Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Questa ricerca è stata sostenuta dal programma Pioneer Research Center (2011-0027921), di base scienza ricerca programmi (2015R1C1A1A02036887 e 2016R1A2B4014795 NRF) attraverso la National Foundation ricerca di Corea finanziato dal Ministero della scienza, ICT & Pianificazione del futuro e da una sovvenzione del Corea Health Technology R & D Project attraverso Corea salute industria Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (HI15C1540).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Konkuk University.
1. agarosio sale ponti tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl
Nota: Agarosio 3M KCl sale ponti sono prodotte come precedentemente descritto12 con variazioni minori.
<ol><li>Formazione di ponti<ol>
<li>Piegare i tubi capillari di vetro fuoco per formare una forma a U come appropriato. Il diametro interno...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. 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A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare la concentrazione reale di Cl– nello strato unstirred adiacente l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl determinando la giunzione metallo liquido potenziale con una pipetta di patch-clamp aperto riempita con un alta KCl concentrazione. Il cambiamento nella concentrazione di Cl– nello strato limite può causare uno spostamento del potenziale di giunzione quando si passa da statico a condizioni di flusso fluido. Semplicemente utilizzando un'ag...

Flusso del fluido è un importante segnale ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici come la vasodilatazione indotta da flusso fluida e fluido shear forza-dipendente vascolare rimodellamento e sviluppo1,2, 3,4,5. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di taglio di flusso del fluido completamente non sono capiti, si ritiene che fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating criticamente può contribuire alle risposte indotta da flusso fluido5 , 6 , 7 , 8. ad esempio, l'attivazione del raddrizzatore inward endoteliale Kir 2.1 e Ca2 +-attivato K+ (KCa2.3, KCNN3) canali dopo l'afflusso di Ca2 + di flusso del fluido è stata suggerita per contribuire al fluido vasodilatazione indotta da flusso6,7,8. Di conseguenza, molti canali ionici, soprattutto meccanicamente attivato o - inibiti canali, sono stati studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con il patch-clamp tecnica6,9,10 , 11. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale eseguito durante la registrazione di patch-clamp, risultati e interpretazione dei dati sul flusso fluidi-regolamenti delle scanalature dello ione può essere erronea10,11.
Dallo svincolo di potenziale tra il liquido del bagno e riferimento Ag/AgCl elettrodi11è una fonte di fluidi indotta da flusso artefatti nella registrazione di patch-clamp. Si ritiene generalmente che la giunzione di liquido/metallo potenziale tra il fluido di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl è costante come la concentrazione di Cl– del fluido balneazione viene mantenuta costante, considerando la risposta chimica tra la soluzione di balneazione ed elettrodo Ag/AgCl per essere:
AG + Cl–↔ AgCl + elettrone (e–) (equazione 1)
Tuttavia, in un caso dove la reazione elettrochimica nel complesso tra la soluzione di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl (equazione 1) procede da sinistra a destra, la concentrazione di Cl– del fluido balneare adiacente di Ag/AgCl fare riferimento elettrodo (strato limite unstirred12,13,14,15) può essere molto inferiore a quello nella maggior parte dei balneari soluzione, a meno che non sufficiente convezione trasporto è assicurato. Utilizzando un elettrodo Ag/AgCl vecchio o non ideale con insufficiente clorazione di Ag può aumentare tale rischio. Questo artefatto correlate a flusso fluido presso l'elettrodo di riferimento, infatti, possa essere esclusi semplicemente posizionando un ponte convenzionale dell'agarosi-sale tra il fluido di balneazione e riferimento dell'elettrodo, dal momento che il manufatto si basa sulle alterazioni nella real Cl– concentrazione adiacente l' elettrodo Ag/AgCl11. Il protocollo presentato in questo studio viene descritto come impedire i cambiamenti di potenziale di giunzione correlate a flusso e misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred.
Dopo aver posizionato un'agarosi ponte di KCl tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl, c'è un altro fattore cruciale da considerare: proprio come il riferimento Ag/AgCl elettrodi agisce come un elettrodo Cl– , scanalature dello ione possono funzionare anche come un elettrodo iono-selettivi. La situazione di uno strato di contorno unstirred tra il fluido di balneazione e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl si verifica durante il movimento di ioni tra le soluzioni extracellulare e intracellulare attraverso i canali ionici di membrana. Ciò implica che l'attenzione dovrebbe essere usato quando interpretare il regolamento dello ione di canali di flusso del fluido. Come discusso nel nostro precedente studio11, il movimento di ioni attraverso una soluzione in cui è presente un gradiente elettrochimico può verificarsi tramite tre meccanismi distinti: convezione, dove la diffusione è il movimento, la migrazione e diffusione indotta da gradiente di concentrazione, migrazione è il movimento guidato dal gradiente elettrico, e la convezione è il movimento attraverso il flusso di fluido. Tra questi meccanismi di tre trasporto, modalità convezione contribuisce la maggior parte al movimento di ioni11 (> 1.000 volte maggiore diffusione o migrazione sotto impostazioni solite patch-clamp). Questo costituisce la base teorica del perché giunzione potenziali tra la balneazione fluido e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl può molto sotto diverse condizioni statiche e flusso fluido11.
Secondo l'ipotesi proposta sopra, alcuni effetti facilitatory del flusso del liquido sul canale dello ione corrente possono essere dedotta dal restauro convettivo di concentrazioni di ioni reale adiacente all'ingresso del canale sulla superficie di membrana (strato di contorno unstirred) 10. In questo caso, gli effetti indotta da flusso fluidi sulle correnti di canale ionico sono semplicemente sorti da eventi elettrochimici, non dal regolamento di ioni canale gating. Un'idea simile è stata suggerita in precedenza da Barry e colleghi12,13,14,15 basato su considerazioni teoriche rigorose e la prova sperimentale, anche conosciuto come lo strato unstirred o trasporto numero effetto. Se alcuni canali ionici hanno sufficiente conduttanza del singolo canale e abbastanza a lungo tempo aperto per fornire sufficiente trasporto velocità attraverso i canali (un più veloce tasso di trasporto nella membrana che in superficie della membrana unstirred), un effetto di strato di contorno possono sorgere . Quindi, il trasporto di convezione-dipendente può contribuire alle eventuali agevolazioni indotta da fluido-flusso di ioni corrente10,12,13,14,15.
In questo studio, sottolineiamo l'importanza di utilizzare un agar o agarosio sale-ponte mentre studiava regolamento indotta da fluido-flusso di correnti di ioni. Forniamo anche un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred adiacente per i canali di ioni Ag/AgCl elettrodi e membrana di riferimento. Inoltre, l'interpretazione teorica di fluido modulazione indotta da flusso di correnti di canale ionico (vale a dire, ipotesi di convezione o effetto numero di unstirred livello trasporto) possa fornire informazioni preziose per la progettazione e interpretare gli studi su il taglio forza-regolamento dei canali ionici. Secondo l'effetto numero di trasporto unstirred strato di contorno, prevediamo che le correnti del canale ionico attraverso tutti i tipi di canali ionici di membrana possono essere facilitate dal flusso del fluido, indipendente della loro sensibilità biologica a forza di taglio di flusso del fluido, ma solo se i canali ionici sono sufficienti monocanale conduttanza e lungo tempo aperto. Maggiore densità di corrente del canale di ioni può aumentare l'effetto di unstirred strato limite sulla superficie della membrana cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

Flusso del fluido è un importante stimolo ambientale che controlla molti processi fisiologici e patologici, quali vasodilatazione indotta da flusso fluido. Sebbene i meccanismi molecolari per le risposte biologiche a forza di flusso fluido/taglio completamente non sono capiti, fluido regolazione mediata da flusso di ioni canale gating può contribuire criticamente. Di conseguenza, sensibilità di forza di flusso fluido/taglio dei canali ionici è stato studiato utilizzando la tecnica del patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, i risultati e l'interpretazione dei dati può essere errate. Qui, presentiamo la prova sperimentale e teorica per errori relativi al flusso di fluido e fornisce metodi per la stima, la prevenzione e la correzione di questi errori. Cambiamenti nella giunzione potenziale tra l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl e fluido di balneazione sono stati misurati con una pipetta aperta riempita con 3M KCl. flusso del fluido potrebbe quindi spostano la giunzione liquido/metallo potenziali per circa 7 mV. Al contrario, misurando lo spostamento di tensione indotto dal flusso del fluido, abbiamo stimato la concentrazione di ioni nello strato limite unstirred. In condizioni statiche, le concentrazioni di ione reale adiacente all'ingresso di canale Ag/AgCl riferimento elettrodo o ione alla superficie della membrana cellulare possono raggiungere come basso come approssimativamente il 30% di quello nella condizione di flusso. Ponendo un'agarosi 3M ponte di KCl tra l'elettrodo di riferimento e del liquido di balneazione può impedire questo problema di spostamento potenziale di giunzione. Tuttavia, l'effetto di unstirred strato adiacente alla superficie della membrana cellulare non poteva essere risolto in questo modo. Qui, forniamo un metodo per misurare le concentrazioni di ione reale nello strato limite unstirred con una pipetta aperta patch-clamp, sottolineando l'importanza dell'utilizzo di un sale di agarosio-ponte mentre studiava fluido regolamento indotta da flusso di correnti di ioni. Pertanto, questo nuovo approccio, che prende in considerazione le reali concentrazioni di ioni nello strato limite unstirred, può fornire la comprensione utile il disegno sperimentale ed interpretazione di dati legate alla sollecitazione di taglio fluido regolazione dei canali ionici .

A cellula intera tensione-dipendente tipo L Ca2 + canale (VDCCL) correnti sono state registrate in miociti arteriosa mesenterica enzimaticamente dispersi ratto, come descritto in precedenza11. I miociti arteriosi sono stati dializzati con una soluzione di pipetta Cs-ricco sotto la configurazione nistatina-perforato con soluzione di balneazione privo di cationi bivalenti per facilitare il flusso di corrente attraverso VDCCL<sup class...

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Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Canali ionici mechanosensitive sono spesso studiati in termini di flusso fluido/taglio forza sensibilità con registrazione di patch-clamp. Tuttavia, a seconda del protocollo sperimentale, l'esito il fluidi flusso-regolamenti dei canali ionici possa essere errata. Qui, forniamo metodi per prevenire e correggere tali errori con una base teorica.

Misurazione della concentrazione di ioni nello strato limite Unstirred con pipetta aperta Patch-Clamp: implicazioni nel controllo dei canali ionici dal liquido di flusso

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Questa submittal può aiutare a rispondere a domande chiave nella sfera elettrofisiologia, come il flusso di fluido solo nelle normative dei canali ionici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può stimare l'effettiva concentrazione di ioni nello strato limite non stimato della superficie della membrana per l'interpretazione dei dati relativi alla regolazione del flusso fluido dei canali ionici. Per iniziare questa procedura, piegare il tubo capillare in vetro sparato per formare una forma a U.Il diametro interno del capillare dovrebbe essere abbastanza grande da ridurre la resistenza in serie durante la registrazione di grandi correnti ioniche. Successivamente, sciogliere tre grammi di agarosio in 100 millilitri di cloruro di potassio trimolare e posizionarlo su una piastra calda tra 90 e 100 gradi Celsius. Quindi, caricare il ponte con il cloruro di potassio agarosio, immergendo il ponte di vetro nella soluzione.Tenerlo durante la notte a temperatura ambiente affinché l'agarosio si insopporti e si indurisca. Il giorno dopo, scavare con cura il ponte di vetro carico di cloruro di potassio di agarosio dal sale di agarosio indurito. Conservare il ponte in una bottiglia a collo largo di cloruro di potassio a tre molari in frigorifero.In questa procedura, posizionare un contenitore caricato con soluzione di balneazione, sopra la camera patch-clamp. Quindi, riempire la camera patch-clamp con la soluzione di balneazione aspirazione del tubo. Per interrompere il flusso del fluido, ritagliare il tubo sul lato del contenitore, per bloccare il flusso del fluido.Quindi agganciare il tubo sul lato di aspirazione per interrompere l'aspirazione allo stesso tempo. Questa è la condizione di controllo stazionario. Per applicare la forza di taglio del flusso del fluido, aprire entrambi i tubi sul contenitore e sui lati di aspirazione contemporaneamente.Prima o dopo aver applicato la forza di taglio del flusso del fluido alla cella, calcolare la portata in millilitro al minuto misurando la diminuzione del volume del fluido in un dato tempo. Per misurare le variazioni del potenziale di giunzione liquido-metallo, preparare una normale salina fisiologico-salina per la camera di balneazione e confrontarle in assenza e presenza di ponte di cloruro di potassio agar. Quindi, posizionare una pipetta patch contenente soluzione di cloruro di potassio trimolare nella camera, per ridurre al minimo il potenziale spostamento di giunzione tra la pipetta e le soluzioni di balneazione.Quindi impostare l'amplificatore del morsetto di tensione sulla modalità di bloccaggio della corrente. Dopo aver annullato il potenziale di offset iniziale, misurare le variazioni di tensione indotte variando le portate. Per verificare che le variazioni di tensione siano potenziali di giunzione liquido-metallo, riesaminare l'effetto del flusso del fluido sul potenziale di giunzione, utilizzando il ponte di sale di agarosio tra la soluzione del bagno e l'elettrodo di riferimento.Con i risultati delle variazioni del potenziale di giunzione liquido-metallo, disegnare le relazioni di portata potenziale della funzione e stimare il valore saturante dello spostamento del potenziale di giunzione per la portata sopra-fluido. Quindi, modificare la concentrazione di cloruro nel fluido di balneazione e disegnare la relazione di concentrazione potenziale di cloruro di giunzione. Si noti che la velocità del fluido deve essere costante e sufficientemente elevata da impedire la diminuzione della concentrazione di cloruro a quella dell'elettrodo di riferimento adiacente al cloruro argento-argento.Dalle due curve di relazione, stimare le variazioni della concentrazione di cloruro rispetto allo spostamento potenziale di giunzione misurato. Le correnti VDCC-L sono state registrate nei miociti arteriosi mesenterici del ratto dispersi enzimaticamente, con registrazione del patch-clamp perforato alla nystatina. Con il ponte di cloruro di potassio di agarosio, il potenziale di giunzione tra l'elettrodo di riferimento e le soluzioni di balneazione potrebbe essere ridotto al minimo e il flusso del fluido ha aumentato la tensione della corrente VDCC-L in modo indipendente.Tuttavia, quando l'elettrodo di riferimento del cloruro argento-argento era direttamente collegato al fluido da bagno, senza un ponte di cloruro di potassio di agarosio, la relazione IV in presenza di flusso di fluido si è spostata a destra, rispetto a quella delle correnti VDCC-L in condizioni statiche. L'aumento indotto dal flusso di fluido delle correnti di Kerr 2.1, che sono state registrate nelle cellule di leucemia basofila del ratto con il ponte di agarosio, può essere spiegato dall'effetto strato non stimato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nell'elettrofisiologia superiore.Quindi è per la regolazione del flusso di fluido nelle correnti del canale ioniche. In termini di fenomeni elettrochimica, nello strato limite non stimato sulla superficie della membrana cellulare.

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