Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Denne forskningen ble støttet av Pioneer Research Center programmet (2011-0027921), av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammer (2015R1C1A1A02036887 og NRF-2016R1A2B4014795) gjennom National Research Foundation av Korea finansiert av departementet for vitenskap, IKT & Fremtiden planlegging, og av en bevilgning av Korea helse teknologi R & D prosjektet gjennom Korea helse industri Development Institute (KHIDI), finansiert av helse og velferd, Sør-Korea (HI15C1540).

Alle eksperimentene ble utført i henhold til institusjonelle veiledning Konkuk University.
1. Agarose Salt broer mellom bad løsningen og Ag/AgCl referanse elektrode
Merk: Agarose 3M KCl salt broer produseres som tidligere beskrevet12 med mindre variasjoner.
<ol><li>Dannelsen av broer<ol>
<li>Bøy brann glass kapillær rør for å danne en U-form etter behov. Den indre diameteren på kapillærene bør være store nok for å redusere serien...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+mechanically+activated+ion+channel,+is+required+for+vascular+development+in+mice.">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li><li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4-mediated+endothelial+Ca2++influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress.">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li><li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension.">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2++channel+via+enhancement+of+Ca2+-induced+Ca2++release+in+rat+ventricular+myocytes.">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K++current+by+convectively+restoring+[K+]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585 (2016).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena.">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2++channel+activation+in+vascular+myocytes.">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li><li>. A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

I denne studien viste vi en metode for å måle virkelige Cl- konsentrasjon i unstirred laget ved den Ag/AgCl referanse elektroden ved å bestemme flytende-metallisk krysset potensial med en åpen patch-klemme pipette fylt med en høy KCl konsentrasjon. Endringen i Cl- konsentrasjon i grenselag kan resultere i et skifte av krysset potensialet når du bytter fra statiske til væske-strømningsforhold. Å bruke en agarose KCl bro mellom referanse elektrode og bading væske kan hindre Cl- ko...

Væskestrøm er en viktig miljømessige kø som styrer mange fysiologiske og patologiske prosesser som flytende flyt-indusert vasodilatasjon og flytende skjær kraft-avhengige vaskulære remodeling og utvikling1,2, 3,4,5. Selv om molekylære mekanismer for biologiske svar strømning skjær kraft ikke er fullt ut forstått, antas det at flytende flyt-mediert regulering av ion kanal gating kritisk kan bidra til flytende flyt-indusert svar5 , 6 , 7 , 8. For eksempel aktivering av endothelial innover likeretter Kir2.1 og Ca2 +-aktivert K+ (KCa2,3, KCNN3) kanaler etter Ca2 + tilstrømningen av væskestrøm har blitt foreslått for å bidra til væske flyt-indusert vasodilatasjon6,7,8. Derfor mange ionekanaler, særlig mekanisk aktivert eller -hemmet kanaler, har vært undersøkt i form av flytende flyt/skjær force sensitivitet med patch-klemme teknikk6,9,10 , 11. avhengig av eksperimentelle protokollen under oppdateringen-klemme opptak, resultater og tolkning av dataene på flytende flyt-regler ion kanaler kan imidlertid være feilaktige10,11.
En kilde til flytende flyt-indusert gjenstander i patch-klemme innspillingen er fra krysset potensielle mellom bad væske og Ag/AgCl referanse elektrode11. Det er generelt antatt at væske/metal krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl elektrode er konstant som Cl- konsentrasjonen av bading væsken holdes konstant, vurderer den kjemisk reaksjon mellom bading løsningen og Ag/AgCl elektrode skal:
AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (Formel 1)
Men i tilfeller der samlet elektrokjemisk reaksjon mellom bading løsningen og Ag/AgCl referanse elektrode (Formel 1) fortsetter fra venstre til høyre Cl- konsentrasjonen av bading væsken tilstøtende Ag/AgCl referanse elektroden (unstirred grenselag12,13,14,15) kan være mye lavere enn i hoveddelen av bading løsning, med mindre nok convectional transport er sikret. Bruker en gammel eller ikke-ideelle Ag/AgCl elektrode med utilstrekkelig klorering AG kan øke slik risiko. Denne flytende flyt-relaterte gjenstand på referanse elektrode, faktisk kan ekskluderes ved å plassere en vanlig agarose-salt bro mellom bading væske og referanse elektrode, siden gjenstand er basert på endringer i ekte Cl- konsentrasjon tilstøtende Ag/AgCl elektrode11. Protokollen presentert i denne studien beskriver hvordan forebygge flyt-relaterte krysset mulige endringer og måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget.
Etter å ha en agarose KCl bro mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode, det er en annen viktig faktor som bør vurderes: bare som referanse Ag/AgCl elektrode fungerer som en Cl- -elektrode, ion kanalene kan også fungere som en ion-selektiv elektrode. Situasjonen for en unstirred grenselag mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode oppstår under flytting av ioner mellom den ekstracellulære og intracellulær løsninger gjennom membranen ionekanaler. Dette innebærer at forsiktighet bør brukes når tolke regulering av ion kanaler av væskestrøm. Som nevnt i vår forrige studie11, bevegelsen av ioner gjennom en løsning der en elektrokjemisk gradering er til stede kan oppstå via tre forskjellige mekanismer: diffusjon, overføring og konveksjon, hvor spredningen er bevegelsen indusert av konsentrasjon gradient, overføringen er bevegelsen drevet av elektrisk gradering og konveksjon er bevegelsen gjennom væske-flow. Blant disse tre transportmekanismer bidrar konveksjon modus mest til bevegelsen av ioner11 (> 1000 ganger større enn spredning eller migrering under vanlige patch-klemme innstillinger). Dette danner teoretiske grunnlaget for krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode kan veldig under ulike statisk og væske-flow forhold11.
Som hypotesen foreslått ovenfor noen facilitatory effekter av væskestrøm på ion kanalen gjeldende kan utledes fra konvektive restaurering av ekte ion konsentrasjoner ved kanalen innløp på membran overflaten (unstirred grenselag) 10. I dette tilfellet, flytende flyt-indusert virkningene på ion kanal strømmer har bare oppstått fra elektrokjemiske hendelser, ikke fra regulering av ion kanal gating. En lignende idé ble tidligere foreslått av Barry og kolleger12,13,14,15 basert på strenge teoretiske og eksperimentelle bevis, også kjent som unstirred laget eller transport nummer effekt. Hvis noen ionekanaler har tilstrekkelig kan enkeltkanals konduktans og lenge nok åpne-tid å skaffe tilstrekkelig transport priser gjennom kanaler (transport raskere i membranen enn i unstirred membran overflaten), en grenselag effekt oppstå . Dermed kan konveksjon-avhengige transport bidra til de endelige væske-flyt-indusert facilitations ion gjeldende10,12,13,14,15.
I denne studien vi understreke viktigheten av bruker en agar agarose salt-broen mens han studerte væske-flyt-indusert regulering av ion strøm. Vi tilbyr også en metode for å måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget ved Ag/AgCl referanse elektrode og membran ion kanalene. Videre kan teoretisk tolkningen av flytende flyt-indusert modulering av ion kanal strøm (dvs. konveksjon hypotesen eller unstirred transport nummer effekt) gi verdifull innsikt for utforming og tolke studier på Skjær kraft-regulering av ionekanaler. Ifølge unstirred grenselag transport nummer effekten forutsi vi at ion kanal strømmer gjennom alle typer membran ionekanaler kan ordnes av strømning, uavhengig av deres biologiske følsomhet strømning skjær force, men bare hvis ion kanalene har tilstrekkelig enkeltkanals konduktans og åpen-lenge. Høyere ion kanal gjeldende tettheter kan øke unstirred grenselag effekten på cellemembranen overflaten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

Væskestrøm er en viktig miljømessige stimulans som styrer mange fysiologiske og patologiske prosesser, som flytende flyt-indusert vasodilatasjon. Selv om molekylære mekanismer for biologiske svar til flytende flyt/skjær styrke ikke er fullt ut forstått, bidra flytende flyt-mediert regulering av ion kanal gating kritisk. Derfor, flytende flyt/skjær force sensitivitet ion kanaler har blitt studert ved hjelp av patch-klemme teknikk. Imidlertid avhengig av eksperimentelle protokollen, kan resultater og tolkning av data være feilaktige. Her presenterer vi eksperimentelle og teoretiske bevis for flytende flyt-relaterte feil og tilby metoder for beregning, forebygge og korrigere feilene. Endringer i krysset potensielle mellom Ag/AgCl referanse elektrode og bading væske ble målt med et åpent pipette fylt med 3 M KCl. strømning kan deretter flytte væske/metal krysset potensielle til ca 7 mV. Omvendt, ved å måle spenning skiftet indusert av strømning, beregnet vi konsentrasjonen i unstirred grensen laget. Statisk tilstanden, kan de virkelige ion konsentrasjonene tilstøtende i Ag/AgCl referanse elektrode eller ion kanal innløpet på cellemembranen overflaten nå så lav som ca 30% av strømmen til tilstanden. Plassere en agarose 3 M kan KCl bro mellom bading væske og referanse elektroden ha forhindret dette problemet med junction potensielle skiftende. Men kan unstirred lageffekten ved siden av cellemembranen overflaten ikke løses på denne måten. Her gir vi en metode for å måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget med en åpen patch-klemme pipette, understreker viktigheten av å bruke en agarose salt-bro mens han studerte flytende flyt-indusert regulering av ion strøm. Derfor kan denne romanen tilnærming, som tar hensyn til de virkelige konsentrasjonene av ioner i den unstirred grenselag, gi nyttig innsikt på eksperimentell design og data tolkning relatert til flytende skjæring stress regulering av ionekanaler .

Hele cellen spenning-avhengige L-type Ca2 + kanal (VDCCL) strøm ble innspilt i enzymatisk spredt rotte hvem arteriell myocytter, som beskrevet tidligere11. De arteriell myocytter var dialyzed med en Cs-rik pipette løsning under konfigurasjonen nystatin-perforert divalent kasjon-fri bading løsning å forenkle gjeldende flyt gjennom VDCCL11,16. Kort depolarizing spenning ra...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Mechanosensitive ionekanaler er ofte studerte i form av flytende flyt/skjær force sensitivitet med patch-klemme opptak. Imidlertid avhengig av eksperimentelle protokollen, kan resultatet på flytende flyt-regler ion kanaler være feilaktige. Her gir vi metoder for å forebygge og korrigere slike feil med en teoretisk basis.

Måling av konsentrasjon i Unstirred grensen laget med åpne Patch-klemme Pipette: implikasjoner i kontroll av Ion kanaler av væske flyt

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Denne innsendingen kan bidra til å svare på viktige spørsmål i den elektrofysiologiske sfæren, for eksempel væskestrømmen i bare forskriftene til iionkanaler. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan estimere den faktiske iionkonsentrasjonen i det ustr. For å begynne denne prosedyren, bøy det avfyrte glasskapillærrøret for å danne en U-form.Kapillærens indre diameter skal være stor nok til å redusere seriemotstanden ved opptak av store iionstrømer. Deretter oppløse tre gram agarose i 100 milliliter av tre-molar kaliumklorid, og legg den på en kokeplate mellom 90 og 100 grader Celsius. Deretter laster du broen med kaliumklorid oppsto, ved å senke glassbroen i løsningen.Hold den over natten ved romtemperatur for at agarose å sette og herde. Neste dag, nøye grave ut agarose kaliumklorid-lastet glass bro fra herdet agarose salt. Oppbevar broen i en bredhalset flaske med tre-molarkaliumklorid i kjøleskapet.I denne prosedyren, plasser en beholder lastet med badeløsning, over patch-klemmekammeret. Fyll deretter patch-klemmekammeret med badeløsningen ved å suge røret. For å stoppe væskestrømmen, fest røret på beholderens side, for å blokkere væskestrømmen.Fest deretter røret på sugesiden for å stoppe suget samtidig. Dette er den stasjonære kontrolltilstanden. For å påføre væskestrømsskjærkraft, åpne begge rørene på beholderen og sugesidene samtidig.Før eller etter påføring av væskestrømmen skjærkraft til cellen, beregne strømningshastigheten i milliliter per minutt ved å måle reduksjonen i væskevolum over en gitt tid. For å måle endringer i væske-metall knutepunkt potensial, forberede en normal fysiologisk-salt saltvann for badekammeret, og sammenligne dem i fravær og tilstedeværelse av agar kaliumklorid bro. Deretter plasserer du en patchpipette som inneholder tre-molar kaliumkloridoppløsning i kammeret, for å minimere koblingspotensialet mellom pipetten og badeløsningene.Sett deretter spenningsklemmeforsterkeren inn i gjeldende klemmemodus. Etter å ha opphevet det opprinnelige forskyvningspotensialet, måler du endringene i spenning som induseres ved å variere strømningshastighetene. For å kontrollere at spenningsendringene er væskemetallkryssepotensialer, må du revurdere effekten av væskestrømmen på koblingspotensialet ved hjelp av den agarose saltbroen mellom badeløsningen og referanseelektroden.Med resultatene av endringene i potensialet for veikryss i flytende metall, trekk funksjonspotensialet for strømningshastighet og estimere den mettende verdien av koblingspotensiale skift med supra-væskestrømningshastigheten. Deretter endrer du kloridkonsentrasjonen i badevæsken, og trekker knutepunktet potensiellkloridkonsentrasjonsforhold. Legg merke til at væskehastigheten skal være konstant, og tilstrekkelig høy for å forhindre reduksjon av kloridkonsentrasjon til den tilstøtende sølvsølvkloridreferanseelektroden.Fra de to relasjonskurvene, estimer endringene i kloridkonsentrasjon fra det målte knutepunktets potensielle skift. VDCC-L strømmer ble registrert i enzymatisk dispergert rotte mesenteriske arterielle myocytter, med nystatin perforert patch-clamp opptak. Med agarose kaliumkloridbroen kunne koblingspotensialet mellom referanseelektroden og badeløsningene minimeres, og væskestrømmen økte VDCC-L-strømmens spenning uavhengig.Men når sølv-sølv klorid referanse elektroden var direkte koblet til badevæsken, uten en agarose kaliumklorid bro, IV forholdet i nærvær av væskestrøm flyttet til høyre, sammenlignet med vdcc-L strømmer under en statisk tilstand. Den væskestrømmen-indusert økning av Kerr 2.1 strømmer, som ble registrert i rotte basofile leukemi celler med agarose broen, kan forklares av den ustrrede lageffekten. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere i over elektrofysiologi.Så det er for regulering av væskestrøm i i ionkanalstrømmene. Når det gjelder elektrokjemiske fenomener, i det ustrede grenselaget på cellemembranoverflaten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch Clamp Recordings på Intakt Dorsal margen fra voksne rotter

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-eksklusjon og ionebytterkromatografi på en SAXS tros

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fange samhandling Kinetics en Ion kanal protein med små molekyler av Bio-lags Interferometry analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Utarbeidelse av høy kvalitet gjæret fisk produkt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse av nøytral lipidsyntese i saccharomyces cerevisiae ved metabolsk merking og tynn lagkromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glykosylaseanalyse ved matriseassistert laserdesorpsjon/ioniseringstid for massespektrometrianalyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...