Name: use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

De auteurs bedank Scott Lute voor de analytische ondersteuning die zij verstrekt. Gedeeltelijke interne financiering en steun voor dit werk werd verzorgd door de CDER kritieke pad programma (CA #1-13). Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door een benoeming tot de stage/deelname onderzoeksprogramma op de Office van de producten van de biotechnologie, de Amerikaanse Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs door middel van een Interagency overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en FDA.

<ol>
	<li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+therapeutics:+history+and+future.">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).</li><li>Jakobovits, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+fully+human+antibodies+by+transgenic+mice.">Production of fully human antibodies by transgenic mice.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).</li><li>Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Transgenic+Animals+in+Biotechnology:+Prospects+and+Problems.">Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems.</a> Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).</li><li>Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+therapeutics+from+CHO+cells-20+years+and+counting.">Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting.</a> Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).</li><li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+media+and+antifoam+selection+on+monoclonal+antibody+production+and+quality+using+a+high+throughput+micro-bioreactor+system.">Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system.</a> Biotechnology Progress. , (2017).</li><li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies.">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).</li><li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors.">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li><li>Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+CHO+cell+culture+medium+formulation:+simultaneous+substitution+of+glucose+and+glutamine.">Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine.</a> Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).</li><li>Selvarasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+silico+modeling+and+metabolomics+analysis+to+characterize+fed-batch+CHO+cell+culture.">Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).</li><li>Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C., Hu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Bioprocess Engineering. , 97-126 (2012).</li><li>McKeehan, W. M. K., Ham, R., Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. , 223-243 (1981).</li><li>Jordan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+improvement+by+rigorous+shuffling+of+components+using+media+blending.">Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending.</a> Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).</li><li>Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+statistical+design+to+the+optimization+of+culture+medium+for+recombinant+interferon-gamma+production+by+Chinese+hamster+ovary+cells.">Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).</li><li>Liu, C. -. H., Chu, I. M., Hwang, S. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factorial+designs+combined+with+the+steepest+ascent+method+to+optimize+serum-free+media+for+CHO+cells.">Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).</li><li>Parampalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developement+of+serum-free+media+in+CHO-DG44+cells+using+a+central+composite+statistical+design.">Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design.</a> Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).</li><li>Hsu, W. -. T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microscale+bioreactor+system:+a+representative+scale-down+model+for+bench-top+bioreactors.">Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors.</a> Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).</li><li>Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-throughput+mini-bioreactor+system+for+systematic+scale-down+modeling,+process+characterization,+and+control+strategy+development.">Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development.</a> Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).</li><li>Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-scale+bioprocessing+systems+for+highly+parallel+animal+cell+cultures.">Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures.</a> Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).</li><li>Legmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+high-throughput+scale-down+model+of+monoclonal+antibody+production+in+CHO+cells.">A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).</li><li>Sch&#228;pper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+microbioreactors+in+fermentation+process+development:+a+review.">Application of microbioreactors in fermentation process development: a review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).</li><li>Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+microfluidic+microbioreactor+technology+for+high-throughput+submerged+microbiological+cultivation.">Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation.</a> Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).</li><li>Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+miniaturized+bioreactors+for+cell+culture+process+development:+Reproducibility,+scalability,+and+control.">High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control.</a> Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TAP+Ambr+250+disposable+bioreactors,+as+a+reliable+scale-down+model+for+biologics+process+development.">Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development.</a> Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).</li><li>Delouvroy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+advanced+micro-scale+bioreactor+(ambr&#8482;)+as+a+highthroughput+tool+for+cell+culture+process+development.">Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr&#8482;) as a highthroughput tool for cell culture process development.</a> BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).</li><li>Kelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+performance+of+semi-continuous+cell+culture+in+an+ambr15+microbioreactor+using+dynamic+flux+balance+modeling.">Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling.</a> Biotechnology Progress. , (2017).</li></ol>

Disclaimer: Deze publicatie weerspiegelt de mening van de auteur en moet niet worden opgevat om FDA weergaven of beleid te vertegenwoordigen.

Het geautomatiseerde micro bioreactor systeem goed functioneert en efficiënt impliceert de tijdige uitvoering van meerdere geautomatiseerde stappen. Een van de belangrijkste onderdelen van de exploitatie van het systeem is de programmering van de software. Als er een fout optreedt tijdens het schrijven van het programma, zal er ernstige fouten in het experiment dat leiden onverwachte wijzigingen in het proces tot kan, voederen van strategie, bemonsteringsstrategie of kwaliteit van het eindproduct die de bevindingen van de studie vervalt mogelijk. Een ander belangrijk aspect van het runnen van het systeem is te plaatsen en draai de plaat klem correct om te zorgen voor een goede controle van de. De meest voorkomende aanwijzing dat de plaat klem ongelijk heeft aangescherpt is onverwachte variaties in metingen voor vaartuigen 1, 6, 7 en 12 (hoek reactor schepen). Over het geheel genomen geeft instabiliteit een versoepeling van de pakkingen in de zuigleiding van gas in de klem platen. Dit scenario kan belemmeren de instelpunt bereiken. Een andere gemeenschappelijke valkuil te vermijden wanneer een experiment starten de cellen laat zitten te lang tijdens de inoculatie stap, waardoor ze te regelen. Minder tijd bij de cellen zitten, schaadt de minder kans er is dat geleidelijk lager entmateriaal cel graven chronologisch worden toegevoegd aan de reactor vaartuigen die aanzienlijke vooroordeel dat onbewust ertoe kunnen bewegen studieresultaten. Het is beter om te enten in meerdere fasen, d.w.z. Inoculeer elke cultuur station na elkaar met pauze stappen tussenin zodat de cellen zitten niet in de inoculatie plaat langer dan 15 minuten.
Betreffende dagelijks gebruik, behoud van de steriliteit is van vitaal belang. Hoewel het systeem in een biologische veiligheidskast, is steriliteit niet gegarandeerd als gevolg van frequente verkeer in en uit de motorkap. Daarom moet alles wat er in de kap met 70% IPA worden gespoten. Ten tweede, het is essentieel om ervoor te zorgen dat minimale schuimvorming tijdens de cultuur optreedt; media kunnen verstoppen vergassing en uitlaat lijnen, wat leidt tot schade van de klem plaat en zelfs kernonderdelen hieronder. Preventieve anti-schuim toevoeging stappen zijn essentieel in elk micro bioreactor programma ontwerp. In het geval van een "schuim uit" het zou zinvol zijn te volgen van de fabrikanten protocol reiniging en kan voorkomen dat permanente schade van klem platen. Als alternatief kan gebruik van vaartuigen van niet-sparged zinvol zijn voor lagere cel dichtheid of wanneer uitgevoerd in de batchmodus, omdat hogere oppervlakte volumeverhouding in staat efficiënt zuurstof zelfs met het ontbreken van een sparger stelt. Vaartuigen van niet-sparged kunnen niet echter nuttig voor hoge dichtheid of perfusie celculturen zoals de hoofd ruimte niet volstaat om gelijke tred houden met de toenemende consumptie van zuurstof culturen.
Er zijn tal van voordelen geboden door het microbioreactor systeem, omdat hierdoor meerdere gecontroleerde culturen in parallel op kleine schaal met meer controle dan schudden kolven moeten worden uitgevoerd. 17 daarom, het systeem vergemakkelijkt de uitvoering van studies, DoEs, hoge doorvoer kloon studies en studies van de transfectie screening. Geautomatiseerde vloeibare behandeling vermindert ook analist-naar-analist variabiliteit terwijl het tegelijkertijd het minimaliseren van vervelende en tijdrovende arbeid voor geschoold personeel. Hoewel er verschillende voordelen aan het systeem zijn, zijn er verscheidene belangrijke nadelen die u moeten overwegen. Ten eerste, het volume van een cultuur van 15 mL aanzienlijk beperkt in-process bemonsterings- en materiaal van de laatste oogst- en meerdere alternatieve kleinschalige bioreactoren (tot 500 mL) recent beschikbaar zijn gekomen. Een recente vooruitgang op het systeem is de integratie van de geautomatiseerde microscale bioreactor met de BioProfile FLEX 2 analyzer uit Nova biomedische, die de in proces-sampling probleem matigt doordat monstervolume p.a. cel dichtheid en voedingsstoffen . Voordelen kunnen zijn snelle setup en vrijwel geen schoonmaak leidt tot exploitatiebesparingen, maar de kosten van de beschikbare eenheden te worden overwogen voor de lange termijn projecten, als het kan duurder zijn om te kopen van de eenheden dan de herbruikbare conventionele systemen.
De methode die in dit Groenboek besproken is vooral geschikt voor de cultuur van de cel van batch-modus, maar afhankelijk van de behoeften van de gebruiker kan worden gewijzigd. Elk station cultuur heeft onafhankelijke controle van de temperatuur, terwijl Ken en pH kunnen worden gevarieerd op het niveau van individuele reactor vaartuigen. Sartorius biedt ook DoE planningssoftware speciaal ontworpen voor het toestaan van experimenten te worden aangepast voor de micro bioreactor systeem. Grote schaal DoE studies met de nieuwe DoE-software geleverd door de fabrikant kunnen helpen in de media en aanvulling van optimalisatie. Hoewel hier niet gebruikt, kunt het systeem van de microbioreactor ook fed-batch studies. Het systeem is nog niet geoptimaliseerd voor perfusie celculturen. Echter zijn er beperkte onderzoeken en proeven om na te bootsen perfusie cel cultuur operatie in het huidige systeem van de micro bioreactor. 26 deze methode kan worden aangepast voor het nabootsen van hoge dichtheid perfusie culturen door cel regelen. Door het variëren van de hoogte waaraan het pipet wordt ingevoegd in de reactor en door het optimaliseren van beslechting tijd, kunnen de media worden weggenomen en aangevuld naar spiegel overvloed modus van cultuur. Er zijn nieuwe producten in deze ontwikkeling gebied dat beter dan het systeem hier gepresenteerd werkt als perfusie modus van cultuur is gewenst.
Kortom, deze studie toont het gebruik van geautomatiseerde micro-bioreactoren en bijbehorende analytische voor CHO cel cultuur operaties te produceren en te karakteriseren van een model IgG1 Monoclonal antilichaam. Het benadrukt de rol van de kleine schaal micro-bioreactoren in Bioprocestechnologie productie en hun impact op de ontwikkeling van cel cultuur en media screening. Hoewel er vele voordelen aan het gebruik van een systeem van geautomatiseerde kleinschalige, om het volledig realiseren hun voordelen verwerken begrip en analytische karakterisering is absoluut noodzakelijk. Deze studie biedt de gebruiker met een richtsnoer voor het gebruik van een systeem van geautomatiseerde microscale reactor, die kan worden ontwikkeld en verbeterd per individuele onderzoeksbehoeften.

Monoclonal antilichamen (mAbs) werden voor het eerst geproduceerd in muis hybridoma cellen in 19751. Sindsdien, heeft een toename van de ontwikkeling van de productie van recombinante eiwitten plaatsgevonden te humaniseren mAbs verhoging in vivo veiligheid en werkzaamheid2,3,4. Allermeest naar de productieprocessen van recombinante eiwitten in Chinese Hamster Ovary (CHO) cellen voor het gemak waarmee ze aangepast voor serum vrije media, hun vermogen worden kunnen om proteïnen met gelijkaardige posttranslationele modificaties aan die van een aangeboren menselijke dienst eiwitten en hun betrouwbaarheid zoals5,6van de cellen van de gastheer.
Vraag groeit product te leveren sneller en voor grotere patiënt populaties met constante kwaliteit. Naast de economische voordelen toeneemt het repertoire van ziekten behandeld door mAbs, waarin nu auto-immune ziekten, na transplantatie complicaties, artritis en kanker7. Gemiddelde opbrengst voor moderne commerciële mAb productielijnen zijn meestal in het bereik van 5-6 g/L en blijven stijgen van5. Dit is ten dele bereikt door CHO cel engineering en verbeterde productielijn screening met behulp van hoge-doorvoer bioreactoren8. Echter zijn de meeste stijgingen van de productie van eiwitten toegeschreven voor het verwerken van verbeteringen, met inbegrip van vorderingen in media optimalisatie, cel kweekomstandigheden, en verbeterde strategieën7,9,10te voeden. Voedingsprofielen suppletie is essentieel niet alleen voor de juiste celgroei maar ook voor efficiënte productie van hoge kwaliteit proteïne. Bovendien vereisen de cellen de stoichiometrische toevoeging van specifieke nutriënten, vereisen extra begrip voor het voederen van strategie optimalisatie6,11. Traditionele optimalisatie methoden omvatten individuele media component titratie en media mengen met mengsel ontwerpen. Deze methoden zijn echter tijdrovend, arbeid-intensieve, en risico's die samenhangen met menselijke fout12,13te betrekken.
Optimalisatie Mediastudies vertrouwde eerder op schudden kolven en 1-2 L bioreactoren die onbetaalbaar in termen van grondstoffen en menselijk kapitaal wellicht. Microplates zijn ook gebruikt, maar deze methoden bieden beperkte schaalbaarheid. Bovendien kunnen nog hiervoor meerdere tijdrovende loopt dat introduceren-charges-variabiliteit die de Kredietkwaliteitsbeoordeling variabiliteit veroorzaakt door media samenstelling en voeding strategie14,15,16 verduistert. Dus de noodzaak voor hoge-doorvoer en zeer consistente parallelle bioreactor systemen naar voren gekomen17,18,19,20.
Met de aanzienlijke kosten die zijn gekoppeld aan de werking van traditionele bank-schaal bioreactoren (0.5-5 L), microbioreactors een kostenbesparende alternatief bieden voor de beoordeling van de productie van biologisch afgeleide geneesmiddelen. 21 bench-schaal geroerd-tank bioreactoren zijn betrouwbaar en dichte gegevens via sensorische matrices verstrekken. Controle feedbacksystemen toestaan voor gemakkelijk toezicht op werking. Echter, de montage, kalibratie, schoonmaak, kosten van arbeid, substraat kosten en sterilisatie eisen maken Bank-schaal geroerd-tank bioreactoren duur en arbeidsintensief te bedienen. Shake kolven en microtiterplaat platen verwijderen een aantal van de kosten en problemen in verband met de grotere schaal bioreactoren arbeid, maar deze alternatieven bieden zwakke controle over de verwerking van voorwaarden en produceren van lage dichtheid gegevens, vaak alleen eindpunt metingen. 22
U kunt ook microbioreactors gebruiken een klein volume van het werken om een schaal-downbenadering cellijn en upstream procesontwikkeling. De omvang van microbioreactor experimenten kan leiden tot aanzienlijke afname lopende kosten door lager gebruik van macht, substraat, arbeid, ruimte en hulpprogramma's. 23 Microbioreactors zijn zoals shake kolven in dat ze gemakkelijk zijn te hanteren als gevolg van hun grootte, maar zij de voordelen van traditionele bank-schaal bioreactoren via hun online feedback controle van pH, temperatuur behouden, zuurstof, en zuur/base opgeloste consumptie, alsmede hun realtimegegevens productie van kwaliteitsparameters waaronder uit gassamenstelling. Microbioreactor schaal zorgt voor high-throughput screening vermogen, die nuttig voor de selectie en proces ontwikkeling kloon zijn kan. 24
De geavanceerde Microscale Bioreactor heeft aangetoond dat een effectief instrument voor de karakterisering van het proces van CHO cel cultuur en ontwikkeling18. Hierin een geautomatiseerd ambr15 systeem, bestaande uit 48 microbioreactors parallel, die hebben aangetoond dat vergelijkbaar zijn met klassieke geroerd tank reactoren in schaal studies,25 werd gebruikt op een wijze analoog aan voorafgaande werk dat de media geoptimaliseerd samenstelling voor een cellijn van CHO-DG44 produceren een model chimeer IgG16. De gevolgen van verschillende media voorwaarden voor groei en titer werden vergeleken en geanalyseerd. In deze paper is een algemene richtlijn uit te voeren van het microbioreactor systeem en de analyse van monsters van de ruwe media gepresenteerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2804</td>
			<td>automated micro bioreactor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2B80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vi-Cell XR cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EX-CELL&#160;Antifoam (gamma irradiated)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59920C-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL glass Spinner Flasks</td>
			<td>Corning Life Sciences Glass</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile)</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>376814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioProfile FLEX Analyzer</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>49418</td>
			<td>Nutrient Analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Octet Red 96</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>99-0042</td>
			<td>Protein A Biosensor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>18-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells

Geautomatiseerde microscale bioreactoren (15 mL) kunnen hierbij een nuttig instrument voor cel cultuur ingenieurs. Ze vergemakkelijken de gelijktijdige uitvoering van een breed scala aan experimentele omstandigheden terwijl het minimaliseren van de potentiële variabiliteit van het proces. Toepassingen van deze benadering zijn onder andere: kloon screening, temperatuur en pH verschuivingen, media en supplement optimalisatie. Bovendien zijn de kleine reactor volumes dat bevorderlijk is voor grote Design of Experiments, die een brede waaier van voorwaarden te onderzoeken. Hierdoor upstream processen aanzienlijk worden geoptimaliseerd voor schaal-up waar experimenten is meer reikwijdte beperkt door tijd en economische beperkingen. Geautomatiseerde microscale bioreactor systems bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele kleinschalige cel cultuur eenheden, zoals schok kolven of spinner kolven. Echter tijdens de pilot schaal moet proces ontwikkeling aanzienlijk worden gezorgd om ervoor te zorgen dat deze voordelen worden gerealiseerd. Wanneer uitvoert met zorg, het systeem kunt inschakelen hoog niveau automatisering, DOE's met een hoger aantal variabelen uitgevoerd kan worden geprogrammeerd en bemonsteringstijdstip kan verminderen wanneer geïntegreerd met een voedende analyzer of cel teller. Integratie van de deskundige afkomstige heuristiek gepresenteerd hier, met de huidige geautomatiseerde microscale bioreactor experimenten kunt minimaliseren gemeenschappelijke valkuilen die zinvolle resultaten belemmeren. In het uiterste, kan overtreding de beginselen uit hier leiden tot schade van de apparatuur die dure reparaties vereist. Bovendien hebben de systemen microbioreactor kleine cultuur volumes karakterisering van cel kweekomstandigheden bemoeilijken. Het aantal en het bedrag van genomen monsters in-proces in de batch modus cultuur is beperkt als operationele volumes kunnen niet lager zijn dan 10 mL. Deze methode zal bespreken de voordelen en nadelen van microscale bioreactor systemen.

Monitoring van kritische procesparameters en andere cel cultuur parameters gedurende de celculturen operatie is een belangrijk aspect in bioprocessing. De teller van de cel en nutriënten analyzer werden gebruikt om het kwantificeren van vijf kenmerken die kenmerkend zijn voor celgroei, nutriënt verbruik en bijproduct vorming. De cel graven zijn dagelijks verkregen voor alle cultuuromstandigheden. De gemiddelde levensvatbare cellen dichtheden en viabilities zijn zoals te zien in Figuur 3 samen met hun ±1 SD-interval. De voedingsstoffen en bijproduct profielen worden ook weergegeven met het interval van de SD ±1 via de stationaire fase van de culturen. De helling van dit profiel vertegenwoordigt de gemiddelde glucose en glutamine consumptie, en lactaat productie, tarieven. Over het geheel genomen, deze resultaten tonen aan dat de haalbaarheid van het toezicht op deze kenmerken in het systeem van de microbioreactor; Naast de mogelijkheid van het microbioreactor-systeem om deze parameters binnen een krappe bereik.
De totale productiviteit van de celculturen werd gekwantificeerd aan de hand van een proteinA biosensor systeem nadat de geoogste cel voedingsbodems werd aangenomen door een 0,22 micron PVDF filter. De specifieke productiviteit per cel varieerden van 0.87 pg/cel-d tot 1,15 pg/cel-d zoals te zien in Figuur 4. Gebaseerd op deze resultaten een breed scala van voorwaarden kan worden onderzocht om te selecteren van media samenstelling en voederen van strategieën die maximaliseren van de hoeveelheid eiwit geproduceerd voor een minimale investering in experimentele procedures.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> Figuur 1 : Lay-out van het systeem van de microbioreactor met 4 cultuur stations (CS) met 12 reactor schepen elke. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> Figuur 2 : Voorbeeld monster plaat set-up voor een fundamentele kwantificatie met regeneratie experiment op het systeem van de biosensor proteinA. rij 1 (rode "R") is gereserveerd voor referentiemonster (d.w.z. matrix afwezig analyt); rij 2 (Aquamarijn) is een set van normen (concentraties zijn in µg/mL); rijen 3 en 4 (oranje) bestaan uit sets van lage en hoge positieve controles ("PL" en "PH", respectievelijk); rijen 5 t/m 10 (paars) bevatten onbekende monsters; rijen 11 en 12 (grijs) zijn programma-standaard posities voor regeneratie ("R") en neutralisatie ("N") buffers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> Figuur 3 : een) gemiddelde dichtheid en levensvatbaarheid profielen van levensvatbare cellen boven de leeftijd van een partij. ± 1 SD wordt ook weergegeven om aan te geven de strakke controle van celgroei in de microbioreactor systemen. b) gemiddelde voedingsprofiel voor glucose en glutamine, evenals het gemiddelde bijproduct profiel voor lactaat. ± 1 SD wordt ook weergegeven om aan te geven van strakke controle over de samenstelling van de media in de microbioreactor systemen. (N = 3, alle voorwaarden zijn uitgevoerd in drievoud). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> Figuur 4 : Vertegenwoordiger Boxplot van gemiddelde specifieke productiviteit van de verschillende media voorwaarden. (N = 3, alle voorwaarden werden uitgevoerd in drievoud) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige werking van 48 parallelle celculturen onder uiteenlopende omstandigheden in een systeem van microbioreactor wordt gepresenteerd. Proces van de cultuur van de cel, oogst en latere antilichaam titer analyse worden beschreven.

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele van de belangrijke vragen op het gebied van Bio proces productie met betrekking tot aspecten van cellijn karakterisering en bemiddelen en procesoptimalisatie. Voordelen van deze techniek zijn dat het meer controle biedt in schudkolven en automatisering en de prestaties van grote aantallen kleinschalige studies voor snelle gegevensgeneratie mogelijk maakt. Het demonstreren van de procedure zal zijn, Sai Rashmika Velugula en Casey Kohnhorst, research fellows in mijn laboratorium.Begin met het onderdompelen van een voorraad verachtelijke van drie keer 10 tot de zevende show cellen per milliliter van bevriezing medium in een 37 graden Celsius waterbad. Wanneer slechts een klein stukje ijs overblijft, zachtjes pipet de snel ontdooide cel suspensie een paar keer en breng een milliliter cellen in een steriele 125 milliliter geventileerde shake kolf met 29 milliliter van OptiCHO medium. Plaats de kolf in een celcultuur incubator op 37 graden Celsius en 8% CO2 met schudden 130 RPM.Subculturing van de cellen na 72 uur in 100 milliliter van verse 37 graden Celsius medium in een 125 milliliter spinner fles voor nog eens 72 uur incubatie bij 37 graden Celsius en 8% CO2 met roeren bij 70 RPM. Op de derde dag van de subcultuur, voeg vers voorverwarmd medium aan de spinnerkolf om de cellen te handhaven op een ten minste 90%levensvatbaarheid voor een laatste 24 uur cultuur. De volgende ochtend klikt u op het pictogram voor extern bureaublad en klikt u op verbinding maken.Wanneer het externe bureaublad is aangesloten, opent u de software van de celteller en installeert u een nieuw Reagent Pak. Leeg vervolgens het Trypan Blue-afval en maak het systeem klaar. Minimaliseer vervolgens de externe verbinding en open de software voor microbioreactoren met behulp van een bestaand experiment als sjabloon om een nieuw experiment te maken.Definieer voor het starten van een run de platen die tijdens de run in de nabootsingssectie van de software worden gebruikt en plaats 12 steriele kweekvaten in elk kweekstation. Plaats autoclaved klem platen op de top van de vaten en plaats de roerplaten op de top van de klem platen ervoor te zorgen dat elke pin stevig wordt geplaatst. Zet vervolgens de klemplaten vast met de meegeleverde schroeven en nobs.Om het systeem op te starten scan je de barcode die bij elk kweekschip wordt geleverd. Het systeem zal de aanwezigheid van de juiste vaartuigen initialiseren en controleren. Stel de temperatuurregeling in op 37 graden Celsius en het roeren op 1.000 RPM en zet de opgeloste zuurstof PH-monitor aan.Voer vervolgens het medium oplaadprogramma uit. Wanneer al het medium is geladen, worden 35 microliter EX-CELL Antifoam toegevoegd van de Antifoamplaat aan de kweekvaten. Na 30 minuten beginnen met het opnemen van de opgeloste zuurstof en PH binnen de kweekmedia, waardoor de opgeloste zuurstof een setpoint van 50% bereikt Na het opgeloste zuurstofevenwicht, schakel je de toevoegingen van de achtergrondbasis in om een PH-setpoint van 7.1 te bereiken voor alle kweekvaten.De volgende ochtend voert u de onderbroken PH-stap uit en brengt u de volledige inhoud van de spinnerkolf over in een steriele conische buis van 250 milliliter voor centrifugatie. Resuspend de pellet in voldoende vers medium dat de uiteindelijke dichtheid zal een keer 10 tot de zesde CHO cellen per milliliter na het toevoegen van de entmateriaal aan de kweekvaten en voeg de zwevende cellen in de juiste putten van een steriele deksel 24 put plaat. Voeg drie milliliter inoculum aan elke put en plaats de entmateriaal plaat op de aangewezen bureau in de kap.Laat vervolgens de kweekschepen minstens een uur in evenwicht komen en start de vijf EX-CELL-tellingstap in het programma. Voor dagelijkse nutriënten- en metabolietanalyse op dag twee worden de platen van de monsterbuishouder op de aangewezen dekken geplaatst en open microcentrifugebuizen in de juiste houders geladen. Plaats vervolgens de monsters in de analyzerlade om de voedingsanalyse uit te voeren.Als u de run wilt beëindigen, schakelt u eerst de temperatuurregeling uit, gevolgd door de agitatie. Stop de opgeloste zuurstof PH-controle en achtergrondbasis toevoegingen, alle andere controles, en het systeem monitor. Schroef de klem en roerplaten los, verwijder de kweekvaten en schroef de droogplaten in het kweekstation.Voer vervolgens de droogcyclus van twee uur uit op het programma;klik op stop in de bioreactorsoftware zodra de droogcyclus is voltooid. Om de cellen te oogsten brengen ze de celkweekvloeistof uit de reactorvaten over in overeenkomstige conische buizen voor centrifugatie en filteren ze de supernatants door steriele 0,22 micrometer PVDH-filters. Breng vervolgens een milliliter van elke steriele celcultuur supernatant over in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor negatieve opslag van 20 graden Celsius tot titeranalyse.Om de IgG-titers van de monsters te meten, schakelt u eerst het biosensorsysteem voor eiwithulp in. Nadat de lamp ten minste een uur is opgewarmd, laat u de monsters minstens 30 minuten in evenwicht brengen met kamertemperatuur en één eiwitsteunpunt per monster in vers celmedium vooraf. Stel vervolgens de temperatuur van de plaat in op 26 graden Celsius.Laad de monsters in het systeem en voer de test uit met behulp van de standaard gevoeligheidstest met regeneratie in de software voor gegevensverwerving. Met behulp van de geïntegreerde celteller kunnen de gemiddelde levensvatbare celdichtheden en viabilities dagelijks worden verkregen voor alle cultuuromstandigheden. Met behulp van de nutriënten analyzer kunnen we ook de voedings- en bijproductprofielen verkrijgen die de haalbaarheid aantonen van het monitoren van deze eigenschappen in het microbioreactorsysteem.Verder kan de totale productiviteit van de celculturen onder de verschillende cultuuromstandigheden van belang worden gekwantificeerd met behulp van het eiwithulpbiosensorsysteem zoals aangetoond. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat het protocol alleen werkt als de programmering correct wordt uitgevoerd; zorgen voor tijdige uitvoering van protocolstappen met minimale fouten. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals:vloeibare chromatografie, massaspectrometrie en multi-angle lichtverstrooiing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de fysische en chemische eigenschappen van het vervaardigde product.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Teelt van zoogdiercellen met behulp van een Single-use Pneumatische bioreactorsysteem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...