Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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この研究は、研究財団韓国国立科学省 ICT によって資金を供給を通じて基本的な科学研究プログラム (2015R1C1A1A02036887、NRF 2016R1A2B4014795) パイオニア研究センター プログラム (2011 0027921)、によって支えられて・将来計画、韓国健康技術 R & D プロジェクト韓国健康産業開発研究所 (KHIDI) からの助成金によって韓国共和国 (HI15C1540) 福祉厚生省によって資金を供給し、。

建国大学制度のガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. Agarose 塩橋バス ソリューションと銀/塩化銀参照電極との間
注: Agarose 3 M KCl 塩橋が以前に生成される説明12マイナーなバリエーションを持つ。
<ol><li>橋の形成<ol>
<li>適切な U 字型を形成する火ガラス毛管管を曲げます。毛細血管の内径は、大型イオン電流を記録する?...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+mechanically+activated+ion+channel,+is+required+for+vascular+development+in+mice.">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li><li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4-mediated+endothelial+Ca2++influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress.">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li><li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension.">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2++channel+via+enhancement+of+Ca2+-induced+Ca2++release+in+rat+ventricular+myocytes.">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K++current+by+convectively+restoring+[K+]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585 (2016).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena.">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2++channel+activation+in+vascular+myocytes.">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li><li>. A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

本研究で行った高 KCl でいっぱいオープン パッチ ・ クランプ ピペットと液体金属の接合部の電位を決定することにより銀/塩化銀参照電極に隣接する非撹拌層で実際の Cl-濃度を測定する方法濃度。静的から流体条件に切り替えるとき、境界層における Cl-濃度の変化は接合部電位のシフトにつながります。単に参照電極と入浴液の KCl の架け橋、agarose を使用してはパッチ ・ ...

液体の流れが流体の流れによる血管拡張や流体せん断力依存血管リモデリングと開発1,2など多くの生理学的および病理学的プロセスを制御する重要な環境のキュー 3,4,5。流体せん断力に対する生体の応答の分子メカニズムは完全に理解されていないが、イオン チャネルの開閉の流体の流れを介した制御流体流れによる応答5に批判的に貢献するかもしれないといわれています。,6,7,8しますたとえば、内皮の内側整流器 Kir2.1 と Ca2 +の活性化-活性化 K+ (KCa2.3、KCNN3) チャンネルは流体に貢献する流動による Ca2 +流入が示唆されている後。血管拡張の流動誘起6,7,8。したがって、多くのイオン チャネル、特に機械的に活性化または抑制のチャンネルは、パッチ ・ クランプの技術6,9,10と流体の流れ/せん断力感度の面で研究されています。,11します。 ただし、パッチ ・ クランプ記録中に行った実験的プロトコルによって成果とイオン チャネルの流体フロー規制に関するデータの解釈、誤った10,11。
パッチ ・ クランプ記録における流体流動誘起成果物の 1 つのソースは、浴液と銀/塩化銀参照電極11と潜在的な接合からです。液体/金属接合部入浴液と銀/塩化銀電極の電位は一定である入浴液の Cl-濃度が一定として入浴ソリューション間の化学反応を考慮したを一般的に考えられています。する銀/塩化銀電極:
Ag + Cl-↔ AgCl + 電子 (e-) (式 1)
ただし、入浴ソリューションと銀/塩化銀参照電極 (式 1) の全体的な電気化学的反応が左から右に進行する場合、銀/塩化銀に隣接する入浴液の Cl-濃度を参照します。電極 (非撹拌境界層12,13,14,15) は、十分な対流輸送を確保しない限り、ソリューションを入浴の大部分よりもはるかに低い可能性があります。Ag の不十分な塩素処理と古いまたは非理想的な銀/塩化銀電極を用いるそのようなリスクを高める可能性があります。参照電極、実際には、この流体フロー関連のアーティファクトは、入浴液と参照間の従来の agarose 塩橋を単に置くことによって除くことができる電極、アーティファクトが実際 Cl-の変化に基づいているので濃度は銀/塩化銀電極11に隣接します。本研究で提示されたプロトコルでは、ジャンクションのフロー関連の潜在的な変更を防ぐため、非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法について説明します。
入浴液と銀/塩化銀参照電極の KCl の架け橋、アガロースを配置した後に考慮すべきもう一つの重要な要因がある: Cl-電極のようにちょうど参照として銀/塩化銀電極機能、イオン チャネルにも機能することができますようイオン選択的な電極。入浴液と銀/塩化銀参照電極との間の非撹拌の境界層の状況は、膜イオン チャネルを介して細胞外および細胞内のソリューションのイオンの動きの間に発生します。これは、流体の流れによってチャンネルはイオンの規制を解釈するときに注意を使用することを意味します。電気化学的勾配が存在する溶液中のイオンの動きによって3 つの異なるメカニズムが発生する可能性が私たちの以前の研究11で説明するよう: 拡散、移行、および対流、拡散の動きです濃度勾配による、移行が電気的勾配によって駆動される動きと対流は流体での動き。これらの 3 つのトランスポート メカニズムの中では、対流モードは、イオン11 (> 1,000 回以上拡散または通常のパッチ ・ クランプの設定の下で移行) の動きにほとんどを貢献しています。これはなぜ入浴液と銀/塩化銀参照電極間電位は非常に異なる静的および流体条件11の下ですることができますの理論の基礎を形作る。
上記仮説に従ってイオン チャネル電流の流れのいくつかの手掛かり効果は実質イオン濃度膜表面 (非撹拌境界層) でチャネルの入口に隣接する対流の復元から推論する可能性があります10です。 この場合、イオン チャネル電流の流体流動誘起効果は単にイオン チャネルの開閉の制御からの電気化学的イベントから生じています。同様のアイデアは以前バリーと同僚12,13,14,15に基づいて厳密な理論的考察と実験的証拠、非撹拌層として知られているが示唆されたか数の影響を運ぶ。単一チャネルのコンダクタンスと十分な輸送料金 (非撹拌膜表面でよりも膜の高速輸送率)、チャネルを通じて境界層効果を提供するために十分な長さのオープン時間が生じることがありますいくつかのイオン チャネルがある十分な場合.対流に依存したトランスポートはイオン現在10,12,13,14,15の最終的な流体流動誘起昔話に貢献することができます。
本研究で我々 は寒天やアガロースを使用しての重要性を強調するイオン電流の流体流動誘起規制を勉強しながら塩橋。我々 はまた銀/塩化銀参照電極と膜イオン チャネルに隣接する非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法を提供します。さらに、イオン チャネル電流 (すなわち、対流仮説または非撹拌層トランスポート数の影響) の流体流動誘起変調の理論的解釈は、設計との研究の解釈のための貴重な洞察力を提供できます。イオン チャネルのせん断の力規制。非撹拌境界層トランスポート数効果によると場合膜イオン チャネルのすべての種類を介してイオン チャネル電流が流体、流体せん断力にだけ、彼らの生物学的感性の独立によって促進されることができることを予測します。イオン チャネルがある十分な単一チャネルのコンダクタンスと長いオープン タイム。高いイオン チャネル電流密度は、細胞膜表面の境界層の非撹拌効果を高める可能性があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

流体の流れは、流体の流れによる血管拡張など、多くの生理学的および病理学的プロセスを制御する重要な環境刺激です。流体の流れ/せん断力に対する生体の応答の分子メカニズムは完全に理解されていないがイオン チャネルのゲートの流体フロー パミン批判的に貢献するかもしれない。したがって、せん断流力感受性イオン チャネルのパッチ ・ クランプの技術を使用して研究されています。しかし、実験的プロトコルによって結果とデータの解釈することができます誤った。ここで、流体の流れに関連するエラーの実験的・理論的な証拠は提示、見積もり、防止、およびこれらのエラーを修正するためのメソッドを提供します。銀/塩化銀参照電極と入浴液間電位の変化は 3 M KCl。 流れがいっぱい開いているピペットを用いて測定したし、液体/金属接合の約 7 に潜在的な mV をシフトします。逆に、流体の流れによる電圧変化を測定することにより非撹拌の境界層内のイオン濃度を推定しました。静的な状態で細胞膜表面での銀/塩化銀参照電極またはイオン ・ チャネル入口に隣接して実際のイオン濃度は低流動状態での約 30% を達することができます。3 M、アガロースを配置する入浴液と参照電極間の KCl ブリッジ防げた可能性がありますこのジャンクションの潜在的なシフトの問題。ただし、細胞膜表面に隣接する非撹拌レイヤー効果は、この方法で固定ないできませんでした。ここでは、イオン電流の流体流動誘起制御を勉強しながら agarose の塩橋を使用しての重要性を強調してオープン パッチ ・ クランプ ピペットと非撹拌の境界層における実際のイオン濃度を測定する方法を提供します。したがって、非撹拌の境界層中のイオンの実際の濃度を考慮すると、この新規のアプローチ可能性があります実験デザインとデータ解釈イオン チャネルの流体のせん断応力規制に関連有用な洞察力を提供.

全セル電圧依存性 L 型 Ca2 +チャネル (VDCCL) 電流、酵素によって分散したラット腸間膜動脈平滑筋細胞、前述11として記録されました。動脈平滑筋細胞されたナイスタチン穿孔の構成で Cs の豊富なピペット液 VDCCL11,16によって電流の流れを容易にする二価陽イオン無料入浴の透析。脱...

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Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

機械刺激感受性イオン チャネルは、パッチク ランプ記録を持つ流体の流れ/せん断力感度の面でよく勉強しました。ただし、実験的プロトコルによってイオン チャネルの流体フロー規則に結果は、誤ったことができます。ここでは、防止および理論的根拠とそのようなエラーを修正するためのメソッドを提供します。

オープン パッチ ・ クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオン チャネルの制御の流れ

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

この提出は、イオンチャネルの規則における流体フローなど、電気生理学的な分野における重要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、イオンチャネルの流体流量調節に関連するデータ解釈のために、膜表面の未攪拌境界層における実際のイオン濃度を推定できることである。この手順を開始するには、焼成ガラスの毛管チューブを曲げてU字型にします。毛細管の内径は、大きなイオン電流を記録する際の直列抵抗を低減するのに十分な大きさである必要があります。次に、3グラムのアガロースを塩化3モルカリウムの100ミリリットルに溶解し、90〜100°Cのホットプレートに置きます。次いで、塩化カリウムアガロースをブリッジに積み込み、ガラスブリッジを溶液に浸漬する。アガロースが設定し、硬化するために室温で一晩それを保ちます。翌日、硬化したアガロース塩からアガロースカリウムを含むガラス橋を慎重に掘り出します。冷蔵庫の3モル塩化カリウムの広い首のボトルに橋を保管してください。この手順では、パッチクランプチャンバの上に、入浴液を積んだ容器を置きます。次に、チューブを吸引して、パッチクランプチャンバーに入浴液を充填します。流体の流れを止めるには、チューブをコンテナ側でクリップして流体の流れを遮断します。その後、吸引側でチューブをクリップし、同時に吸引を停止します。これは定常制御条件です。流体流れのせん断力を適用するには、容器と吸引側の両方のチューブを同時に開きます。流体流せん断力を細胞に適用する前または後に、所定の時間にわたる流体体積の減少を測定することによって、毎分ミリリットルの流量を計算する。液体・金属接合電位の変化を測定するには、入浴室用の生理食塩塩を通常用意し、寒天性塩化カリウム橋の不在と存在下で比較します。次に、3モル塩化カリウム溶液を含むパッチピペットをチャンバに入れ、ピペットと入浴液との間の接合電位シフトを最小限に抑える。次に、電圧クランプアンプを現在のクランプモードに設定します。初期オフセット電位を無効にした後、流量を変化させることによって誘導される電圧の変化を測定します。電圧の変化が液体-金属接合電位であることを確認するために、浴液と参照電極との間のアガロース塩橋を用いて、流体の流れが接合電位に及ぼす影響を再検討する。液体-金属接合電位の変化の結果を用いて、機能電位流量関係を描画し、上流流量による接合電位シフトの飽和値を推定します。そして、入浴液中の塩化物濃度を変化させ、結合電位の塩化濃度関係を描く。なお、流体速度は一定で、隣接する塩化銀参照電極のそれへの塩化濃度の低下を防止するために十分に高いものであるべきである。2つの関係曲線から、測定された接合電位シフトからの塩化物濃度の変化を推定する。VDCC-L電流は、酵素的に分散したラット腸間膜動脈筋細胞に記録され、ナイスタチンはパッチクランプ記録を穿穿刺した。アガロースカリウムクロリドブリッジを使用すると、参照電極と入浴液の間の接合電位を最小限に抑えることができ、流体の流れは独立してVDCC-L電流の電圧を増加させた。しかし、銀銀塩化物基準電極を入浴液に直接接続した場合、アガロースカリウムクロリドブリッジを伴わずに、流体流れの存在下でのIV関係は、静止状態下のVDCC-L電流と比較して右にシフトした。また、アガロースブリッジを用いたラットの好塩基性白血病細胞に記録されたKerr2.1電流の流量増加は、攪拌されていない層効果によって説明できる。その開発後、この技術は、電気生理学の研究者のための道を開きました。だから、イオンチャネル電流の流体流れの調節のためです。電気化学現象の観点からは、細胞膜表面における未撹拌境界層において。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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オープン パッチ ・ クランプのピペットで非撹拌の境界層におけるイオン濃度の測定: 流体によるイオン チャネルの制御の流れ

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