Name: use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare Scott Lute per il supporto analitico che ci hanno fornito. Finanziamento parziale interna e supporto per questo lavoro è stato fornito dal programma di percorso critico di CDER (CA #1-13). Questo progetto è stato sostenuto in parte da un appuntamento per il programma di partecipazione stage/ricerca presso l'ufficio di prodotti biotecnologici, U.S. Food and Drug Administration, amministrato dall'Istituto Oak Ridge per scienza e formazione attraverso un Interagency accordo tra l'US Department of Energy e FDA.

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Disclaimer: Questa pubblicazione riflette le opinioni dell'autore e non dovrebbe essere interpretata in modo rappresentano opinioni politiche o FDA.

Funzionamento del sistema automatizzato bioreattore micro correttamente e in modo efficiente comporta la tempestiva esecuzione di più passaggi automatizzati. Una delle parti più importanti del funzionamento del sistema è il software di programmazione. Se ci è qualunque errore durante la scrittura del programma, ci saranno gravi errori nell'esperimento che può provocare modifiche impreviste nel processo, strategia, strategia di campionamento o qualità del prodotto finale che può invalidare i risultati dello studio di alimentazione. Un altro aspetto importante del funzionamento del sistema è a posto e stringere la piastra di bloccaggio correttamente per garantire un controllo adeguato. L'indicazione più comune che la piastra di bloccaggio sia stretto in modo non uniforme è inaspettate variazioni nelle misurazioni per navi 1, 6, 7 e 12 (vasi reattore di angolo). Nel complesso instabilità indica un allentamento delle guarnizioni presso le linee di ingresso del gas delle placche delle pinze. Questo scenario può ostacolare raggiungendo il punto di set. Un'altra trappola comune da evitare quando iniziare un esperimento è lasciare che le cellule sedersi troppo a lungo durante il passaggio di inoculazione, causando loro di stabilirsi. Minore è il tempo che trascorrere le cellule seduta, meno possibilità c'è che i conteggi delle cellule di inoculo progressivamente inferiori vengono aggiunti cronologicamente ai vasi reattore che possono indurre significativi pregiudizi che involontariamente danneggia i risultati dello studio. È meglio inoculare in più fasi, cioè inoculare ciascuna stazione di cultura uno dopo l'altro con passaggi di pausa in mezzo così le cellule non sono seduto nella piastra di inoculazione per più di 15 minuti.
Per quanto riguarda uso giorno per giorno, mantenendo la sterilità è vitale. Sebbene il sistema sia in una cappa di sicurezza biologica, la sterilità non è garantita a causa di frequenti spostamenti dentro e fuori la cappa. Di conseguenza, tutto ciò che va nella cappa devono essere irrorati con 70% IPA. In secondo luogo, è essenziale garantire che minima schiuma si verifica durante la cultura; media può intasare il fornire di gas e scarico linee, che conducono ai danni della piastra di bloccaggio e anche i componenti di base qui sotto. Preventiva anti-schiuma aggiunta punti sono fondamentali per qualsiasi programma di progettazione di micro bioreattore. In caso di una "schiuma fuori" sarebbe benefico per seguire i produttori protocollo di pulizia e può prevenire danni permanenti delle placche delle pinze. In alternativa, uso dei vasi non sparged può essere utile per la bassa densità delle cellule o durante l'esecuzione in modalità batch in quanto consente maggiore superficie in rapporto al volume ossigeno efficiente anche con la mancanza di un sparger. Tuttavia, non sparged navi potrebbero non essere utile per colture ad alta densità o aspersione come spazio di testa non è sufficiente per tenere il passo con il crescente consumo di ossigeno di culture.
Ci sono numerosi vantaggi forniti dal sistema microbioreactor, in quanto consente molteplici culture controllate da eseguire in parallelo su una piccola scala con maggiore controllo che agitare boccette. 17 pertanto, il sistema facilita l'esecuzione di studi, fa, elevato throughput clone studi e studi di transfezione di screening. Processatore automatico riduce anche analista-analista variabilità riducendo contemporaneamente al lavoro noioso e richiede molto tempo per personale addestrato. Mentre ci sono diversi vantaggi per il sistema, ci sono parecchi svantaggi chiavi che dovrebbero essere considerati. In primo luogo, un volume di cultura di 15 mL limita significativamente in-processo di campionamento e materiale di raccolta finale e più alternativi su piccola scala bioreattori (fino a 500 mL) recentemente sono diventato disponibili. Un recente progresso al sistema è l'integrazione del bioreattore Microscala automatizzato con l'analizzatore di BioProfile FLEX 2 da Nova Biomedical, che attenua il problema di processo-campionamento in riducendo il volume di campione per l'analisi degli elementi nutritivi e la densità delle cellule . Benefici possono includere una configurazione veloce e praticamente nessuna pulizia portando a risparmi operativi, tuttavia il costo delle unità monouso dovrebbe essere considerato per progetti a lungo termine, come può essere più costoso di acquistare le unità rispetto ai sistemi convenzionali riutilizzabili.
Il metodo illustrato in questo documento è principalmente adatto per colture cellulari di batch modalità, ma può essere modificato a seconda delle esigenze dell'utente. Ogni stazione di cultura ha controllo indipendente della temperatura, mentre DO e pH può essere variate a livello dei vasi reattore individuali. Sartorius offre anche DoE software progettato specificamente per consentire esperimenti di pianificazione per essere su misura per il sistema di micro bioreattore. Studi di DoE su larga scala utilizzando il nuovo software DoE fornito dal produttore possono aiutare nei media e supplemento di ottimizzazione. Anche se non usato qui, il sistema microbioreactor permette inoltre studi di fed-batch. Il sistema non è stato ancora ottimizzato per colture cellulari di aspersione. Tuttavia, ci sono stati studi limitati e prove di imitare operazione cultura delle celle aspersione nell'attuale sistema micro bioreattore. 26 questo metodo può essere modificato per imitare culture perfusione ad alta densità di sedimentazione delle cellule. Variando l'altezza a cui la pipetta viene inserita nel reattore e ottimizzando il tempo di assestamento, i media può essere rimosso e riforniti per modalità di profusione di specchio della cultura. Ci sono nuovi prodotti in questo settore in via di sviluppo che potrebbe funzionare meglio il sistema presentato qui se non si desidera modalità di perfusione della cultura.
In sintesi, questo studio dimostra l'uso di micro-bioreattori automatizzati e associati analitico per le operazioni di cultura delle cellule CHO per produrre e caratterizzare un anticorpo monoclonale IgG1 di modello. Essa sottolinea il ruolo di micro-bioreattori su piccola scala nella produzione di bioprocessi e loro impatto sullo sviluppo di cultura delle cellule e proiezione multimediale. Mentre ci sono molti vantaggi di utilizzare un sistema automatizzato su piccola scala, per realizzare pienamente i loro benefici processo comprensione e caratterizzazione analitica è imperativo. Questo studio fornisce all'utente con una linea guida per l'utilizzo di un sistema di reattore automatizzato su microscala, che possa essere sviluppato e migliorato per le esigenze di ricerca individuale.

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono stati prodotti in cellule di ibridoma topo nel 19751. Da allora, un aumento nello sviluppo della produzione di proteine ricombinanti ha avuto luogo a umanizzare mAbs a aumentano in vivo la sicurezza e l'efficacia2,3,4. La maggior parte dei processi di produzione di proteina ricombinante utilizza cellule di ovaio di criceto cinese (CHO) per la facilità con cui possono essere adattati per media liberi di siero, loro capacità di produrre proteine con modificazioni post-traduzionali simile a quella di un essere umano innato proteine e la loro affidabilità come host cellule5,6.
Domanda è in crescita di consegnare il prodotto più velocemente e per più grandi popolazioni di pazienti con qualità costante. Oltre ai vantaggi economici, è in aumento il repertorio delle malattie trattate da mAbs, che ora include le malattie autoimmuni, le complicazioni post-trapianto, artrite e tumori7. Rendimenti medi per linee di produzione di mAb commerciale moderno sono tipicamente nella gamma di 5-6 g/L e continuano ad aumentare di5. In parte, questo è stato compiuto attraverso ingegneria cellulare CHO e l'esame di una migliore linea di produzione utilizzando bioreattori di alto-rendimento8. Tuttavia, la maggior parte aumenti nella produzione di proteine sono stati attribuiti per elaborare miglioramenti, tra cui gli avanzamenti in ottimizzazione dei media, le condizioni di coltura delle cellule e migliorata alimentazione strategie7,9,10. Il completamento nutriente è essenziale non solo per una crescita adeguata delle cellule ma anche per la produzione efficiente di proteine di alta qualità. Inoltre, le cellule richiedono l'aggiunta stechiometrico di nutrienti specifici, che richiedono ulteriore comprensione per l'alimentazione di strategia ottimizzazione6,11. Metodi di ottimizzazione tradizionali includono singoli supporti componente titolazione e media la fusione con disegni di miscela. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo, labor intensive e comportano rischi associati all'errore umano12,13.
Gli studi di ottimizzazione media invocata in precedenza shake boccette e bioreattori di 1-2 L che possono essere proibitivi in termini di materie prime e capitale umano. Piastre microtiter inoltre sono stati usati, ma questi metodi forniscono scalabilità limitata. Inoltre, questo potrebbe richiedere ancora più esecuzioni che richiede tempo che introducono variabilità lotto che oscura la variabilità CQA causata da composizione media e alimentazione strategia14,15,16. Pertanto, la necessità di alto-rendimento e altamente coerente bioreattore parallelo sistemi emerse17,18,19,20.
Con i pesanti costi associati all'operazione di bioreattori bilancia da banco tradizionale (0,5-5 L), microbioreactors offrono un'alternativa di riduzione dei costi per valutare la produzione di biologicamente derivati farmaci. 21 -bilancia da banco agitata-serbatoio bioreattori sono affidabili e forniscono i dati densi tramite matrici sensoriali. Sistemi di controllo di feedback consentono facile supervisione dell'operazione. Tuttavia, il montaggio, calibrazione, pulizia, costi di manodopera, costi di substrato e requisiti di sterilizzazione fare scala agitata-serbatoio bioreattori costosi e laborioso da operare. Boccette di agitare e piastre di microtitolazione rimuovere alcuno del costo e lavoro problemi associati con bioreattori di scala più grande, ma queste alternative forniscono il controllo debole condizioni di lavorazione e producono dati di densità bassa, spesso solo misure di punto finale. 22
In alternativa, microbioreactors utilizzare un piccolo volume di lavoro per fornire un approccio scalare alla linea cellulare e a Monte del processo di sviluppo. La scala di microbioreactor esperimenti può ridurre notevolmente il costo di esercizio attraverso un utilizzo inferiore di potenza, substrato, labor, spazio e utilità. 23 Microbioreactors sono come shake boccette in quanto sono facili da gestire a causa delle loro dimensioni, ma mantengono i vantaggi di bioreattori bilancia da banco tradizionale attraverso il loro controllo di feedback on-line di pH, temperatura, dissolto ossigeno e acido/base consumo, nonché la loro uscita di dati in tempo reale dei parametri di qualità compreso fuori composizione del gas. Microbioreactor scala permette capacità di screening ad alta resa, che può essere utile per lo sviluppo di processo di selezione e di clone. 24
Il bioreattore Microscale avanzata ha dimostrato di essere uno strumento efficace per la caratterizzazione di processo CHO cella cultura e sviluppo18. Qui, un sistema automatizzato ambr15, composto da 48 microbioreactors in parallelo, che sono stati indicati per essere paragonabile alla classica mescolata reattori serbatoio in scala gli studi,25 è stato usato in maniera analoga al lavoro prima che ottimizzato i media composizione per una linea di cellule di CHO-DG44 producendo un modello chimerico IgG16. Gli effetti delle diverse condizioni di media sulla crescita e titolo erano rispetto ed analizzati. In questa carta è stata presentata una linea guida generale per eseguire il sistema di microbioreactor e analisi dei campioni dei supporti grezzi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2804</td>
			<td>automated micro bioreactor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2B80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vi-Cell XR cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EX-CELL&#160;Antifoam (gamma irradiated)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59920C-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL glass Spinner Flasks</td>
			<td>Corning Life Sciences Glass</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile)</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>376814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioProfile FLEX Analyzer</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>49418</td>
			<td>Nutrient Analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Octet Red 96</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>99-0042</td>
			<td>Protein A Biosensor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>18-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells

Automatizzata su microscala bioreattori (15 mL) possono essere uno strumento utile per gli ingegneri di cultura cellulare. Facilitano l'esecuzione simultanea di una vasta gamma di condizioni sperimentali, riducendo al minimo la potenziale variabilità del processo. Le applicazioni di questo approccio includono: clonare screening, cambiamenti di temperatura e pH, ottimizzazione media e supplemento. Inoltre, i volumi di piccolo reattore sono favorevoli al grande disegno di esperimenti che indagano una vasta gamma di condizioni. Questo consente di essere notevolmente ottimizzata prima di implementare la scalabilità verticale a Monte processi dove la sperimentazione è più limitato in ambito a causa del tempo e dei vincoli economici. Automatizzata su microscala bioreattore sistemi offrono vari vantaggi rispetto ai tradizionali su piccola scala unità di cultura cellulare, quali shake boccette o boccette di spinner. Tuttavia, durante su scala pilota processo sviluppo significativo deve prestare attenzione per assicurare che questi vantaggi siano realizzati. Quando eseguito con cura, il sistema può attivare automazione di livello elevato, può essere programmato per eseguire DOE con un numero maggiore di variabili e può ridurre il tempo di campionamento quando integrato con un analizzatore di nutrienti o contatore di cellule. Integrazione dell'euristica esperto-derivato ha presentato qui, con esperimenti di bioreattore corrente Microscala automatizzato può minimizzare trabocchetti comuni che ostacolano i risultati significativi. In casi estremi, il mancato rispetto dei principi stabiliti qui può portare a danni all'apparecchiatura che richiede costose riparazioni. Inoltre, i sistemi di microbioreactor hanno volumi di piccola coltura rendendo difficile la caratterizzazione delle condizioni di coltura delle cellule. Il numero e la quantità di campioni prelevati in-process nella cultura modalità batch è limitato come volumi operativi non possono cadere inferiore a 10 mL. Questo metodo discuterà i benefici e svantaggi dei sistemi di bioreattore su microscala.

Monitoraggio dei parametri di processo critici e altri parametri di cultura delle cellule durante il funzionamento di colture cellulari è un aspetto importante nel bioprocessing. Il contatore di cellule e analizzatore di nutrienti sono stati utilizzati per quantificare cinque attributi che caratterizzano la crescita delle cellule, consumo di nutrienti e formazione di sottoprodotto. I conteggi delle cellule sono stati ottenuti tutti i giorni per tutte le condizioni di coltura. La densità media delle cellule vitali e viabilità sono come si vede nella Figura 3 insieme al loro intervallo di ± 1 SD. I profili di sottoprodotto e nutrienti sono indicati anche con l'intervallo di ± 1 SD attraverso la fase stazionaria delle culture. La pendenza di questo profilo rappresenta i tassi di glucosio e glutammina consumi e produzione di lattato, medi. Nel complesso, questi risultati dimostrano la fattibilità di questi attributi di monitoraggio del sistema di microbioreactor; così come la capacità del sistema microbioreactor per mantenere questi parametri all'interno di una gamma stretta.
La produttività totale delle colture cellulari è stata quantificata utilizzando un sistema di biosensore proteinA dopo i terreni di coltura delle cellule raccolte è stato passato attraverso un filtro PVDF 0,22 micron. La produttività specifica per ogni cella ha variato da 0,87 pg/cellula-d a 1.15 pg/cellula-d come si vede nella Figura 4. Basato su questi risultati, una vasta gamma di condizioni possa essere studiata per selezionare composizione media e strategie che massimizzare la quantità di proteine alimentari prodotte per un investimento minimo in procedure sperimentali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> Figura 1 : Layout del sistema microbioreactor con 4 stazioni di cultura (CS) avendo 12 vasi reattore ogni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> Figura 2 : Esempio esempio piastra messa a punto per una quantificazione base con rigenerazione esperimento sul sistema proteinA biosensore. riga 1 (rosso "R") è riservata per il campione di riferimento (i.e . matrix assente analita); riga 2 (acquamarina) è un insieme di standard (le concentrazioni sono in µ g/mL); le righe 3 e 4 (arancione) sono insiemi di controlli positivi di alti e Bassi ("PL" e "PH", rispettivamente); righe da 5 a 10 (viola) contengono campioni incogniti; le righe 11 e 12 (grigio) sono posizioni di programma predefinito per la rigenerazione ("R") e buffer di neutralizzazione ("N"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> Figura 3 : un) media profili di densità e l'attuabilità delle cellule vitali sopra l'età di un batch. ± 1 SD è inoltre indicato per indicare il controllo stretto della crescita delle cellule nei sistemi microbioreactor. b) medio profilo nutrizionale per glucosio e Glutammina, nonché il profilo medio sottoprodotto di lattato. ± 1 SD è inoltre indicato per indicare il controllo stretto sopra composizione media nei sistemi microbioreactor. (N = 3, tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> Figura 4 : Rappresentanza casella-trama di produttività media specifiche delle varie condizioni media. (N = 3, tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Un protocollo dettagliato per il funzionamento simultaneo di 48 colture parallele sotto varie condizioni in un sistema di microbioreactor è presentato. Processo di coltura cellulare, raccolta e analisi di titolo dell'anticorpo successivi sono descritti.

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune delle importanti domande nel campo della produzione di processi Bio per quanto riguarda gli aspetti della caratterizzazione della linea cellulare e l'ottimizzazione mediata e di processo. I vantaggi di questa tecnica sono che fornisce un maggiore controllo nei contenitori di scuotimento e consente l'automazione e le prestazioni di un gran numero di studi su piccola scala per una rapida generazione di dati. A dimostrare la procedura saranno Sai Rashmika Velugula e Casey Kohnhorst, ricercatori del mio laboratorio.Inizia immergendo un vile stock di tre volte 10 al settimo mostrano cellule per millilitro di mezzo di congelamento in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quando rimane solo un piccolo flusso di ghiaccio, pipettare delicatamente la sospensione cellulare rapidamente scongelata alcune volte e trasferire un millilitro di cellule in un pallone sterile a tre scosse ventilato da 125 millilitri contenente 29 millilitri di mezzo OptiCHO. Posizionare il pallone in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e 8%CO2 scuotendolo a 130 giri/min.Subcultura delle cellule dopo 72 ore in 100 millilitri di mezzo fresco di 37 gradi Celsius in un pallone filatore da 125 millilitri per un'altra incubazione di 72 ore a 37 gradi Celsius e 8%CO2 con agitazione a 70 giri/min. Il terzo giorno di sottocultura, aggiungere un mezzo fresco preri riscaldato al pallone filatore per mantenere le cellule ad una vitalità di almeno il 90% per le ultime 24 ore di coltura. La mattina dopo, fare clic sull'icona del desktop remoto e fare clic su Connetti.Quando il desktop remoto è connesso, aprire il software del contatore delle celle e installare un nuovo Reagent Pak. Quindi, svuotare i rifiuti di Trypan Blue e innescare il sistema. Quindi, ridurre al minimo la connessione remota e aprire il software del microreaeree utilizzando un esperimento esistente come modello per creare un nuovo esperimento.Prima di iniziare una corsa, definire le piastre utilizzate durante la corsa nella sezione mimetica del software e posizionare 12 vasi di coltura sterili in ogni stazione di coltura. Posizionare le piastre di morsetto autoclavate sopra i recipienti e posizionare le piastre di agitazione sopra le piastre del morsetto assicurandosi che ogni perno sia inserito in modo sicuro. Quindi, fissare le piastre del morsetto con le viti e i nob forniti.Per avviare il sistema eseguire la scansione del codice a barre fornito con ogni nave di coltura. Il sistema inizializza e verifica la presenza delle navi appropriate. Impostare il controllo della temperatura su 37 gradi Celsius e l'agitazione a 1.000 giri/min e accendere il monitor PH ad ossigeno disciolto.Quindi, eseguire il programma di ricarica media. Una volta caricato tutto il mezzo, verranno aggiunti 35 microlitri di antischiam EX-CELL dalla piastra antischiostra ai vasi di coltura. Dopo 30 minuti iniziano a registrare l'ossigeno disciolto e il PH all'interno del mezzo di coltura, permettendo all'ossigeno disciolto di raggiungere un setpoint del 50%Dopo l'equilibrazione dell'ossigeno disciolto, accendere le aggiunte di base di fondo per raggiungere un setpoint PH di 7,1 per tutti i vasi di coltura.La mattina seguente, eseguire il passo PH sospeso e trasferire l'intero contenuto del pallone filatore in un tubo conico sterile da 250 millilitri per la centrifugazione. Resuspend il pellet in mezzo abbastanza fresco che la densità finale sarà uno per 10 alla sesta cellule CHO per millilitro dopo aver aggiunto l'inoculo ai vasi di coltura e aggiungere le cellule sospese nei pozzi appropriati di una piastra sterile lidded 24 pozzetto. Aggiungere tre millilitri di inoculo ad ogni pozzo e posizionare la piastra inoculo sulla scrivania designata all'interno del cofano.Quindi, lasciare che i vasi di coltura equilibrano per almeno un'ora e avviare il passaggio di conteggio EX-CELL cinque nel programma. Per l'analisi giornaliera dei nutrienti e dei metaboliti il secondo giorno, posizionare le piastre portatubi campione sui ponti designati e caricare tubi di microcentrifugo aperti nei supporti appropriati. Quindi, posizionare i campioni nel vassoio dell'analizzatore, per eseguire l'analisi dei nutrienti.Per terminare l'esecuzione spegnere prima il controllo della temperatura seguito dall'agitazione. Interrompere il controllo PH dell'ossigeno disciolto e le aggiunte alla base di fondo, tutti gli altri controlli e il monitor di sistema. Svitare il morsetto e mescolare le piastre, rimuovere i vasi di coltura e avvitare le piastre di essiccazione nella stazione di coltura.Quindi, eseguire il ciclo di asciugatura di due ore sul programma;fare clic su interrompi nel software bioreattore una volta terminato il ciclo di asciugatura. Per raccogliere le celle trasferire il fluido di coltura cellulare dai recipienti del reattore in corrispondenti tubi conici per la centrifugazione e filtrare i supernanti attraverso filtri PVDH sterili da 0,22 micrometri. Quindi, trasferire un millilitro di ogni supernatante di coltura cellulare sterile in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per una conservazione negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi del titolo.Per misurare i formicolii IgG dei campioni, accendere prima il sistema biosensore di aiuto proteico. Dopo che la lampada si è riscaldata per almeno un'ora, lasciare che i campioni equilibrano a temperatura ambiente e prendereak una punta di aiuto proteico per campione in mezzo cellulare fresco per almeno 30 minuti. Quindi, impostare la temperatura della piastra a 26 gradi Celsius.Caricare i campioni nel sistema ed eseguire il test utilizzando il saggio di default ad alta sensibilità con rigenerazione nel software di acquisizione dati. Utilizzando il contatore cellulare integrato, le densità cellulari medie vitali e le viabilità possono essere ottenute giornalmente per tutte le condizioni di coltura. Utilizzando l'analizzatore di nutrienti possiamo anche ottenere i profili nutrizionali e sottoprodotti che dimostrano la fattibilità del monitoraggio di questi attributi nel sistema del reattore microbio.Inoltre, la produttività totale delle colture cellulari nelle varie condizioni di coltura di interesse può essere quantificata utilizzando il sistema biosensore di aiuto proteico come dimostrato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il protocollo funziona solo se la programmazione viene eseguita correttamente;garantendo l'esecuzione tempestiva dei passaggi del protocollo con errori minimi. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come:cromatografia liquida, spettrometria di massa e dispersione della luce multiangolo per rispondere a ulteriori domande riguardanti le proprietà fisiche e chimiche del prodotto prodotto.

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