Name: use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier Scott Lute pour l’appui analytique, qu'ils ont fourni. Partielle de financement interne et le soutien pour ce travail a été fourni par le programme du chemin critique CDER (CA #1-13). Ce projet a été soutenu en partie par une nomination pour le programme de Participation de stage/recherche au Bureau des produits de la biotechnologie, US Food and Drug Administration, administré par l’Institut d’Oak Ridge, aux sciences et à travers un accord interinstitutions entre le U.S. Department of Energy et de la FDA.

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AVERTISSEMENT : Cette publication reflète les opinions de l’auteur et ne doit pas être interprétée pour représenter les vues ou les politiques de la FDA.

Fonctionnant avec le système automatisé de bioréacteur micro correctement et efficacement implique l’exécution en temps opportun de multiples étapes automatisées. Une des parties plus importantes du fonctionnement du système est le logiciel de programmation. S’il y a une erreur lors de l’écriture du programme, il y aura des erreurs graves dans l’expérience qui peut provoquer des changements inattendus dans le processus, stratégie, stratégie d’échantillonnage ou qualité du produit final qui peut infirmer les conclusions de l’étude de l’alimentation. Un autre aspect important du fonctionnement du système est de placer et serrer la bride de plaque correctement afin d’assurer un contrôle adéquat. L’indication plus courante que la plaque de fixation a été resserrée inégalement est inattendues variations mesures bateaux de 1, 6, 7 et 12 (cuves de réacteur de coin). Dans l’ensemble instabilité indique un relâchement des joints sur les lignes d’arrivée de gaz dans les flasques. Ce scénario peut gêner pour atteindre le point de consigne. Un autre écueil commun afin d’éviter quand commencer une expérience est de laisser les cellules s’asseoir trop longtemps au cours de l’étape de l’inoculation, obligeant à s’installer. Le moins de temps que les cellules passent séance, le moins de chance il n’y a que progressivement plus faible nombre de cellules d’inoculum est ajouté par ordre chronologique pour les cuves de réacteur qui peuvent induire des biais importants qu’involontairement nuit aux résultats de l’étude. Il est préférable d’ensemencer en plusieurs étapes, c'est-à-dire ensemencer chaque station piscicole l’un après l’autre avec pas de pause entre les deux, donc les cellules ne sont pas assis dans la plaque de l’inoculation pour plus de 15 minutes.
Concernant l’utilisation au quotidien, maintien de la stérilité est vital. Bien que le système soit dans une armoire de sécurité biologique, la stérilité n’est pas garantie en raison de fréquents mouvements dans et hors de la hotte. Par conséquent, tout ce qui se passe dans la hotte doit être vaporisé avec 70 % d’isopropanol. Deuxièmement, il est essentiel de veiller à ce qu’écumant minimale se produit au cours de la culture ; médias peuvent obstruer le gazage et épuiser les lignes, menant aux dommages du flasque et même des éléments de base ci-dessous. Mesures préventives anti-mousse addition sont critiques dans n’importe quelle conception du programme micro bioréacteur. Dans le cas d’une mousse « out », il serait bénéfique de suivre les protocole de nettoyage des fabricants et peut prévenir des dommages permanents des flasques. Alternativement, utiliser des navires non-barboté peut être bénéfique pour les plus faibles densités cellulaires ou lors de l’exécution en mode batch comme surface supérieur à rapport volumétrique permet à oxygène efficace même avec le manque d’un camion-citerne. Toutefois, les navires non-barboté peuvent s’avérer utiles pour des cultures cellulaires haute densité ou perfusion comme l’espace de tête ne suffit pas à rattraper les cultures en croissance de la consommation d’oxygène.
Il y a nombreux avantages fournis par le système de MICROBIOREACTEUR, car elle permet de multiples cultures contrôlées être exécuté en parallèle à une petite échelle avec un plus grand contrôle que secouer les flacons. 17 c’est pourquoi, le système facilite l’exécution des études, fait, clone haut débit et des études de transfection de dépistage. Manipulation de liquides automatique réduit également analyste-à-analyste variabilité tout en réduisant simultanément un travail fastidieux et beaucoup de temps pour personnel qualifié. Bien qu’il y a plusieurs avantages pour le système, il y a plusieurs inconvénients essentiels qui devraient être considérés. Tout d’abord, un volume de culture de 15 mL limite considérablement dans le processus d’échantillonnage et de matériel de récolte finale bioréacteurs à plusieurs alternatives à petite échelle (jusqu'à 500 mL) sont récemment devenus disponibles. Une récente promotion au système est l’intégration du bioréacteur microscale automatisé avec l’analyseur BioProfile FLEX 2 de Nova biomédicale, qui atténue le problème de processus d’échantillonnage en réduisant le volume de l’échantillon pour analyse de densité et d’éléments nutritifs des cellules . Avantages peuvent inclure la configuration rapide et pratiquement aucun nettoyage conduisant à des économies opérationnelles, mais le coût des unités jetables doit être considéré pour les projets à long terme comme il peut être plus coûteux d’acheter les parts que les systèmes conventionnels réutilisables.
La méthode décrite dans cet article est principalement adaptée pour la culture cellulaire mode traitement par lots, mais peut être modifiée selon les besoins de l’utilisateur. Chaque station piscicole a un contrôle indépendant de la température, tandis que l’et le pH peuvent varier au niveau des cuves de réacteur individuels. Sartorius propose également DoE logiciel spécialement conçu pour permettre des expériences de planification doit être adaptée pour le système de micro bioréacteur. Études de DoE à grande échelle en utilisant le nouveau logiciel DoE fourni par le fabricant peuvent aider dans les médias et supplément d’optimisation. Bien que ne pas utilisé ici, le système MICROBIOREACTEUR permet également aux études fed-batch. Le système n’a pas encore été optimisé pour les cultures de cellules de perfusion. Cependant, il y a des études limitées et essais pour imiter les opération de culture de cellule perfusion dans le système actuel de bioréacteur micro. 26 cette méthode peut être modifiée pour imiter les cultures de perfusion de haute densité par la cellule de décantation. En faisant varier la hauteur à laquelle la pipette est insérée dans le réacteur et en optimisant le temps, les médias peuvent être enlevés et réapprovisionnés en mode miroir profusion de culture. Il existe des nouveaux produits dans ce domaine en développement qui fonctionne mieux que le système présenté ici si vous désirez mode de perfusion de la culture.
En résumé, cette étude illustre l’utilisation de micro-bioréacteurs automatisés et associés analytique pour les opérations de culture de cellules CHO à produire et à caractériser un anticorps Monoclonal IgG1 de modèle. Il met l’accent sur le rôle à petite échelle micro-bioréacteurs jouent dans la fabrication de bioprocédés et leur impact sur le développement de la culture des cellules et contrôle des médias. Bien qu’il y a plusieurs avantages à utiliser un système automatisé à petite échelle, afin de réaliser pleinement leurs prestations de compréhension des processus et caractérisation analytique est impérative. Cette étude fournit à l’utilisateur avec une ligne directrice pour utiliser un système de réacteur microscale automatisé, qui peut être développé et amélioré par les besoins de recherche individuelles.

Anticorps monoclonaux (ACM) ont été tout d’abord produites en cellules d’hybridome de souris en 19751. Depuis lors, une augmentation dans le développement de la production de protéines recombinantes a eu lieu à humaniser le mAbs augmentation in vivo la sécurité et l’efficacité2,3,4. La plupart des processus de production des protéines recombinantes emploient des cellules ovariennes de Hamster chinois (CHO) pour la facilité avec laquelle ils peuvent être adaptés aux médias libres sériques, leur capacité à produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles semblables à celle d’un être humain inné protéines et leur fiabilité en tant que hôte cellules5,6.
La demande croît de livrer le produit plus rapidement et pour les plus grandes populations de patients avec une qualité constante. En plus des avantages économiques, le répertoire des maladies traitées par le mAbs est en augmentation, qui comprend maintenant des maladies auto-immunes, des complications après la transplantation, l’arthrite et les cancers7. Rendements moyens pour lignes de production de mAb commerciaux modernes sont typiquement de l’ordre de 5 à 6 g/L et continuent d’augmenter de5. En partie, cela a été accompli grâce à l’ingénierie cellulaire CHO et dépistage de ligne de production améliorée à l’aide de bioréacteurs à haut-débit8. Cependant, la plupart des augmentations dans la production de protéines ont été attribuées pour traiter des améliorations, y compris les avancements dans l’optimisation des médias, des conditions de culture cellulaire et amélioré l’alimentation stratégies7,9,10. Supplémentation en nutriments est indispensable non seulement pour la croissance cellulaire appropriée mais aussi pour une production efficace de protéines de haute qualité. En outre, les cellules nécessitent l’ajout stoechiométrique de nutriments spécifiques, nécessitant une compréhension supplémentaire destinés à l’alimentation stratégie optimisation6,11. Méthodes d’optimisation classiques comprennent les supports individuels composant titrage et médias de mélange avec des dessins de mélange. Cependant, ces méthodes sont gourmands en temps, labor et impliquent des risques associés à l’erreur humaine12,13.
Études d’optimisation médias invoqué précédemment flacons agitateurs et bioréacteurs L 1-2 qui peuvent être prohibitifs en termes de matières premières et du capital humain. Plaques de microtitration ont également été utilisés, mais ces méthodes offrent évolutivité limitée. En outre, il faudra encore plusieurs parcours fastidieux qui introduisent des lot de variabilité qui obscurcit la variabilité de l’AQC causée par la composition de médias et alimentation stratégie14,15,16. Ainsi, le besoin de haut débit et très cohérent de bioréacteur parallèle systèmes émergés17,18,19,20.
Avec les dépenses importantes liées à l’exploitation de bioréacteurs de laboratoire traditionnel (0.5-5 L), microbioreactors offrent une alternative de la réduction des coûts pour évaluer la production de biologiquement dérivés de médicaments. 21 laboratoire agité-réservoir bioréacteurs sont fiables et fournissent des données par l’intermédiaire de tableaux sensoriels denses. Systèmes de contrôle de rétroaction permettent pour un contrôle facile de fonctionnement. Cependant, montage, étalonnage, nettoyage, coûts salariaux, substrat, les frais stérilisation exigences font laboratoire agité-réservoir bioréacteurs coûteux et forte intensité de travail à exploiter. Flacons agitateurs et plaques de microtitration enlever une partie du coût et du travail des problèmes liés aux bioréacteurs à plus grandes échelle, mais ces solutions de rechange offrent un faible contrôle sur des conditions de transformation et de produisent des données de faible densité, souvent seulement des mesures de point final. 22
Alternativement, les microbioreactors utilisent un petit volume de travail pour offrir une approche d’échelle réduite de lignée cellulaire et le développement de processus en amont. L’échelle d’expériences MICROBIOREACTEUR peut diminuer considérablement le coût de fonctionnement grâce à une utilisation plus faible de puissance, substrat, labor, espace et utilitaires. 23 Microbioreactors sont comme des flacons agitateurs car ils sont faciles à manipuler en raison de leur taille, mais ils conservent les avantages de bioréacteurs de laboratoire traditionnel par le biais de leur commande de rétroaction en ligne du pH, température, dissous l’oxygène et l’acide/base consommation ainsi que leur sortie de données en temps réel des paramètres de qualité, y compris au large de la composition du gaz. MICROBIOREACTEUR échelle permet la capacité de criblage à haut débit, qui peut être utile pour le développement de processus de sélection et clone. 24
Le bioréacteur de Microscale avancé s’est avéré être un outil efficace pour la caractérisation de processus CHO cell culture et développement,18. Ici, un système automatisé ambr15, composé de 48 microbioreactors en parallèle, qui se sont révélées être comparable au classique agité réacteurs de réservoir dans l’échelle des études,25 a été utilisé d’une façon analogue à des travaux antérieurs qui ont optimisé les médias composition pour une lignée de cellules de CHO-DG44 produisant un modèle chimérique IgG16. Les effets de différentes conditions du milieu sur la croissance et de titre ont été comparés et analysés. Dans le présent document présente de manière générale pour exécuter le système MICROBIOREACTEUR et l’analyse d’échantillons de supports bruts.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2804</td>
			<td>automated micro bioreactor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2B80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vi-Cell XR cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EX-CELL&#160;Antifoam (gamma irradiated)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59920C-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL glass Spinner Flasks</td>
			<td>Corning Life Sciences Glass</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile)</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>376814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioProfile FLEX Analyzer</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>49418</td>
			<td>Nutrient Analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Octet Red 96</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>99-0042</td>
			<td>Protein A Biosensor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>18-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells

Bioréacteurs à micro-échelle automatisé (15 mL) peuvent être un outil utile pour les ingénieurs en culture cellulaire. Ils facilitent l’exécution simultanée d’une grande variété de conditions expérimentales tout en minimisant la variabilité potentielle de processus. Les applications de cette approche incluent : clone de blindage, changements de température et le pH, optimisation médias et supplément. En outre, les volumes de petit réacteur sont propices aux grands plans d’expériences qui examinent une vaste gamme de conditions. Cela permet des phénomènes en amont d’optimiser considérablement avant l’intensification où expérimentation est de portée plus limitée faute de temps et de contraintes économiques. Systèmes de bioréacteur de microscale automatisé offrent divers avantages par rapport aux traditionnels à petite échelle unités d’élevage de cellule, tels que flacons agitateurs ou flacons de spinner. Cependant, au cours de l’échelle pilote processus développement significatif il faut pour s’assurer que ces avantages sont réalisés. Lorsque exécuté avec soin, le système peut permettent l’automatisation de niveau élevée, peut être programmé pour exécuter de la Biche avec un plus grand nombre de variables et peut réduire le temps d’échantillonnage lorsqu’elle est intégrée avec un analyseur de nutriments ou compteur de cellules. Intégration de l’heuristique expert dérivés présentés ici, avec des expériences de bioréacteur à micro-échelle automatisé actuel peut réduire au minimum les pièges communs qui nuisent à des résultats significatifs. À l’extrême, ne pas respecter les principes énoncés ici peut entraîner des dommages matériels qui nécessite des réparations coûteuses. En outre, les systèmes de MICROBIOREACTEUR ont des volumes de petite culture complique la caractérisation des conditions de culture cellulaire. Le nombre et la quantité d’échantillons prélevés en cours dans la culture de mode traitement par lots est limité comme volumes d’exploitation ne peut pas tomber au-dessous de 10 mL. Cette méthode discutera les avantages et les inconvénients des systèmes de bioréacteur de microscale.

Surveillance des paramètres critiques du procédé et autres paramètres de culture de cellules tout au long de l’opération des cultures cellulaires est un aspect important dans la biotransformation. Le compteur de cellules et l’analyseur en éléments nutritifs ont été utilisés pour quantifier les cinq attributs qui caractérisent la croissance cellulaire, consommation d’éléments nutritifs et la formation de sous-produits. Le nombre de cellules ont été obtenu par jour pour toutes les conditions de culture. La densité moyenne des cellules viables et les viabilités sont à considérer dans la Figure 3 avec leur intervalle de ± 1 SD. Les profils des éléments nutritifs et de sous-produit figurent également avec l’intervalle de SD de ±1 à travers la phase stationnaire des cultures. La pente de ce profil représente les taux de glucose et la consommation de glutamine et la production de lactate, moyens. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent la faisabilité de la surveillance de ces attributs dans le système de MICROBIOREACTEUR ; ainsi que la capacité du système MICROBIOREACTEUR pour maintenir ces paramètres dans une fourchette étroite.
La productivité totale des cultures cellulaires a été quantifiée en utilisant un système de biocapteur de proteinA après que les milieux de culture de cellules récoltées était passé à travers un filtre PVDF 0,22 micron. La productivité spécifique par cellule varie de 0,87 pg/cellule-d à 1,15 pg/cellule-d comme on le voit à la Figure 4. Basé sur ces résultats, un large éventail de troubles peut être étudié pour choisir la composition de médias et alimentation des stratégies qui maximisent la quantité de protéines produites pour un investissement minimal dans les procédures expérimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> Figure 1 : Mise en page du système avec 4 stations de culture (CS) ayant chacun 12 cuves de réacteur MICROBIOREACTEUR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> Figure 2 : Montage de plaque d’échantillon exemple pour un dosage de base avec l’expérience de régénération sur le système de biocapteur proteinA. ligne 1 (rouge « R ») est réservé pour l’échantillon de référence (c'est-à-dire la matrice en l’absence d’analyte) ; rang 2 (aquamarine) est un ensemble de normes (les concentrations sont en µg/mL) ; lignes 3 et 4 (orange) sont des ensembles de hautes et basses des contrôles positifs (« PL » et « PH », respectivement) ; lignes 5 à 10 (violet) contiennent des échantillons inconnus ; lignes 11 et 12 (gris) sont des positions de programme par défaut pour la régénération (« R ») et les tampons de neutralisation (« N »). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> Figure 3 : un) profils de densité et de la viabilité de cellules viables en moyenne âgés de plus d’un lot. ± 1 écart-type est également indiqué pour indiquer le contrôle étroit de la croissance cellulaire dans les systèmes MICROBIOREACTEUR. b) moyen profil nutritionnel pour le glucose et glutamine ainsi que le profil de sous-produit moyenne pour le lactate. ± 1 écart-type est également indiqué pour indiquer le contrôle serré de composition de médias dans les systèmes MICROBIOREACTEUR. (N = 3, toutes les conditions ont été exécutées en trois exemplaires). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> Figure 4 : Représentatif-boîte à moustaches de productivité spécifique moyenne des diverses conditions médias. (N = 3, toutes les conditions ont été exécutées en trois exemplaires) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Un protocole détaillé pour l’opération concurrente 48 parallèle des cultures de cellules dans des conditions variées dans un système de MICROBIOREACTEUR est présenté. Processus de culture cellulaire, la récolte et l’analyse subséquente anticorps titre sont décrites.

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions importantes dans le domaine de la fabrication de procédés bio concernant les aspects de la caractérisation des lignées cellulaires et la médiation et l’optimisation des processus. Les avantages de cette technique sont qu’elle offre un meilleur contrôle dans les flacons de secousse et permet l’automatisation et la performance d’un grand nombre d’études à petite échelle pour la génération rapide de données. Sai Rashmika Velugula et Casey Kohnhorst, chercheurs dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Commencez par immerser un stock vile de trois fois 10 à la septième montrent des cellules par millilitre de milieu de congélation dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Lorsqu’il ne reste qu’un petit morceau de glace, pipet doucement la suspension cellulaire rapidement décongelée à quelques reprises et transférer un millilitre de cellules dans un flacon stérile de secousse ventilée de 125 millilitres contenant 29 millilitres de milieu OptiCHO. Placez le flacon dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 8 % de CO2 en le secouant à 130 RPM.Subcultation des cellules après 72 heures dans 100 millilitres de milieu frais de 37 degrés Celsius dans un flacon d’essoreuse de 125 millilitres pour une autre incubation de 72 heures à 37 degrés Celsius et 8% de CO2 avec agitation à 70 RPM. Le troisième jour de sous-culture, ajouter un milieu frais préchauffé au flacon de filature pour maintenir les cellules à une viabilité d’au moins 90 % pendant les 24 dernières heures de culture. Le lendemain matin, cliquez sur l’icône de bureau distante et cliquez sur connectez-vous.Lorsque le bureau distant est connecté, ouvrez le logiciel de compteur cellulaire et installez un nouveau Reagent Pak. Ensuite, videz les déchets Trypan Blue et amorcez le système. Ensuite, réduisez au minimum la connexion à distance et ouvrez le logiciel de micro réacteur bio en utilisant une expérience existante comme modèle pour créer une nouvelle expérience.Avant de commencer une course, définissez les plaques utilisées pendant la course dans la section imiter du logiciel et placez 12 récipients de culture stériles dans chaque station culturelle. Placez les plaques de pince autoclavées sur les récipients et placez les plaques de remue-pièce sur les plaques de pince en s’assurant que chaque broche est solidement insérée. Ensuite, fixez les plaques de pince avec les vis et les nobs fournis.Pour démarrer le système, numérisez le code à barres fourni avec chaque récipient de culture. Le système initialisera et vérifiera la présence des navires appropriés. Réglez le contrôle de la température à 37 degrés Celsius et l’agitation à 1000 RPM et allumez le moniteur PH d’oxygène dissous.Ensuite, exécutez le programme de charge moyenne. Lorsque tout le milieu aura été chargé, 35 microlitres d’antifoam EX-CELL seront ajoutés de la plaque d’antifoam aux récipients de culture. Après 30 minutes commencer à enregistrer l’oxygène dissous et PH dans le milieu de la culture, permettant à l’oxygène dissous d’atteindre un point fixe de 50%Après l’équilibrage de l’oxygène dissous, allumez les ajouts de base de fond pour atteindre un point de terminaison PH de 7,1 pour tous les vaisseaux de culture.Le lendemain matin, exécutez l’étape ph en pause et transférez tout le contenu du flacon de filature dans un tube conique stérile de 250 millilitres pour centrifugation. Resuspendez la pastille dans un milieu suffisamment frais pour que la densité finale soit une fois de 10 à la sixième cellule CHO par millilitre après avoir ajouté l’inoculum aux vaisseaux de culture et ajoutez les cellules suspendues dans les puits appropriés d’une plaque de puits lidded stérile de 24 puits. Ajouter trois millilitres d’inoculum à chaque puits et placer la plaque d’inoculum sur le bureau désigné à l’intérieur du capot.Ensuite, laissez les navires de culture s’équilibrer pendant au moins une heure et lancez l’étape du nombre de cinq EX-CELL dans le programme. Pour l’analyse quotidienne des éléments nutritifs et des métabolites le deuxième jour, placez les plaques de support de tube d’échantillon sur leurs plate-formes désignées et chargez les tubes ouverts de microcentrifugeuse dans les supports appropriés. Ensuite, placez les échantillons dans le plateau de l’analyseur, pour effectuer l’analyse des nutriments.Pour terminer la course, éteignez d’abord le contrôle de température suivi de l’agitation. Arrêtez le contrôle ph d’oxygène dissous et les ajouts de base d’arrière-plan, tous les autres contrôles, et le moniteur du système. Dévissez la pince et remuer les plaques, retirez les récipients de culture et vissez les plaques de séchage dans la station de culture.Ensuite, exécutez le cycle de séchage de deux heures sur le programme; en cliquant sur l’arrêt dans le logiciel bioréacteur une fois le cycle de séchage terminé. Pour récolter les cellules transférer le fluide de culture cellulaire des récipients du réacteur dans les tubes coniques correspondants pour centrifugation et filtrer les supernatants à travers stériles 0,22 micromètre filtres PVDH. Ensuite, transférez un millilitre de chaque supernatant de culture cellulaire stérile dans des tubes de microcentrifugeuses individuels de 1,5 millilitre pour un stockage négatif de 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse du litre.Pour mesurer les titres IgG des échantillons, allumez d’abord le système de biocapteur d’aide protéique. Une fois que la lampe s’est réchauffée pendant au moins une heure, laissez les échantillons s’équilibrer à température ambiante et présoakez une pointe d’aide protéique par échantillon dans le milieu des cellules fraîches pendant au moins 30 minutes. Ensuite, réglez la température de la plaque à 26 degrés Celsius.Chargez les échantillons dans le système, et exécutez l’analyse à l’aide de l’analyse de sensibilité élevée par défaut avec régénération dans le logiciel d’acquisition de données. À l’aide du compteur cellulaire intégré, les densités et viabilités cellulaires viables moyennes peuvent être obtenues quotidiennement pour toutes les conditions de culture. À l’aide de l’analyseur des éléments nutritifs, nous pouvons également obtenir les profils des éléments nutritifs et des sous-produits démontrant la faisabilité de la surveillance de ces attributs dans le système des réacteurs microbio.En outre, la productivité totale des cultures cellulaires dans les diverses conditions de culture d’intérêt peut être quantifiée à l’aide du système de biocapteur d’aide protéique tel que démontré. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le protocole ne fonctionne que si la programmation est effectuée correctement; Suivant cette procédure, d’autres méthodes comme : chromatographie liquide, spectrométrie de masse et diffusion de la lumière multi-angles peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions concernant les propriétés physiques et chimiques du produit fabriqué.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays polymères pour la découverte à haut débit des biomatériaux

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

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Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR

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Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purification et analyse d'un anticorps monoclonal à partir de cellules ovaires de hamster chinois à l'aide d'un système automatisé de microbioréacteur

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