Name: measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Bu araştırma öncü araştırma merkezi programı (2011-0027921), tarafından temel bilim araştırma programlarını (2015R1C1A1A02036887 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1A2B4014795) Ulusal Araştırma Vakfı Bilim Bakanlığı tarafından ICT finanse Kore tarafından desteklenmiştir & Gelecek planlama ve Kore sağlık teknoloji R & D proje Kore Sağlık Sanayi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla verilmesi tarafından finanse edilen Sağlık Bakanlığı & refah, Kore Cumhuriyeti (HI15C1540) tarafından.

Tüm deneyler Konkuk Üniversitesi Kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. özel tuz banyosu çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot arasında köprü
Not: Özel 3M KCl tuz köprüleri daha önce üretilen12 küçük farklılıklar nedeniyle nitelendirdi.
<ol><li>Köprüler oluşumu<ol>
<li>U şekli uygun oluşturmak için yangın cam kılcal tüpler viraj. Kılcal iç çapı büyük iyon akımlarını kaydederken...

<ol>
	<li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress.">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li><li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries.">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li><li>Langille, B. L., O&#8217;Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent.">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li><li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo.">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li><li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+mechanically+activated+ion+channel,+is+required+for+vascular+development+in+mice.">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li><li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV4-mediated+endothelial+Ca2++influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress.">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li><li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension.">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2++channel+via+enhancement+of+Ca2+-induced+Ca2++release+in+rat+ventricular+myocytes.">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K++current+by+convectively+restoring+[K+]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585 (2016).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes:+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies.">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li><li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroosmosis+in+membranes:+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental.">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li><li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations.">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li><li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena.">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2++channel+activation+in+vascular+myocytes.">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pfl&#252;gers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li><li>. A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018)</li><li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis.">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li><li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium:+for+better+and+for+worse.">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li></ol>

Bu çalışmada, biz gerçek Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl referans elektrot için bitişik unstirred katmanındaki bir yüksek KCl ile dolu bir açık yama-kelepçe pipet ile likit metal kavşak potansiyel belirlenerek ölçmek için bir yöntem gösterdi konsantrasyon. Sınır tabaka Cl- konsantrasyon değişikliği kavşak potansiyel bir vardiyada statik sıvı akış koşulları için geçiş yaparken neden olabilir. Sadece bir özel banyo sıvı ve referans elektrot arasında KCl köprü kullanara...

Sıvı akış sıvı akış kaynaklı vazodilatasyon ve sıvı kesme kuvvetleri bağımlı vasküler remodeling ve geliştirme1,2gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçler denetleyen önemli bir çevresel işaretimiz, 3,4,5. Her ne kadar biyolojik yanıtları sıvı akış kesme kuvvetleri için moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değil, bu iyon kanal perdeleme sıvı akışı aracılı Yönetmeliğin eleştirel sıvı akış kaynaklı yanıt-e doğru5 ' e katkıda bulunabilir inanılıyor , 6 , 7 , 8. Örneğin, endotel içe doğrultucu Kir2.1 ve Ca2 +aktivasyonu-aktif K+ (KCa2.3, KCNN3) kanalları Ca2 + akını sıvı akış tarafından sıvı için katkıda bulunmak için önerilen sonra akış kaynaklı vazodilatasyon6,7,8. Bu nedenle, birçok iyon kanalları, sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılık yama-klemp tekniği6,9,10 ile açısından okudu kanal, özellikle mekanik aktif veya - Inhibe , 11. ancak, yama kayıt tipi kelepçe sırasında gerçekleştirilen Deneysel protokol bağlı olarak sonuçları ve iyon kanallarının sıvı akışı mevzuatı hakkında veri yorumlanması hatalı10,11olabilir.
Bir sıvı akış kaynaklı eserler içinde yama-kelepçe yazmak banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot11arasında potansiyel kavşak üzerinden kaynağıdır. Bu genellikle banyo sıvı Cl- konsantrasyonu sabit tutulması gibi sıvı/metal kavşak banyo sıvı ve Ag/AgCl elektrot arasında potansiyel banyo çözüm arasında kimyasal karşılık göz önünde bulundurarak sürekli inanılıyor ve Ag/AgCl elektrot olmak:
AG + Cl-↔ AgCl + elektron (e-) (denklem 1)
Ancak, Cl- konsantrasyonu Ag/AgCl bitişik banyo sıvısının nerede genel olarak elektrokimyasal reaksiyon banyo çözüm ve Ag/AgCl referans elektrot (denklem 1) arasında soldan sağa doğru devam eder bir durumda, başvuru yeterli convectional ulaşım sağlanmaktadır sürece elektrot (unstirred sınır tabaka12,13,14,15) çok bu çözüm, banyo toplu olarak daha düşük olabilir. Ag yetersiz klorlama ile bir eski veya ideal olmayan Ag/AgCl elektrot kullanarak böyle bir risk artabilir. Bu sıvı akışı ile ilgili yapı, referans elektrodu, aslında, sadece banyo sıvı ile başvuru geleneksel bir özel-tuz Köprüsü yanında duvar ilanı hariç olmak objeyi gerçek Cl- içinde değişiklikler temel bu yana elektrot, konsantrasyon Ag/AgCl elektrot11' e bitişik. Bu çalışmada sunulan protokolü bağlantı akışı ile ilgili olası değişiklikleri önlemek ve unstirred sınır tabaka konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek nasıl açıklar.
Bir özel banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında KCl köprü koyduktan sonra düşünülmesi gereken bir diğer önemli faktör var: sadece referans olarak Ag/AgCl elektrot Cl- elektrot gibi davranır, iyon kanalları da işlev görebilir bir iyon-seçici elektrot gibi. Banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında unstirred bir sınır tabaka durumun iyonların hareketi sırasında membran iyon kanalları yoluyla ekstraselüler ve hücre içi çözüm arasında ortaya çıkar. Bu iyon Yönetmeliği yorumlama tarafından sıvı akış kanalları zaman dikkatli kullanılmalıdır anlamına gelir. Bizim önceki çalışma11' de tartııldıı gibi bir elektrokimyasal gradyan mevcut çözüm iyonların hareketi üç farklı mekanizma ile ortaya çıkabilir: difüzyon, geçiş ve konveksiyon, difüzyon hareketi nerede konsantrasyon gradyanı tarafından indüklenen, geçiş hareketi elektrik degrade tarafından tahrik olur ve konveksiyon yoluyla sıvı akış hareketidir. Bu üç taşıma mekanizmaları arasında konveksiyon modu çoğu iyonları11 (> 1000 kere difüzyon veya geçiş her zamanki yama-kelepçe ayarlar altında daha büyük) hareketine katkıda bulunur. Neden kavşak banyo sıvı ve Ag/AgCl referans elektrot arasında potansiyel çok farklı statik ve sıvı akış koşulları11altında bu teorik temelini oluşturur.
Yukarıda önerilen hipotez başı olarak, sıvı akış facilitatory bazı etkileri iyon kanal geçerli gerçek iyon konsantrasyonu (unstirred sınır tabaka) membran yüzey kanal girişi için bitişik konvektif restorasyonu dan anlaşılmaktadır 10. Bu durumda, iyon kanal akımları akış kaynaklı sıvı etkisi sadece elektrokimyasal olaylardan değil yönetmelik iyon kanal perdeleme dan çıkmıştır. Benzer bir fikir titiz teorik hususlar ve deneysel kanıt, olarak da bilinen unstirred katman göre Barry ve meslektaşları12,13,14,15 tarafından daha önce önerilen veya taşıma sayı etkisi. Bazı iyon kanalları yeterli varsa tek kanal gürültülerinden ve yeterli taşıma kanallardan (zarda unstirred membran yüzey bir daha hızlı aktarım hızı), bir sınır tabaka etkisi oranları sağlamak için yeterince uzun açık zaman ortaya çıkabilir . Böylece, konveksiyon bağımlı taşıma Ion geçerli10,12,13,14,15nihai sıvı akışı bağlı merkezler için katkıda bulunabilir.
Bu çalışmada, biz bir agar veya özel kullanmanın önemini vurgulamak tuz-köprü sıvı akışı bağlı yönetmelik iyon akıntılarının eğitim sırasında. Biz de unstirred sınır tabaka Ag/AgCl referans elektrot ve membran iyon kanalları için bitişik konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca, sıvı akış kaynaklı modülasyon iyon kanal akımlarının (Yani, konveksiyon hipotez veya unstirred katman taşıma sayı etkisi) teorik yorumlanması tasarlama ve üzerinde çalışmalar yorumlama için değerli bilgiler sağlayabilir kesme kuvvetleri-düzenlenmesi iyon kanalları. Unstirred sınır tabaka taşıma sayı etkisi göre biz iyon kanal akımları yoluyla membran iyon kanalları her türlü akışkan akışı, bağımsız olarak sıvı akış kesme kuvvetleri, ama sadece onların biyolojik duyarlılık tarafından Eğer kolaylaştırılabilir olduğunu tahmin iyon kanalları yeterli tek kanal gürültülerinden ve uzun açık-zaman var. Daha yüksek iyon kanal akım yoğunluğu hücre membran yüzeyinde unstirred sınır tabaka etkisi artabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:784px;" width="783">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">RC-11 open bath chamber&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Warner instruments, USA</td>
			<td style="width:149px;">W4 64-0307</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ag/AgCl electrode pellet</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>EP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>HEKA, Germany</td>
			<td>EPC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Voltage-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid pump</td>
			<td>KNF Flodos, Switzerland</td>
			<td>FEM08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of ion concentration in the unstirred boundary layer with open patch-clamp pipette: implications in control of ion channels by fluid flow

Sıvı akış sıvı akış kaynaklı vazodilatasyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçleri denetleyen önemli bir çevresel uyarıcı olduğunu. Her ne kadar biyolojik yanıtları sıvı akışı/kesme kuvvetleri için moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değil, iyon kanal perdeleme sıvı akışı aracılı Yönetmeliğin eleştirel katkıda bulunabilir. Bu nedenle, sıvı akışı/kesme kuvvetleri duyarlılık iyon kanallarının yama-klemp tekniği kullanarak çalışılmıştır. Ancak, sonuçları ve yorumunu veri bağlı olarak Deneysel protokol, hatalı olabilir. Burada, deneysel ve teorik kanıt sıvı akışı ile ilgili hatalar için mevcut ve tahmin etme, önleme ve bu hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar. Junction Ag/AgCl referans elektrot ve banyo sıvı arasında potansiyel değişiklikleri ile 3 M KCl. sıvı akış olabilir dolu bir açık pipet ile ölçüldü sonra sıvı/metal Kavşağı yaklaşık 7 için potansiyel mV vardiya. Diğer taraftan, sıvı akış tarafından indüklenen gerilim shift ölçerek, biz iyonu konsantrasyonu unstirred sınır tabaka içinde tahmini. Statik durumda gerçek iyon konsantrasyonlarının Ag/AgCl referans elektrot veya iyon kanal giriş hücre membran yüzeyinde bitişik olarak yaklaşık % 30 bu akışı koşulu düşük olarak ulaşabilirsiniz. Bir özel 3 M yerleştirerek banyo sıvı ve referans elektrot arasında KCl köprü Kavşağı potansiyel değişen bu sorunu engellemiş olabilir. Ancak, hücre zarının yüzeye bitişik unstirred Katman efektini bu şekilde sabit değil. Burada, biz sıvı akış kaynaklı Yönetmeliğin iyon akıntılarının okurken bir özel tuz-köprü kullanmanın önemini vurgulayan bir açık yama-kelepçe pipet ile unstirred sınır tabaka konsantrasyonlarda gerçek iyon ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu nedenle, dikkate unstirred sınır tabaka iyonu gerçek konsantrasyonları alır, bu roman yaklaşım deneysel tasarım ve iyon kanalları sıvı kesme stres düzenlenmesi ile ilgili veri yorumu yararlı bilgiler sağlayabilir .

Bütün hücre voltaj bağımlı L tipi Ca2 + kanal (VDCCM) akımları enzimatik dağınık sıçan mezenterik arteryel miyositler, yukarıda açıklanan11kaydedildi. Arteryel miyositler bir çözümle Cs-zengin pipet nistatin delikli yapılandırma altında VDCCL11,16ile geçerli akışı kolaylaştırmak için divalent katyon ücretsiz banyo solüsyonu ile diyaliz. Gerilim...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow at JoVE.

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Mechanosensitive iyon kanalları kez yama-kelepçe kaydı ile sıvı akışı/makaslama kuvvet duyarlılık açısından incelenmektedir. Ancak, Deneysel protokol bağlı olarak, sonuç sıvı akışı-düzenlemelerin iyon kanalları üzerinde hatalı olabilir. Burada, önlenmesi ve teorik bir temel ile bu tür hataları düzeltmek için yöntemleri sağlar.

Açık yama-kelepçe pipet ile Unstirred sınır tabaka iyonu konsantrasyonu ölçümü: etkileri kontrol altında sıvı iyon kanalları akışı

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Bu gönderi, elektro-fizyolojik küredeki temel soruların yanıtlatMasına yardımcı olabilir, örneğin iyon kanallarının sadece yönetmeliklerinde sıvı akışı gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, iyon kanallarının akışkan akış düzenlemesi ile ilgili veri yorumu için membran yüzeyinin karıştırılmamış sınır tabakasındaki gerçek iyon konsantrasyonu tahmin edilebilmektedir. Bu prosedüre başlamak için, bir U şekli oluşturmak için ateş cam kılcal tüp viraj.Büyük iyon akımları kaydedilirken kılcal damarın iç çapı seri direncini azaltacak kadar büyük olmalıdır. Daha sonra, üç molar potasyum klorür 100 mililitre agarose üç gram eritin ve 90 ve 100 santigrat derece arasında bir sıcak plaka üzerine yerleştirin. Daha sonra, çözelti içine cam köprü batırarak, potasyum klorür agarose ile köprü yükleyin.Agarose ayarlamak ve sertleştirmek için oda sıcaklığında bir gecede tutun. Ertesi gün, dikkatle sertleştirilmiş agarose tuzu agarose potasyum klorür yüklü cam köprü kazmak. Köprüyü buzdolabında geniş boyunlu üç azılı potasyum klorür şişesinde saklayın.Bu prosedürde, yama kelepçeodasının üzerine, banyo çözeltisi yüklü bir konteyner yerleştirin. Daha sonra, tüpü emerek yama kelepçesi odasını banyo solüsyonuile doldurun. Sıvı akışını durdurmak için, sıvı akışını engellemek için tüpü kabın tarafına doğru kırpın.Daha sonra emme tarafında aynı anda emme durdurmak için tüp klip. Bu sabit kontrol koşulu. Sıvı akış kesme kuvveti uygulamak için, her iki tüpü de konteyner ve emme kenarlarında aynı anda açın.Hücreye sıvı akış kesme kuvveti uygulamadan önce veya uyguladıktan sonra, belirli bir süre içinde sıvı hacmindeki düşüşü ölçerek dakikada mililitre cinsinden akış hızını hesaplayın. Sıvı-metal bağlantı potansiyelindeki değişiklikleri ölçmek için, banyo odası için normal bir fizyolojik tuz tuzu hazırlayın ve agar potasyum klorür köprüsünün yokluğunda ve varlığında karşılaştırın. Daha sonra, pipet ve banyo çözeltileri arasındaki kavşak potansiyelini en aza indirmek için hazneye üç molar potasyum klorür çözeltisi içeren bir yama pipet yerleştirin.Daha sonra voltaj kelepçesi amplifikatörü geçerli kelepçe moduna ayarlayın. İlk dengeleme potansiyelini etkisiz hale aldıktan sonra, akış hızlarını değiştirerek indüklenen voltaj daki değişiklikleri ölçün. Voltajdaki değişikliklerin sıvı-metal bağlantı potansiyelleri olduğunu doğrulamak için, banyo çözeltisi ile referans elektrot arasındaki agarose tuz köprüsünü kullanarak sıvı akışının bağlantı potansiyeli üzerindeki etkisini yeniden inceleyin.Sıvı-metal bağlantı potansiyelindeki değişikliklerin sonuçlarıyla, fonksiyon potansiyel akış hızı ilişkilerini çizin ve bağlantı noktası potansiyel değişiminin supra-sıvı akış hızına göre doyurul değerini tahmin edin. Daha sonra, banyo sıvısındaklorür konsantrasyonu değiştirmek ve kavşak potansiyel klorür konsantrasyonilişkisi çizin. Sıvı oranının sabit ve klorür konsantrasyonunun bitişikteki gümüş-gümüş klorür referans elektrotuna düşmesini önlemek için yeterince yüksek olması gerektiğini unutmayın.İki ilişki eğrisinden, ölçülen kavşak potansiyel kaymasından klorür konsantrasyonundaki değişiklikleri tahmin edin. VDCC-L akımları enzimatik olarak dağılmış sıçan mezenterik arteriyel miyositlerde nystatin delikli yama-kıskaç kaydı ile kaydedildi. Agarose potasyum klorür köprüsü ile referans elektrot ve banyo çözeltileri arasındaki bağlantı potansiyeli en aza indirilebilir ve sıvı akışı VDCC-L akımının gerilimini bağımsız olarak artırmıştır.Ancak, gümüş-gümüş klorür referans elektrot doğrudan banyo sıvısı bağlı olduğunda, bir agarose potasyum klorür köprü olmadan, sıvı akışı varlığında IV ilişki sağa kaymıştır, statik bir durum altında VDCC-L akımları ile karşılaştırıldığında. Agarose köprüsü ile sıçan bazofilik lösemi hücrelerinde kaydedilen Kerr 2.1 akımlarının sıvı akışına bağlı artış, karıştırılmamış tabaka etkisi ile açıklanabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra elektro-fizyoloji üzerine araştırmacıların önünü açmıştır.Yani iyon kanalı akımlarında sıvı akışının düzenlenmesi için. Elektro-kimyasal fenomenler açısından, hücre zarı yüzeyinde karıştırılmamış sınır tabakasında.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Yüksek Kaliteli Fermente Balık Ürününün Hazırlanması

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...