Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa pioneiro de centro de pesquisa (2011-0027921), pela ciência pesquisa programas básicos (2015R1C1A1A02036887 e 2016R1A2B4014795-NRF) através da nacional Research Foundation da Coreia financiada pelo Ministério da ciência, TIC & Planejamento de futuro e por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D Project através de Instituto para o desenvolvimento indústria da saúde a Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (HI15C1540).

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da Universidade de Konkuk.
1. Agarose pontes de sal entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl
Nota: Agarose 3M KCl pontes de sal são produzidos como anteriormente descrito12 com pequenas variações.
<ol><li>Formação de pontes<ol>
<li>Dobre os tubos capilares de vidro de fogo para formar uma U-forma conforme apropriado. O diâmet...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. 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A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

Neste estudo, temos demonstrado um método para medir a concentração de Cl– real na camada unstirred adjacente para o eletrodo de referência Ag/AgCl, determinando a potencial de junção metal líquido com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta preenchida com um alto KCl concentração. A mudança na concentração de Cl– na camada limite pode resultar em uma mudança de potencial de junção quando mudar de estática para condições de fluxo de fluido. Simplesmente usar um ponte de KCl en...

Fluxo de fluido é uma importante sinalização ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido e fluido cisalhamento força dependente vascular remodelação e desenvolvimento1,2, 3,4,5. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo de fluido não são totalmente compreendidos, acredita-se que o fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon criticamente pode contribuir para respostas induzidas pelo fluxo fluido5 , 6 , 7 , 8. por exemplo, a ativação do retificador endotelial para dentro Kir2.1 e Ca2 +-ativado K+ (KCa2.3, KCNN3) canais depois de Ca2 + influxo pelo fluxo de fluido tem sido sugerido para contribuir ao fluido vasodilatação induzida pelo fluxo6,7,8. Portanto, muitos canais iônicos, canais especialmente ativado mecanicamente ou - inibidas, têm sido estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com o remendo-braçadeira técnica6,9,10 , 11. no entanto, dependendo do protocolo experimental realizado durante a gravação da remendo-braçadeira, resultados e interpretação dos dados sobre o fluxo de fluido-regulamentos de canais iônicos podem ser errônea10,11.
Uma fonte de fluido induzida por fluxo artefatos em gravação de remendo-braçadeira é de potencial entre o fluido de banho e de eletrodo de referência Ag/AgCl11da junção. Geralmente acredita-se que a junção de metal líquido potencial entre o banho fluido e o eletrodo de Ag/AgCl é constante como a concentração de Cl– do banho líquido é mantida constante, considerando a resposta química entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl para ser:
AG + Cl–↔ AgCl + elétron (e–) (equação 1)
No entanto, em um caso onde a reação global eletroquímica entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (equação 1) procede da esquerda para a direita, a concentração de Cl– do banho fluido adjacente para o Ag/AgCl referência eletrodo (camada de limite unstirred12,13,14,15) pode ser muito menor do que a granel de banhar a solução, a não ser suficiente convecçao transporte é assegurada. Usar um eletrodo de Ag/AgCl velho ou não-ideal com cloração inadequada do Ag pode aumentar esse risco. Este artefato relacionados ao fluxo de fluido para o eletrodo de referência, na verdade, pode ser excluído, simplesmente colocando uma ponte de agarose-sal convencional entre o banho fluido e referência eletrodo, desde que o artefato é baseado em alterações na real Cl– concentração adjacente para o eletrodo de Ag/AgCl11. O protocolo apresentado neste estudo descreve como impedir que as alterações de potencial de junção de fluxo-relacionados e medir as concentrações de íon real na camada limite unstirred.
Depois de colocar um ponte de KCl entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl de agarose, há outro fator crucial que deve ser considerado: apenas como referência o eletrodo de Ag/AgCl atua como um eletrodo de Cl– , os canais iônicos também podem funcionar como um eletrodo íon-seletivo. A situação de uma camada de limite unstirred entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl surge durante o movimento de íons entre as soluções extracelulares e intracelulares através dos canais de íon de membrana. Isto implica que o cuidado deve ser usado quando interpretar o Regulamento do íon canais pelo fluxo de fluido. Conforme discutido no estudo anterior11, o movimento de íons através de uma solução em que se encontra um gradiente electroquímico pode ocorrer através de três mecanismos distintos: difusão e convecção, onde a difusão é o movimento de migração induzida pelo gradiente de concentração, a migração é o movimento impulsionado pelo gradiente elétrico e convecção é o movimento através de fluxo de fluido. Entre esses mecanismos de três transporte, modo convecção contribui mais para o movimento de íons11 (> 1.000 vezes maiores do que a difusão ou migração sob configurações do remendo-braçadeira habitual). Isto constitui a base teórica por potenciais entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl junção pode muito sob diferentes condições estáticas e fluxo de fluido11.
Conforme a hipótese acima proposta, alguns efeitos facilitatórios do fluxo do fluido no canal iônico atual podem ser inferidos a partir da restauração convectiva das concentrações do íon real adjacentes à entrada do canal, na superfície da membrana (camada de limite unstirred) 10. neste caso, os efeitos de induzida pelo fluxo de fluido em correntes do canal de íon simplesmente surgiram de eventos eletroquímicos, não do Regulamento de retenção de canal de íon. Uma ideia semelhante foi anteriormente sugerida por Barry e colegas12,13,14,15 com base em Considerações teóricas rigorosas e evidência experimental, também conhecida como a camada de unstirred ou efeito do número de transportes. Se alguns canais de íon tem suficiente condutância de canal único e bastante aberto-tempo para fornecer taxas de transporte suficiente através dos canais (um ritmo mais rápido transporte na membrana do que na superfície da membrana unstirred), um efeito de camada limite podem surgir . Assim, o transporte de convecção-dependente pode contribuir para as eventuais facilitações fluido fluxo-induzida do íon atual10,12,13,14,15.
Neste estudo, enfatizamos a importância de usar um ágar ou agarose sal-ponte enquanto estudava fluido fluxo-induzida pelo Regulamento das correntes de íon. Nós também fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred adjacente para os canais de íon da eletrodo e membrana da referência do Ag/AgCl. Além disso, a interpretação teórica do fluido modulação induzida pelo fluxo das correntes do canal de íon (ou seja, a hipótese de convecção ou camada unstirred transporte número efeito) pode fornecer informações valiosas para a concepção e interpretação de estudos sobre o cisalhamento força-regulamento de canais iônicos. De acordo com o efeito de número de transporte camada de limite unstirred, prevemos que as correntes de canal de iões através de todos os tipos de canais iônicos de membrana podem ser facilitadas pelo fluxo de fluido, independente de sua sensibilidade biológica à força de cisalhamento fluxo fluido, mas somente se os canais de íon tem suficiente condutância de canal único e aberto-tempo. Maiores densidades de corrente de canal de íon pode aumentar o efeito unstirred da camada limite na superfície da membrana celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

Fluxo de fluido é um importante estímulo ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo fluido/não são totalmente compreendidos, fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon pode contribuir criticamente. Portanto, sensibilidade de força fluido fluxo/tesoura de canais iônicos tem sido estudada usando a técnica patch-clamp. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados e a interpretação dos dados podem ser errôneas. Aqui, apresentamos a evidência experimental e teórica para erros relacionados ao fluxo fluidos e fornecer métodos para estimar, prevenindo e corrigindo esses erros. Alterações na junção potencial entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido foram medidas com uma pipeta aberta cheia de 3 M KCl. escoamento de fluidos pode, em seguida, deslocar o mV de potencial de aproximadamente 7 junção metal líquido. Por outro lado, medindo-se a mudança de tensão induzida pelo fluxo de fluido, estimamos a concentração do íon na camada limite unstirred. Na condição estática, as concentrações de íon real adjacentes para a entrada do canal eletrodo ou íon da referência do Ag/AgCl na superfície da membrana celular podem chegar tão baixo como aproximadamente 30% do que na condição de fluxo. Colocando um agarose 3M ponte de KCl entre o eléctrodo de referência e fluido banho pode ter evitado este problema de deslocamento potencial de junção. No entanto, o efeito de camada unstirred adjacente à superfície da membrana celular não poderia ser fixado desta forma. Aqui, nós fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta, enfatizando a importância do uso de um sal de agarose-ponte enquanto estudava fluido Regulamento induzida pelo fluxo de correntes de íon. Portanto, esta nova abordagem, que leva em consideração a concentração real de íons na camada limite unstirred, pode fornecer uma visão útil no delineamento experimental e interpretação de dados relacionados ao regulamento de tensão de cisalhamento fluido de canais iônicos .

Toda célula dependentes de voltagem Ca L-tipo2 + canal (VDCCL) correntes foram gravadas nos rato enzimaticamente dispersos miócitos de arterial mesentérica, como descrito anteriormente,11. Os miócitos arteriais foram diálise com uma solução de pipeta Cs-rica sob a configuração de nistatina perfurado com solução de banho livre de cátion divalente, para facilitar o fluxo de corrente através de de11,</sup...

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Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Canais de íon Mechanosensitive muitas vezes são estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com gravação de remendo-braçadeira. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados no fluxo fluidos-regulamentos de canais iônicos pode ser errôneo. Aqui, nós fornecemos métodos de prevenção e corrigir esses erros com uma base teórica.

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Este subal pode ajudar a responder a perguntas-chave na esfera eletrofisi fisiológica, como o fluxo de fluidos apenas nas regulamentações dos canais de íons. A principal vantagem desta técnica é que ela pode estimar a concentração real de íons na camada de limite não írparada da superfície da membrana para interpretação de dados relacionada à regulação do fluxo de fluidos dos canais de íons. Para iniciar este procedimento, dobre o tubo capilar de vidro disparado para formar uma forma de U.O diâmetro interno do capilar deve ser grande o suficiente para reduzir a resistência da série ao registrar grandes correntes de íons. Em seguida, dissolva três gramas de agarose em 100 mililitros de cloreto de potássio de três molares, e coloque-o em uma placa quente entre 90 e 100 graus Celsius. Em seguida, carregue a ponte com o cloreto de potássio, imergindo a ponte de vidro na solução.Mantenha-o durante a noite em temperatura ambiente para que a agarose afinada e endureça. No dia seguinte, desenterre cuidadosamente a ponte de vidro carregada de cloreto de potássio agarose do sal agarose endurecido. Guarde a ponte em uma garrafa de pescoço largo de cloreto de potássio de três molares na geladeira.Neste procedimento, coloque um recipiente carregado com solução de banho, acima da câmara de remendo. Em seguida, encha a câmara de remendo com a solução de banho aspirando o tubo. Para parar o fluxo de fluido, corte o tubo ao lado do recipiente, para bloquear o fluxo de fluido.Em seguida, corte o tubo no lado da sucção para parar a sucção ao mesmo tempo. Esta é a condição de controle estacionário. Para aplicar a força da cisalhamento do fluxo de fluidos, abra os dois tubos no recipiente e os lados da sucção ao mesmo tempo.Antes ou depois de aplicar a força de cisalhamento do fluxo de fluidos na célula, calcule a taxa de fluxo em mililitro por minuto, medindo a diminuição do volume de fluidos ao longo de um determinado tempo. Para medir as mudanças no potencial de junção líquido-metal, prepare um soro fisiológico normal para a câmara de banho e compare-os na ausência e presença de ponte de cloreto de potássio de ágar. Em seguida, coloque uma pipeta de remendo contendo solução de cloreto de potássio de três molares na câmara, para minimizar o possível deslocamento de junção entre a pipeta e as soluções de banho.Em seguida, ajuste o amplificador do grampo de tensão no modo de fixação atual. Depois de anular o potencial inicial de deslocamento, meça as mudanças na tensão induzidas pela variação das taxas de fluxo. Para verificar se as alterações na tensão são potenciais de junção líquido-metal, reexamine o efeito do fluxo de fluidos sobre o potencial de junção, utilizando a ponte de sal agarose entre a solução de banho e o eletrodo de referência.Com os resultados das mudanças no potencial de junção líquido-metal, desenhe as relações potenciais de fluxo da função e estime o valor saturado da possível mudança de junção pela taxa de fluxo supra-fluido. Em seguida, mude a concentração de cloreto no fluido de banho, e desenhe a relação potencial de concentração de cloreto de junção. Observe que a taxa de fluido deve ser constante e suficientemente alta para evitar a diminuição da concentração de cloreto ao do eletrodo de referência de cloreto prata-prata adjacente.A partir das duas curvas de relacionamento, estime as mudanças na concentração de cloreto a partir da mudança potencial de junção medida. As correntes VDCC-L foram registradas nos miócitos arterials mesentéricas enzimáticas dispersas, com gravação perfurada por grampo de remendo de nystatina. Com a ponte de cloreto de potássio agarose, o potencial de junção entre o eletrodo de referência e as soluções de banho poderia ser minimizado, e o fluxo de fluidos aumentou a tensão da corrente VDCC-L de forma independente.No entanto, quando o eletrodo de referência de cloreto de prata-prata estava diretamente ligado ao fluido de banho, sem uma ponte de cloreto de potássio agarose, a relação IV na presença de fluxo de fluidos mudou para a direita, em comparação com a das correntes VDCC-L sob uma condição estática. O aumento induzido pelo fluxo de líquido das correntes kerr 2.1, que foram registradas em células de leucemia basofílica de ratos com a ponte agarose, pode ser explicado pelo efeito de camada não-lada. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da sobre eletrofisiologia.Então é para a regulação do fluxo de fluidos nas correntes do canal de íons. Em termos de fenômenos eletroquímicos, na camada de limite não írpara na superfície da membrana celular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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