Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Esta investigación fue apoyada por el programa de centro de investigación pionero (2011-0027921), por programas de básico ciencia investigación (2015R1C1A1A02036887 y NRF-2016R1A2B4014795) a través de la Fundación de investigación nacional de Corea financiado por el Ministerio de ciencia, TIC & Planificación de futuro y por una beca de la Corea salud tecnología R & D Project a través de Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud y asistencia social, República de Corea (HI15C1540).

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices institucionales de la Universidad Konkuk.
1. agarosa sal puentes entre la solución del baño y electrodo de referencia Ag/AgCl
Nota: Agarosa 3M KCl puentes de sal se producen como se ha descrito12 con variaciones de menor importancia.
<ol><li>Formación de puentes<ol>
<li>Doblar los tubos capilares de vidrio fuego para formar una forma de U según el caso. El diámetro inte...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K++current+by+convectively+restoring+[K+]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585 (2016).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. 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A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

En este estudio, hemos demostrado un método para medir la real concentración de Cl– en la marchara capa adyacente al electrodo de referencia Ag/AgCl determinando el potencial cruce de metal líquido con una pipeta abierta abrazadera del remiendo con un alta KCl concentración. El cambio en la concentración de Cl– en la capa límite puede resultar en un cambio de potencial de salida cuando se cambia de estática a las condiciones de flujo de fluido. Simplemente usando una agarosa puente KCl en...

Flujo de fluidos es una importante señal ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos como la vasodilatación inducida por el flujo de líquido y fluido cortante fuerza dependiente vascular remodelación y desarrollo1,2, 3,4,5. Aunque los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas a fuerza de esquileo del flujo de fluidos no se entienden completamente, se cree que fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente a respuestas inducidas por el flujo de fluidos5 , 6 , 7 , 8. por ejemplo, activación del rectificador endotelial interno Kir2.1 y Ca2 +-K activada+ (KCa2.3, KCNN3) canales después de Ca2 + afluencia de flujo de fluidos se ha sugerido para contribuir a líquido vasodilatación inducida por el flujo6,7,8. Por lo tanto, muchos canales del ion, especialmente activado mecánicamente o - inhibición canales, han sido estudiadas en términos de flujo fluido/seguridad sensibilidad a la fuerza con la técnica de patch-clamp6,9,10 , 11. sin embargo, dependiendo del protocolo experimental realizado durante la grabación-abrazadera del remiendo, los resultados y la interpretación de los datos de flujo líquidos-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneas10,11.
Una fuente de artefactos inducidos por el flujo de fluido en grabación de patch-clamp es de la Unión potencial entre el baño líquido y de electrodo de referencia Ag/AgCl11. Se cree generalmente que la ensambladura del metal líquido potencial entre el baño líquido y el electrodo de Ag/AgCl es constante la concentración de Cl– del líquido del baño se mantenga constante, teniendo en cuenta la respuesta química entre la solución del baño y el electrodo de Ag/AgCl que:
AG + Cl–↔ AgCl + electrón (e–) (ecuación 1)
Sin embargo, en un caso donde la reacción electroquímica general entre la solución de baño y electrodo de referencia Ag/AgCl (ecuación 1) se procede de izquierda a derecha, la concentración de Cl– del baño líquido adyacente a Ag/AgCl de referencia electrodo (capa límite marchara12,13,14,15) puede ser mucho menor que en la mayor parte del baño de solución, a menos que suficiente transporte convencionales está garantizada. Utilizando un electrodo de Ag/AgCl viejo o no ideales con cloración inadecuada de Ag puede aumentar ese riesgo. Este artefacto relacionados con el flujo de fluido en el electrodo de referencia, de hecho, puede ser excluido, simplemente colocando un puente convencional de agarosa-sal entre el baño líquido y referencia electrodo, ya que el artefacto se basa en alteraciones en Cl verdadero– concentración junto a la del electrodo de Ag/AgCl11. El protocolo presentado en este estudio describe cómo prevenir los cambios potenciales relacionadas con el flujo de salida y medir las concentraciones de iones real en la capa de límite inviolables.
Después de colocar una agarosa puente KCl entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl, hay otro factor fundamental que debe considerar: solo como referencia de Ag/AgCl actúa como un electrodo Cl– , los canales iónicos también pueden funcionar como un electrodo selectivo de iones. La situación de una capa límite inviolables entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl se presenta durante el movimiento de iones entre las soluciones a través de los canales iónicos de la membrana extracelulares e intracelulares. Esto implica que debe tener precaución al interpretar la regulación de iones canales de flujo de fluidos. Como comentamos en nuestro anterior estudio11, el movimiento de iones a través de una solución en la que existe un gradiente electroquímico puede ocurrir por tres mecanismos distintos: difusión, migración y convección, donde la difusión es el movimiento inducida por el gradiente de concentración, la migración es el movimiento impulsado por el gradiente eléctrico y la convección es el movimiento a través de flujo de líquido. Entre estos mecanismos de tres transporte, el modo de convección contribuye más al movimiento de iones11 (> 1.000 veces mayor que la difusión o la migración en la configuración habitual de abrazadera del remiendo). Esto forma la base teórica de por qué conexiones posibles entre el baño líquido y el electrodo de referencia Ag/AgCl pueden muy bajo diferentes condiciones estática y el flujo de fluido11.
Según la hipótesis propuesta anteriormente, algunos efectos facilitatory del flujo de fluidos en el canal de ion actual pueden inferirse de la restauración convectiva de las concentraciones de iones real junto a la entrada del canal en la superficie de la membrana (capa de límite inviolables) 10. en este caso, los efectos inducidos por el flujo fluidos en corrientes del canal de iones simplemente han surgido de eventos electroquímicos, no de la regulación de la compuerta de canal de iones. Una idea similar fue sugerida previamente por Barry y colaboradores12,13,14,15 basado en rigurosas consideraciones teóricas y la evidencia experimental, también conocida como la capa inviolables o efecto del número de transporte. Si algunos canales iónicos tienen suficiente solo canal conductancia y suficientemente largo tiempo abierto para proporcionar suficiente transporte precios a través de los canales (una más rápida tasa de transporte en la membrana que en la superficie de la membrana inviolables), un efecto de capa límite pueden surgir . El transporte dependiente de la convección puede contribuir a las eventual facilitaciones inducida por el flujo de líquido de ion actual10,12,13,14,15.
En este estudio, destacamos la importancia de la utilización de agar o agarosa al puente de sal mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de iones. También proporcionamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara junto a los Ag/AgCl referencia electrodos y membranas canales de iones. Además, la interpretación teórica de fluido modulación inducida por el flujo de corrientes de canal de iones (es decir, convección hipótesis o efecto número de capa marchara transporte) puede proporcionar información valiosa para diseñar e interpretar estudios sobre cortante fuerza-regulación de canales iónicos. Según el efecto de número de transporte de capa límite inviolables, predecimos que corrientes de canal de iones a través de todos los tipos de canales iónicos de membrana pueden facilitarse por el flujo de líquido, independientemente de su sensibilidad biológica a la fuerza de esquileo del flujo de fluidos, pero sólo si los canales iónicos tienen conductancia suficiente de canal único y tiempo abierto. Mayores densidades de corriente de canal de ion puede aumentar el efecto de la capa límite marchara en la superficie de la membrana de la célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

Flujo de fluidos es un importante estímulo ambiental que controla muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la vasodilatación inducida por el flujo de fluido. Aunque no se entienden totalmente los mecanismos moleculares de las respuestas biológicas para flujo líquido/fuerza, fluido regulación mediada por flujo de ion channel gating puede contribuir críticamente. Por lo tanto, sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo líquido de los canales iónicos ha sido estudiada mediante la técnica de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados y la interpretación de los datos pueden ser erróneas. Aquí, presentamos la evidencia experimental y teórica para errores relacionados con el flujo de líquido y proporciona métodos para estimar, prevenir y corregir estos errores. Cambios en Unión potencial entre el electrodo de referencia Ag/AgCl y el fluido del baño fueron medidos con una pipeta abierta llenada de 3 M KCl. flujo de fluidos podría entonces cambiar el metal líquido cruce potencial de aproximadamente 7 mV. Por el contrario, midiendo el cambio de voltaje inducido por el flujo de fluidos, se estimó la concentración de iones en la capa de límite inviolables. En la condición estática, las concentraciones de iones real junto a la Ag/AgCl referencia electrodo o ion canal entrada en la superficie de la membrana de la célula pueden llegar a tan bajos como 30% de en la condición de flujo. Colocando una agarosa 3 M puente KCl entre el electrodo de referencia y líquido de baño puede haber evitado este problema de desplazamiento potencial de cruce. Sin embargo, el efecto de marchara capa adyacente a la superficie de la membrana de la célula no podría fijarse de este modo. Presentamos un método para medir las concentraciones de iones real en la capa de límite marchara con una pipeta abierta abrazadera del remiendo, haciendo hincapié en la importancia de utilizar un puente de sal de agarosa mientras estudiaba regulación inducida por el flujo de fluido de las corrientes de ion. Por lo tanto, este nuevo enfoque, que tenga en cuenta las concentraciones reales de iones en la capa de límite inviolables, puede proporcionar la penetración útil en el diseño experimental y la interpretación de los datos relacionados con la regulación de la tensión de esquileo líquido de los canales iónicos .

Todo celular dependientes de voltaje tipo L de Ca2 + canal (VDCCL) corrientes se registraron en los miocitos arterial mesentérico de rata enzimáticamente dispersos, como se describió anteriormente11. Los miocitos arteriales se dializaron con una solución de pipeta Cs-ricos en la configuración de perforado de nistatina con solución de baño libre de cationes divalentes para facilitar el flujo de corriente a través de VDCCL<sup...

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Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Canales del ion Mechanosensitive se estudian a menudo en términos de sensibilidad a la fuerza/esquileo del flujo fluido con grabación de patch-clamp. Sin embargo, dependiendo del protocolo experimental, los resultados de flujo de fluido-regulaciones de los canales iónicos pueden ser erróneo. Aquí, ofrecemos métodos para prevenir y corregir estos errores con una base teórica.

Medición de la concentración de iones en la capa de límite marchara con pipeta abierta de Patch-Clamp: implicaciones en el Control de los canales iónicos por líquido fluyen

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Este envío puede ayudar a responder preguntas clave en la esfera electrofisiológica, como el flujo de fluidos solo en las regulaciones de los canales iónicos. La principal ventaja de esta técnica es que puede estimar la concentración iónica real en la capa límite no cancionada de la superficie de la membrana para la interpretación de datos relacionados con la regulación del flujo de fluidos de los canales iónicos. Para comenzar este procedimiento, doble el tubo capilar de vidrio encendido para formar una forma U.El diámetro interior del capilar debe ser lo suficientemente grande como para reducir la resistencia en serie al registrar grandes corrientes iónicas. A continuación, disolver tres gramos de agarosa en 100 mililitros de cloruro de potasio de tres molares, y colocarlo en una placa caliente entre 90 y 100 grados Celsius. A continuación, cargue el puente con la agarosa de cloruro de potasio, sumergiendo el puente de vidrio en la solución.Manténgalo durante la noche a temperatura ambiente para que la agarosa se ajuste y se endurezca. Al día siguiente, saque cuidadosamente el puente de vidrio cargado de cloruro de potasio de la sal de agarosa endurecida. Almacene el puente en una botella de cuello ancho de cloruro de potasio de tres molares en el refrigerador.En este procedimiento, coloque un recipiente cargado con solución de baño, por encima de la cámara de sujeción de parches. A continuación, llene la cámara de sujeción de parches con la solución de baño succionando el tubo. Para detener el flujo de fluido, recorte el tubo en el lado del contenedor, para bloquear el flujo de fluido.A continuación, sujete el tubo en el lado de aspiración para detener la succión al mismo tiempo. Esta es la condición de control estacionario. Para aplicar la fuerza de cizallamiento del flujo de fluido, abra ambos tubos en el recipiente y los lados de succión al mismo tiempo.Antes o después de aplicar la fuerza de cizallamiento del flujo de fluido a la célula, calcule el caudal en mililitro por minuto midiendo la disminución del volumen de fluido durante un tiempo determinado. Para medir los cambios en el potencial de unión líquido-metal, prepare una solución salina fisiológica-salada normal para la cámara de baño y compárelas en ausencia y presencia de puente de cloruro de potasio de agar. A continuación, coloque una pipeta de parche que contenga solución de cloruro de potasio de tres molares en la cámara, para minimizar el posible desplazamiento de unión entre la pipeta y las soluciones de baño.A continuación, ajuste el amplificador de abrazadera de voltaje al modo de abrazadera de corriente. Después de anular el potencial de compensación inicial, mida los cambios en el voltaje inducidos por la variación de los caudales. Para verificar que los cambios en la tensión son potenciales de unión líquido-metal, vuelva a examinar el efecto del flujo de fluido en el potencial de unión, utilizando el puente de sal de agarosa entre la solución de baño y el electrodo de referencia.Con los resultados de los cambios en el potencial de unión líquido-metal, dibuje las relaciones de caudal potencial de la función y estime el valor de saturación del cambio potencial de unión por el caudal suprafludo. A continuación, cambie la concentración de cloruro en el líquido de baño y dibuje la relación de concentración de cloruro potencial de unión. Tenga en cuenta que la velocidad de fluido debe ser constante y suficientemente alta para evitar la disminución de la concentración de cloruro a la del electrodo de referencia de cloruro de plata y plata adyacente.A partir de las dos curvas de relación, estime los cambios en la concentración de cloruro a partir del desplazamiento potencial de unión medido. Las corrientes VDCC-L se registraron en los miocitos arteriales mesentéricos de rata dispersos enzimáticamente, con grabación de abrazadera de parche perforada con nistatina. Con el puente de cloruro de potasio de agarosa, el potencial de unión entre el electrodo de referencia y las soluciones de baño podría minimizarse, y el flujo de fluido aumentó el voltaje de la corriente VDCC-L de forma independiente.Sin embargo, cuando el electrodo de referencia de cloruro de plata y plata se conectó directamente al fluido de baño, sin un puente de cloruro de potasio agarosa, la relación IV en presencia de flujo de fluido se desplazó hacia la derecha, en comparación con la de las corrientes VDCC-L bajo una condición estática. El aumento inducido por el flujo de fluido de las corrientes Kerr 2.1, que se registraron en células de leucemia basófila de rata con el puente de la agarosa, puede explicarse por el efecto de capa sin cansar. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en la sobre la electrofisiología.Así que es para la regulación del flujo de fluidos en las corrientes de canal iónico. En términos de fenómenos electroquímicos, en la capa límite sin cansar en la superficie de la membrana celular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch Clamp grabaciones en Intacto dorsal ganglios de la raíz de ratas adultas

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Investigación

Bioquímica

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Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

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Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Captura de la cinética de la interacción de una proteína de canal iónico con moléculas pequeñas por el ensayo de interferometría de la Bio-capa

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