Name: visualizing axonal growth cone collapse and early amyloid &#946; effects in cultured mouse neurons
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃŽÂ² Effects in Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Эта работа частично поддерживается научно-исследовательских грантов от JSP-страницы (KAKENHI 18K 07389), Япония, Такэда научный фонд, Японии и Кобаяси фармацевтическая Co. Ltd., Япония.

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных на Sugitani кампусе университета Тояма и были утверждены Комитетом для животных ухода и использования лабораторных животных на Sugitani кампусе Университет Тояма (A2014INM-1, A201...

Наблюдение ранних явлений в конусы аксональное роста после лечения Aβ1-42 включен протокол, описанные в данном исследовании. Aβ1-42 индуцированной эндоцитоза в конусы аксональное роста в течение 20 мин, и крах конус роста наблюдалось в течение 1 ч лечения. Этот эндоцитоза вероятно опосредов?...

Амилоид β (значения) месторождений находятся в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) и считаются критическим причиной AD1 , нарушить нейрональных сетей, приводит к памяти нарушениями2,,34. Многие клинические наркотиков кандидатов было показано эффективно предотвращать производство амилоид β (значения) или удалить значения месторождений. Однако никто не преуспели в улучшение функции памяти в AD пациентов5. Значения уже сдали на хранение в головном мозге до начала расстройства памяти6; Таким образом уменьшение значения уровней в мозгах пациентов выставке нарушениями памяти могут оказаться неэффективными. Значения осаждения присутствует в доклинической AD больных; Однако эти пациенты редко представляют с нейронной дегенерации и памяти дефицита6. Существует временной лаг между значения осаждения и нарушениями памяти. Таким образом критически важной стратегией для предотвращения AD блокирует значения токсичности, сигнализации на ранних этапах AD, до развития дефицита памяти. Значения осаждения индуцирует аксона дегенерации7,8,9,10,11,12,13, которые могут привести к нарушению Нейронные сети и постоянное нарушение функции памяти. Многие исследования изучили механизмы значения токсичности; к примеру выродились аксоны AD мышей мозг показали увеличились autophagy14. Кальциневрина активации было сообщено как возможный механизм значения индуцированной аксональной дегенерации15; Однако прямой триггера аксональной дегенерации остается неизвестным.
Это исследование фокусируется на крах аксональное окончаний под названием конусы роста. Крах конусы аксональное роста может быть вызвана аксональное роста репелленты, например Семафорин 3A и Эфрины A516,,1718,19,20. Крах как дистрофические аксональное окончаний наблюдались в мозги AD пациентов21,22. Кроме того отказ функционирования конус роста может спровоцировать аксональной дегенерации23. Однако это неизвестно ли значения индуцирует рост конуса краха. Таким образом это исследование представляет Роман протокола соблюдать раннего воздействия значения в культивированный нейронов и исследовать значения индуцированной роста конуса краха.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1119">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">ddY mice</td>
			<td style="width:133px;">SLC</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:539px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eight-well culture slide</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poly D lysine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-19041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Culture medium, Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">house serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>074-00522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Filter with 70 &#181;m mesh size, cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CO2 incubator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>SCA-165DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amyloid &#946;1-42</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope A</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z1&#160;</td>
			<td>Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Plan-Apochromat 20x</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Plan-Apochromat 63x</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>440762-9904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2 IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-tau-1 IgG</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-amyloid &#946; antibody</td>
			<td>IBL</td>
			<td>10379</td>
			<td>clone 11A1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>010-25783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">t-octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-21105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">hot plate</td>
			<td>NISSIN</td>
			<td>NHP-M30N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>1000-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone RTV</td>
			<td>Shin-Etsu</td>
			<td>KE42T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">hand punch</td>
			<td style="width:133px;">Roper Whitney</td>
			<td style="width:109px;">No. XX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescence membrane probe, FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ca2+- and Mg2+-free Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Transfection solution, Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator, Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope B</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">Image software, ImageJ</td>
			<td style="width:133px;">NIH</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:539px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing axonal growth cone collapse and early amyloid &#946; effects in cultured mouse neurons

Амилоид β (значения) вызывает расстройства памяти в Альцгеймера (AD). Хотя терапии было показано, уменьшить значения уровней в мозгах пациентов AD, они не улучшают функции памяти. Поскольку значения агрегатов в головном мозге до появления нарушениями памяти, ориентации значения может быть неэффективным для лечения больных ад, которые уже проявляют дефицита памяти. Таким образом ниже по течению сигналов из-за значения осаждения должен быть заблокирован до развития AD. Значения индуцирует аксональной дегенерации, ведущие к срыву нейрональных сетей и нарушениями памяти. Хотя существует множество исследований о механизмах значения токсичности, источник значения токсичности остается неизвестным. Чтобы помочь определить источник, мы предлагаем новый протокол, использующий микроскопии, Гене transfection и живой клетки, imaging для исследовать ранние изменения, вызванные значения в конусы роста axonal культивировали нейронов. Этот протокол показало, что значения индуцированной Клатрин опосредованный эндоцитоз в аксональное роста шишки следуют краха конус роста, демонстрируя, что ингибирование эндоцитоза предотвращает значения токсичности. Этот протокол будет полезным при изучении ранних эффектов значения и может привести к более эффективной и профилактическое лечение AD.

В этом протоколе Aβ1-42 был инкубировали при 37 ° C для 7 дней перед использованием, потому что инкубации Aβ1-42 необходима для производства токсичных форм27,28,30,35. После этого инкубации агрегированной форм?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃŽÂ² Effects in Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃŽÂ² Effects in Cultured Mouse Neurons (Video) | JoVE

Визуализация аксональное роста конуса коллапса и раннего амилоида β эффекты в нейронах культивировали мыши

Здесь представлен протокол расследовать раннего воздействия амилоид β (значения) в головном мозге. Это показывает, что значения индуцирует Клатрин опосредованный эндоцитоз и распада аксональное роста шишки. Протокол является полезным при изучении раннего воздействия значения на конусы роста axonal и может способствовать предотвращению болезни Альцгеймера.

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований болезни Альцгеймера, особенно ранние события, связанные с крахом конуса роста. Основным преимуществом этого метода является возможность визуализации и анализа конусов аксонального роста сразу после бета-лечения амилоидом. Начните с использования микро-ножниц, чтобы фарш свежеиспеченные кортики головного мозга от эмбриональных мышей день-14 в среде культуры нейронов без антибиотиков.Соберите ткани и центрифугу тканей при 87G в течение трех минут. После центрифугации удалите супернатант и добавьте в гранулы два миллилитра по 0,05%трипсина. Инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию и смешивать, нажав каждые пять минут.Через 15 минут добавьте четыре миллилитров среднего А, чтобы нейтрализовать трипсин, и перемешайте, нажав. Затем центрифуга тканей в 178 раз G в течение трех минут. После удаления супернатанта добавьте раствор ингибитора ДНК и сои трипсина и инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию с смешиванием каждые пять минут, как и раньше.По протяжённое время добавьте четыре миллилитров среднего A.Mix и центрифуги, как раньше. После удаления супернатанта добавьте четыре миллилитров среднего А и тритуратайте ткани полированной пипеткой Pasteur до тех пор, пока не будет обнаружен мусор. Затем отфильтруй тритурированные ткани сеткой размером с 70 микрон.После фильтрации подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте плотность клеток. Pipette 0.8 времен 10 к четвертым клеткам в средств a в каждый колодец скольжения культуры 8-хорошо. Затем инкубируют во влажной атмосфере 10%CO2 при 37 градусах Цельсия.После четырех часов культивирования, изменить культуру среды до среднего B.Чистота нейронов с помощью этого метода составляет около 75%Начните этот анализ по крайней мере за неделю до, открыв свежий флакон коммерчески полученных полнометражных бета 42 и растворения содержимого в стерильной, дистиллированной воды в концентрации 0,5 миллимоляра. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение семи дней, чтобы вызвать агрегацию и токсичность. Подготовка aliquots агрегированных бета 1-42 и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до использования.На четвертый день нейрональной культуры, лечить скважины с 100 микролитров 0,5 микромолара агрегированных бета 1-42 или транспортного средства решения в средней B в течение одного часа, как было продемонстрировано ранее. После того, как час прошел, удалить культуру среды и сразу же исправить нейронов с 4%paraformaldehyde содержащие 4%сахарозы в PBS в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию на горячей пластине. Фиксация является наиболее важным, поскольку поддержание формы конусов роста имеет решающее значение для этого протокола.После фиксации, мыть нейроны три раза с PBS. Затем после удаления камеры, смонтировать нейроны с aqueous монтажа среды. Высушите монтажную среду при четырех градусах по Цельсию в течение двух-четырех дней.Захват всей площади каждой хорошо с 20X сухой объектив цели на перевернутый микроскоп. Захват и анализ всей области в каждой хорошо имеет важное значение для избежания субъективности. Классифицифиция самых длинных невритов каждого нейрона в стадии три или четыре, как аксоны.Axonal конусы роста не хватает lamellipodia или обладающих менее трех филоподии считаются рухнул конусов роста. Бета 1-42 олигомеры, показанные здесь до инкубации, агрегируются после семи дней инкубации при 37 градусах по Цельсию. После лечения агрегированной бета 1-42, иммуностимулятор с антителом для токсичных олигомер бета показывает положительное окрашивание в красном на бета 1-42 обработанных нейронов, но не автомобиль лечение нейронов.Ранние явления, вызванные бета-1-42 лечения были проанализированы после четырех дней в культуре. Выявленные аксоны были подтверждены как таковые положительным иммуностимулированием для аксонального маркера tau-1, показанного красным и отрицательным иммуностимулированием для дендритного маркера, MAP-2, показанного зеленым цветом. После одного часа лечения транспортного средства, рост конусов распространилась lamellipodia и несколько филоподии.Они были определены как здоровые конусы роста. И наоборот, один час бета 1-42 лечения привело к сморщенный рост конусов, которые разработали не lamellipodia или филоподии. Они были определены как рухнувшие конусы роста.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы исправить клетки с 4%PFA и 4% сахарозы при 37 градусов по Цельсию, чтобы мой-nor-idge этот протокол фиксации в лучшем случае. Следуя этому протоколу, другой метод, такой как живая клеточная визуализация и трансфекция генов, может быть выполнен, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, когда и как конусы роста аксона рухнули и как рухнувшие конусы роста восстанавливаются.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development (Video) | JoVE

Механические Манипуляция Нейроны для управления аксонального развития

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons (Video) | JoVE

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses (Video) | JoVE

Transretinal записи ЭРГ от мыши Retina: палочек и колбочек Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons (Video) | JoVE

Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons (Video) | JoVE

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining (Video) | JoVE

Визуализация Эффекты положительного ранний опыт, тактильная стимуляция, на дендритных морфологии и синаптические связи с Гольджи-Кокса Окрашивание

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons (Video) | JoVE

В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo (Video) | JoVE

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus (Video) | JoVE

Стереотаксическая Настой олигомерных бета-амилоида в гиппокампе мыши

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes (Video) | JoVE

Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...