון רחצה אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (משוואה 1) ממשיך משמאל לימין, ריכוז Cl– של נוזל רחצה צמוד Ag/AgCl הפניה אלקטרודה (שכבת גבול unstirred12,13,14,15) עשוי להיות נמוך בהרבה מאשר בעיקר רחצה פתרון, אלא אם כן מספיק תחבורה convectional מובטחת. באמצעות אלקטרודה Ag/AgCl ישנים או לא אידאליות הכלרה לקוי של Ag עשוי להגביר סיכון כזה. החפץ הקשורות זרימת נוזל על האלקטרודה הפניה, למעשה, יכול להיות מהכלל על-ידי פשוט הנחת גשר מלח agarose המקובלת בין נוזל רחצה לבין התייחסות אלקטרודה, מאז החפץ מבוסס על שינויים אמיתיים Cl– ריכוז הסמוך ה Ag/AgCl אלקטרודה11. פרוטוקול שהוצגו במחקר זה מתאר כיצד למנוע את השינויים אפשריות הקשורות זרימת צומת ולמדוד את ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred.
לאחר הנחת agarose של אשלגן כלורי גשר בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, יש גורם מכריע נוסף שיש לשקול: Ag/AgCl אלקטרודה רק כהפניה מתנהג כמו אלקטרודה Cl– , תעלות היונים גם יכול לתפקד כמו אלקטרודה יון סלקטיבי. המצב של שכבת הגבול unstirred בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה מתעוררת במהלך תנועת יונים בין הפתרונות חוץ-תאית, תאיים דרך תעלות היונים ממברנה. זה מרמז כי יש להשתמש בזהירות כאשר לפרש ברגולציה של יון ערוצי על ידי זרימת נוזלים. כפי שפורט המחקר הקודם שלנו11, התנועה של יונים דרך פתרון שבו הדרגתי אלקטרוכימי קיים יכול להתרחש באמצעות שלושה ייחודי מנגנונים: דיפוזיה, הגירה, הסעת חום, איפה דיפוזיה התנועה המושרה על ידי ריכוז הדרגתי, ההעברה היא התנועה מונע על ידי מעבר חשמל צבע, הסעת חום הוא התנועה באמצעות זרימת נוזל. בין המנגנונים האלה תעבורה שלוש, הסעת חום מצב תורם לרוב את תנועת יונים11 (> 1,000 פעמים גדול יותר מאשר דיפוזיה או ההעברה תחת הגדרות תיקון הרגיל-קלאמפ). זה מהווה את הבסיס התיאורטי של הסיבה צומת פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה יכול מאוד תחת תנאים שונים סטטי ו זרימת נוזל11.
לפי ההשערה המוצעת לעיל, כמה תופעות facilitatory של זרימת נוזלים בערוץ יון הנוכחי ניתן להסיק מן המחודשת הכנת ריכוז יון האמיתי סמוך לים ערוץ על פני הממברנה (שכבת גבול unstirred) 10. במקרה זה, ההשפעות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל על יון ערוץ זרמי פשוט שהתעוררו מאירועים אלקטרוכימי, לא מן התקנון של gating ערוץ יון. רעיון דומה הוצע בעבר על ידי בארי ועמיתיו12,13,14,15 בהתבסס על השיקולים התיאורטיים קפדני ועל ראיות, הידוע גם בשם השכבה unstirred או אפקט מספר תחבורה. אם כמה תעלות יונים יש מספיק מוליכות ערוץ אחד, מספיק זמן פתיחה-זמן לספק תחבורה מספקת שיעורי דרך הערוצים (מהירה יותר תחבורה תעריף של ממברנה מאשר על גבי המשטח ממברנה unstirred), אפקט בשכבת הגבול שעשויות להתעורר . לפיכך, התעבורה תלויי-הסעת חום יכול לתרום facilitations נוזל-זרימה-induced בסופו של דבר של יון הנוכחי10,12,13,14,15.
במחקר זה, אנו שמים דגש על חשיבות באמצעות אגר או agarose מלח-גשר תוך כדי לימוד נוזל-זרימה-induced רגולציה של זרמי יונים. כמו כן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred הסמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, הממברנה תעלות היונים. יתר על כן, הפרשנות תיאורטי של אפנון הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים ערוץ יון (קרי, הסעת חום השערה או שכבה unstirred התחבורה מספר אפקט) יכולה לספק תובנות בעלות ערך עבור עיצוב ופרשנות מחקרים על הטיה הכוח-ברגולציה של תעלות יונים. על פי האפקט תעבורה בשכבת הגבול unstirred מספר, אנו צופים כי יון זרמי ערוץ דרך כל סוגי הממברנה תעלות יונים ניתן להקל על ידי זרימת נוזלים, באופן עצמאי את רגישותם ביולוגי לכוח הטיה זרימת נוזלים, אבל רק אם תעלות היונים יש מוליכות ערוץ אחד מספיק פתוח-זמן רב. צפיפויות הנוכחי של ערוץ יון גבוה יותר עשוי להגביר את האפקט unstirred בשכבת הגבול על פני קרום התא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

זרימת נוזלים היא גירוי סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזלים. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל/הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, רגולציה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating יכול לתרום באופן ביקורתי. לכן, זרימת נוזל/הטיה הרגישות בכוח של תעלות יונים נחקרה בטכניקה תיקון-קלאמפ. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, תוצאות ופרשנות של נתונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מציגים ראיות ניסיוני ותיאורטי עבור שגיאות הקשורות זרימת נוזל מספקים שיטות להערכת, מניעת של תיקון שגיאות אלה. שינויים בצומת פוטנציאלי בין אלקטרודה הפניה Ag/AgCl נוזל רחצה נמדדו עם פיפטה פתוח מלא עם 3 מ' אשלגן כלורי. זרימת נוזלים יכול ואז shift mV פוטנציאליים כדי כ 7 את צומת נוזלי/מתכת. לעומת זאת, על ידי מדידת משמרת מתח הנגרמת על ידי זרימת נוזלים, אנחנו מעריכים את ריכוז יון בשכבת הגבול unstirred. במצב סטטי, ריכוז יון האמיתי סמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה או יון הערוץ לים על פני קרום התא יכול להגיע נמוך כמו כ- 30% זה מצב זרימה. הנחת agarose של 3 מ' אשלגן כלורי גשר בין האלקטרודה נוזל והפניה רחצה עשוי למנוע את הבעיה של צומת פוטנציאלי הסטה. עם זאת, האפקט שכבה unstirred סמוך פני קרום התא לא היתה אפשרות לתקן בדרך זו. כאן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred עם פיפטה תיקון פתוח-קלאמפ, המדגיש את החשיבות של שימוש agarose של מלח-גשר תוך כדי לימוד תקנה הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים יון. לכן, גישה חדשנית זו, אשר לוקח בחשבון את ריכוזי יונים בשכבת הגבול unstirred אמיתי, עשוי לספק תובנה שימושי על עיצוב ניסיוני ועל פרשנות הנתונים הקשורים ויסות נוזלים גזירה של תעלות יונים .

התא כולו תלויי-מתח Ca L-סוג2 + ערוץ (VDCCL) זרמי נרשמו ב עכברוש enzymatically התפזרו מצע המעי העליון עורקי נייטרלים, כפי שתואר לעיל11. השריר עורקי היו דיאליזה עם פתרון פיפטה Cs-עשיר תחת תצורת ניסטטין מחורר עם פתרון רחצה ללא הקטיון כלט כדי להקל על הזרם הנוכחי דרך V...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

תעלות יונים Mechanosensitive נלמדים לעתים קרובות במונחים של זרימת נוזלים/הטיה רגישות כוח עם תיקון-קלאמפ הקלטה. עם זאת, בהתאם לפרוטוקול ניסיוני, התוצאה על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים. כאן, אנו מספקים שיטות מניעת ותיקון שגיאות כאלה עם בסיס תיאורטי.

מדידת ריכוז יון בשכבת הגבול Unstirred עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה: השלכות בשליטה של תעלות יונים על ידי נוזל לזרום

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

הגשה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האלקטרו-פיזיולוגי, כגון זרימת הנוזלים רק בתקנות תעלות היונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה להעריך את ריכוז היונים בפועל בשכבת הגבול הלא מרושתת של משטח הממברנה לפרשנות נתונים הקשורה לוויסות זרימת הנוזלים של תעלות היון. כדי להתחיל בהליך זה, לכופף את צינור נימי זכוכית ירה כדי ליצור צורת U.הקוטר הפנימי של נימי צריך להיות גדול מספיק להפחתת התנגדות הסדרה בעת הקלטת זרמי יון גדולים. לאחר מכן, להמיס שלושה גרם של אגרוז ב 100 מיליליטר של אשלגן כלורי שלושה טוחנות, ולהנח אותו על צלחת חמה בין 90 ל 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לטעון את הגשר עם אשלגן כלורי agarose, על ידי טבילת גשר הזכוכית בתמיסה.שמור את זה לילה בטמפרטורת החדר עבור agarose להגדיר ולהקשיח. למחרת, חפרו בזהירות את גשר הזכוכית הטעון באשלגן כלורי ממלח אגרוז מוקשח. אחסן את הגשר בבקבוק רחב צוואר של אשלגן כלורי בעל שלושה טוחנות במקרר.בהליך זה, מניחים מיכל טעון בתמיסת רחצה, מעל תא המהדק טלאי. לאחר מכן, מלאו את תא הטלאי בתסכת הרחצה על ידי יניקת הצינור. כדי לעצור את זרימת הנוזלים, גזור את הצינור בצד המיכל, כדי לחסום את זרימת הנוזלים.ואז קליפ הצינור בצד היניקה כדי לעצור את היניקה באותו זמן. זה מצב הבקרה נייח. כדי להחיל כוח הגזיר זרימת נוזלים, לפתוח את שני הצינורות על המיכל ואת צדי היניקה באותו זמן.לפני או אחרי החלת כוח הגזיר של זרימת הנוזלים על התא, חשב את קצב הזרימה במיליליטר לדקה על ידי מדידת הירידה בנפח הנוזלים לאורך זמן נתון. כדי למדוד שינויים בפוטנציאל צומת מתכת נוזלית, להכין מלוחים פיזיולוגיים-מלח נורמלי עבור תא הרחצה, ולהשוות אותם בהיעדר נוכחות של גשר אגר אשלגן כלורי. לאחר מכן, מניחים פיפטה טלאי המכילה פתרון אשלגן כלורי שלושה טוחנות בתא, כדי למזער את המעבר הפוטנציאלי צומת בין פיפטה פתרונות רחצה.לאחר מכן הגדר את מגבר מלחצי המתח למצב המהדק הנוכחי. לאחר ביטול פוטנציאל ההיסט הראשוני, למדוד את השינויים במתח הנגרמים על ידי שינוי שיעורי הזרימה. כדי לוודא שהשינויים במתח הם פוטנציאל צומת מתכת נוזלית, בחן מחדש את השפעת זרימת הנוזלים על פוטנציאל הצומת, תוך שימוש בגשר המלח אגרוז בין ת פתרון האמבטיה לאלקטרודה הייחוס.עם תוצאות השינויים בפוטנציאל צומת מתכת נוזלית, לצייר את יחסי קצב זרימה פוטנציאליים פונקציה, ולהעריך את הערך הרווי של שינוי פוטנציאלי צומת על ידי קצב זרימה נוזלים supra. לאחר מכן, לשנות את ריכוז הכלוריד בנוזל הרחצה, ולצייר את הקשר ריכוז כלוריד פוטנציאלי צומת. שים לב כי קצב הנוזלים צריך להיות קבוע, וגוה מספיק כדי למנוע את הירידה של ריכוז כלוריד לזה של אלקטרודה התייחסות כלוריד כסף כסף סמוך.משתי עקומות היחסים, להעריך את השינויים בריכוז כלוריד מן השינוי הפוטנציאלי צומת נמדד. זרמי VDCC-L נרשמו במוציטים העורקים המזנטיים המפוזרים באנזימטיות של חולדות, עם הקלטת מהדק טלאי מחוררת nystatin. עם גשר אשלגן כלורי, ניתן למזער את פוטנציאל הצומת בין אלקטרודה הייחוס לפתרונות הרחצה, וזרימת הנוזלים הגדילה את המתח של זרם VDCC-L באופן עצמאי.עם זאת, כאשר האלקטרודה התייחסות כלוריד כסף כסף היה מחובר ישירות לנוזל הרחצה, ללא גשר אשלגן כלורי אגרוז, הקשר IV בנוכחות זרימת נוזלים עבר ימינה, לעומת זה של זרמי VDCC-L במצב סטטי. הגידול הנגרמת על ידי זרימת נוזלים של זרמי קר 2.1, אשר נרשמו בתאי לוקמיה בסופילית עכברוש עם גשר אגרוז, ניתן להסביר על ידי אפקט השכבה unstirred. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים באלקטרו-פיזיולוגיה.אז זה לוויסות זרימת הנוזלים בזרימה של ערוץ היונים. במונחים של תופעות אלקטרו-כימיות, בשכבת הגבול הלא מרוסן על פני קרום התא.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

הכנת מוצר מוצרי הדגים התוססים באיכות גבוהה

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...